CN108570421A - 一株植物乳杆菌菌株及其青贮饲料发酵剂 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其保藏号为CGMCC No.12849。该菌株为同型发酵乳酸菌，能够生成大量乳酸，迅速降低pH，耐酸，对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、沙门菌、大肠杆菌和酵母菌均具有较强的抑菌活性，并且对黄曲霉毒素AFB1具有高效吸附作用，与其他菌株相比具有明显的优势。利用此菌株作为青贮饲料发酵剂可以显著提高青贮饲料的发酵品质，并且青贮开封后对饲料中黄曲霉毒素AFB1的产生存在抑制作用，可作为青贮饲料发酵剂应用于畜禽养殖中，应用前景广阔。

Description

一株植物乳杆菌菌株及其青贮饲料发酵剂

技术领域

本发明属于微生物益生菌应用技术领域，涉及一株植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)及青贮饲料发酵剂。

背景技术

青贮是一个复杂的微生物发酵过程，有乳酸菌、好氧细菌、酵母菌、霉菌等多种微生物参与，其中乳酸菌被认为是青贮发酵的关键微生物。青贮饲料品质的好坏与它所含乳酸菌的种类、数量以及活性有很大的关系，但植物表面附着的乳酸菌数量往往较少，为调制高品质的青贮饲料，最可行有效的方法是添加优质乳酸菌，增加青贮饲料原料中初始乳酸菌数量，使之尽早进入乳酸发酵阶段，乳酸浓度增加，迅速降低pH，抑制有害微生物的生长，改善青贮饲料发酵品质。

而青贮的发酵品质不仅仅与乳酸菌的种类数量有关，与青贮技术、原料、青贮条件等都有着重要的关系。当青贮在制作、贮存或开窖取用处理不当的话，霉菌的侵袭和霉菌毒素的污染就极可能发生。特别是在青贮饲料开启后，由于氧气的进入，原来被抑制的霉菌等好氧微生物被激活，致使青贮霉变的发生，许多情形下，饲料尚未发生肉眼可觉察的霉变，却已不同程度的霉菌毒素积聚，因此，霉菌毒素的粘附及降解已成为青贮应用的研究热点之一。

乳酸菌是青贮发酵的主要微生物，有研究表明其在粘附、降解黄曲霉毒素方面发挥着重要作用，因此开发一种乳酸菌青贮饲料发酵剂，在提高青贮饲料发酵品质的同时，有效吸附霉菌毒素，成为青贮添加剂菌种筛选及研发亟待解决的问题。

发明内容

为了解决上述问题，本发明提供一株优良特性的植物乳杆菌及其在青贮饲料发酵剂。

本发明提供了一株植物乳杆菌，该菌株从内蒙古发酵成熟的青贮饲料中分离并经过初筛复筛得到，在MRS培养基上的菌落形态为菌落淡白色，圆形，湿润，液滴状，凸起，表面光滑，有光泽，边缘整齐，不透明。菌体杆状，单个或呈短链排列存在，革兰氏染色阳性菌株，无芽孢。初步鉴定为植物乳杆菌。

利用细菌通用引物对筛选出的菌株进行16s rDNA PCR扩增后鉴定，经NCBI序列比对结果相似性最高(100％)的是植物乳杆菌，故分子鉴定DBNZW02为植物乳杆菌。

将该菌株命名为植物乳杆菌DBNZW02(lactobacillus plantarum DBNZW02)，于2016年8月15日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，简称CGMCC，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为：CGMCCNo.12849。

本发明还提供包含该植物乳杆菌的青贮饲料发酵剂。

在本发明一个实施方案中，所述青贮饲料发酵剂为菌粉，所述菌粉还含有冻干保护剂。

其中，所述的冻干保护剂含有20％的脱脂奶粉、5％的蔗糖、1％的维生素C和1％的谷氨酸钠。

其中，所述布氏乳杆菌的含量为1×10⁶CFU/g。

本发明还提供所述青贮饲料发酵剂的制备方法如下：将所述植物乳杆菌进行发酵培养得到发酵液，所得菌液经离心得到菌体后，按菌体：冻干保护剂溶液＝1:10(质量比)加入冻干保护剂溶液，充分混匀，将上述混匀后的菌液置于冷冻干燥机中进行冻干得到青贮饲料发酵剂。

本发明还提供所述植物乳杆菌菌株的发酵方法，其包括如下步骤：按体积比为1％-5％的接种量向发酵培养基中接入培养16-22h的所述植物乳杆菌的种子液，发酵过程中控制pH7.0-7.5，发酵温度35-40℃，转速200-300rpm，通气比1:0.4，罐压0.05MPa。

其中，所述的发酵培养基含有下述重量百分比的组分：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％g，吐温80 0.1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％。

本发明还提供了含有所述的植物乳杆菌的菌粉。

本发明还提供一种青贮发酵方法，将青贮原料切碎至1-2cm,按15g～20g菌粉/吨青贮原料的比例，将所述的植物乳杆菌菌粉用自来水进行溶解稀释，均匀的喷洒在原料上，以保证每克原料上达到10⁶cfu的乳酸菌，发酵时间至少30天。

本发明的植物乳杆菌菌株为同型发酵乳酸菌，能够生成大量乳酸，迅速降低pH，耐酸，对金黄色葡萄球菌、蜡样芽孢杆菌、沙门菌、大肠杆菌和酵母菌均具有较强的抑菌活性，并且对黄曲霉毒素AFB1具有高效吸附作用，与其他菌株相比具有明显的优势。利用此菌株作为青贮饲料发酵剂可以显著提高青贮饲料的发酵品质，并且青贮开封后对饲料中黄曲霉毒素AFB1的产生存在抑制作用，可作为青贮饲料发酵剂应用于畜禽养殖中，应用前景广阔。

附图说明

图1所示为不同植物乳杆菌菌株对青贮开封后pH变化的影响。

具体实施方式

以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。

实施例1植物乳杆菌DBNZW02的筛选

1、初筛

采集新鲜苜蓿叶片、新鲜全株玉米以及发酵成熟的玉米青贮样品30份，分别称取10g样品，加入90mL无菌水制成菌悬液，于180r/min振荡30min，梯度稀释至合适梯度，涂布于MRS固体培养基，将平板置于厌氧培养箱37℃培养48h，获得86株乳酸菌。

MRS液体培养基的制作方法是：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，pH6.2～6.6，蒸馏水1000mL，高压蒸汽灭菌后备用。

MRS固体培养基的制作方法是：蛋白胨10.0g，牛肉膏10.0g，酵母膏5.0g，柠檬酸氢二铵2.0g，葡萄糖20.0g，吐温80 1.0mL，乙酸钠5.0g，磷酸氢二钾2.0g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，琼脂2％，pH6.2～6.6，蒸馏水1000mL，高压蒸汽灭菌后备用。

2、复筛

(1)产酸性能试验-1

将乳酸菌分离菌株按5％接种量接入MRS液体培养基，每组设3个重复，置于37℃恒温培养箱培养48h，每隔2h无菌取样测pH值，记录结果。菌株DBNZW02产酸较快，接种24h后pH下降至约4.0，48h后降至3.4，随后保持相对稳定。菌株DBNZW02显示了较好的产酸能力，具有良好的青贮潜力。

(2)产酸性能试验-2

测定乳酸菌分离菌株所产生的有机酸组成采用高效液相色谱同时定量法。

仪器：岛津10A高效液相色谱仪，岛津SPD-10A检测器。色谱条件：Shodex KC-811色谱柱(8mm×300mm)，3mM高氯酸为流动相，检测波长210nm，流速1mL/min，进样量5μL,柱温50℃。有机酸标准溶液的配制：分别准确称取乳酸、乙酸1.1765g、0.05050g，用超纯水定溶于25mL容量瓶中，配制乳酸、乙酸标准母液，再分别稀释为相应浓度的标准液，于4℃下冷藏备用。样品的制备：将乳酸菌菌株48h发酵液8000rpm离心10分钟后，用0.45nm滤膜过滤，浸提液待机分析。此菌株和实验室其他有效乳酸菌菌株及某些国内外产品分离菌株(国内是从宝来利来某产品分离得到的，命名BL-3，国外是从拉曼某产品分离得到的，命名为LM-2)的产酸能力比较如下表1所示：

表1：乳酸菌菌株产酸能力测定

通过表1，可见其与国内外部分产品及实验室所筛选出的乳酸菌菌株相比，菌株DBNZW02能够产生更多的乳酸，当其作为青贮饲料发酵剂作用于青贮时，青贮中生成大量乳酸，促进青贮饲料快速发酵；乳酸的大量形成，使青贮原料的pH值降低，一方面为乳酸菌本身生长繁殖创造有利条件，另一方面又促使在酸性环境中不能繁殖的其它微生物，如腐败酸菌、酪酸菌等死亡。当乳酸积累到一定程度，乳酸菌自身亦受到抑制而停止活动，此时青贮发酵完成，因此青贮料才不致腐烂，长期贮存。

(3)耐酸性测定

将乳酸菌分离菌株接种到不同pH的MRS培养基中，37℃静置培养4小时，稀释涂布平板法计数。将上述MRS液体培养基用0.1mol/L的盐酸分别调节pH值至2.5、3.0、3.5、4.0，以配置不同pH的MRS液体培养基。

在pH为2.5的MRS培养基中仍能够检测出存活的乳酸菌菌株DBNZW02，存活率约为21.7％。从上述结果可以看出菌株DBNZW02有较强的耐酸性。

(4)抑菌能力测定

指示菌：大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌、蜡样芽胞杆菌、酵母菌、青霉菌、根霉菌以及曲霉菌。大肠杆菌、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌接种于LB液体培养液中，37℃，180rpm，培养15h；酵母菌、霉菌接种于YPD液体培养基，30℃，180rpm，培养15h；用麦氏比浊法制成1×10¹⁰cfu/mL的菌悬液,用于本试验；

制备乳酸菌菌液：初筛分离得到的乳酸菌菌株，以5％接种量接种于MRS液体培养液中，37℃，静止培养48h，取发酵液8000rpm离心10min，上清液备用；

体外抑菌试验：采用牛津杯法，将指示菌液100μL均匀的涂布于直径为11cm的普通培养基平板表面，以无菌操作方法在平板表面放置牛津杯，再在杯中加入不同乳酸菌菌株的上清液，置37℃培养8h，测量抑菌圈大小并记录；

经体外抑菌试验，所有测试乳酸菌分离菌株上清液对霉菌均无抑制作用，其中菌株DBNZW02抑菌谱宽，对大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、沙门氏菌、蜡样芽胞杆菌、金黄色葡萄球菌、酵母菌的生长都有显著抑制，并且抑菌综合效果最好，此菌株和实验室其他有效乳酸菌菌株及某些国内外产品分离菌株(国内是从宝来利来某产品分离得到的，命名BL-3，国外是从拉曼某产品分离得到的，命名为LM-2)的抑菌能力比较如下表2所示：

表2：乳酸菌菌株抑菌能力测定

通过表2可知，可见其与国内外部分产品及实验室之前所筛选出的乳酸菌相比具有更加明显的抑菌作用，可以有效抑制常见病原菌以及青贮饲料中酵母菌的增殖。青贮饲料有氧暴露后，好氧细菌、酵母菌和霉菌数量逐渐增多，青贮发生有氧变质现象。植物乳杆菌DBNZW02对酵母菌及有害菌均具有较强的抑菌活性，在有氧环境下，通过抑菌物质抑制有害微生物的活动，减少了二次发酵，表明其在提高玉米青贮饲料有氧稳定性方面最具潜能。

(5)吸附AFB1能力测定

接种各乳酸菌到MRS液体培养基中培养24h，调整细胞数为1×10¹⁰cfu/ml。培养液8000r/min离心10min，将菌体沉淀用0.01mol/LPBS清洗，菌体沉淀再混悬于1.5ml的AFB1工作液中(5μg/ml)，37℃培养30min后8000r/min离心10min，取上清液采用HPLC检测AFB1浓度。每株乳酸菌均设置阴性对照和阳性对照，分别为添加菌体的PBS液，不含菌体的AFB1工作液。

AFB1吸附率(％)＝(1-样品AFB1峰面积/阳性对照AFB1峰面积)×100

表3：乳酸菌菌株AFB1吸附能力测定

菌株	AFB1吸附率(％)	菌株	AFB1吸附率(％)
				DBNZW02	57.82	FN-3	40.64
5FC-1	20.77	6FN-22	34.38
				7FN-2	6.45	BL-3	24.30
7FN-15	7.58	LM-2	30.12

由表3可知，8株乳酸菌对AFB1的吸附效果不同，菌株间差异较大。与国内外部分产品及实验室之前所筛选出的乳酸菌相比，菌株DBNZW02具有较好的吸附效果，吸附率达57.82％。由此可见，菌株不仅能够有效吸附AFB1，还能提高青贮的发酵品质，具有重要的研发意义。

(6)菌株鉴定

利用细菌通用引物对筛选出的菌株进行16s rDNA PCR扩增后鉴定。经NCBI序列比对，DBNZW02结果相似性最高(100％)的为植物乳杆菌，故分子鉴定DBNZW02为植物乳杆菌。

实施例2植物乳杆菌DBNZW02的发酵和菌粉的制备

植物乳杆菌DBNZW02的发酵：所用发酵培养基是按重量百分比：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％g，吐温80 0.1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％配制的。按体积比为3％的接种量向发酵培养基中接入培养18h的所述植物乳杆菌的种子液，发酵过程中控制pH7.2，发酵温度37℃，转速300rpm，通气比1:0.4，罐压0.05MPa。培养至18h为发酵终点，放罐，得到植物乳杆菌DBNZW02活菌数为6.2×10¹⁰CFU/mL。

所得发酵液经离心得到菌体后，按菌体：保护剂溶液＝1:10加入保护剂溶液(20％的脱脂奶粉、5％的蔗糖、1％的维生素C、1％谷氨酸钠)，充分混匀。将上述混匀后的菌液置于冷冻干燥机中进行冻干，得到冻干后的菌粉，活菌数约为2.4×10¹¹CFU/g。

实施例3植物乳杆菌DBNZW02作为青贮饲料发酵剂的应用

本实验研究了不同植物乳杆菌菌株对玉米青贮发酵品质和有氧稳定性的影响。选择了宝来利来产品中植物乳杆菌菌株BL-3、拉曼产品中植物乳杆菌菌株LM-2和本发明的植物乳杆菌DBNZW02进行了比较。

玉米直接青贮，原料均经铡草机切碎至1-2cm。冻干粉末的植物乳杆菌用自来水进行溶解稀释，均匀的喷洒在原材料上，以保证每克原料上达到10⁶cfu/g的乳酸菌。组别如下：1)对照组：不添加任何发酵剂，青贮自然发酵；2)DBNZW02组：实验室发酵生产的菌粉作为发酵剂，用量：15g菌粉/吨青贮；3)BL-3组：用BL-3菌株制作的菌粉作为发酵剂，用量：15g菌粉/吨青贮；4)LM-2组：用LM-2菌株制作的菌粉作为发酵剂，用量：15g菌粉/吨青贮。

试验方法：按500g/袋装入22cm×28cm聚乙烯包装袋中，每个处理5个重复，于恒温环境(25℃)中厌氧发酵30天后开封，测定青贮发酵品质。开封后进行取样，在放置过程中每天取样测定pH，对各组青贮饲料pH达到5.0的时间段进行取样，测定黄曲霉毒素含量。(1)青贮饲料发酵品质

表4不同植物乳杆菌菌株对青贮发酵品质的影响

项目	对照组	DBNZW02	BL-3	LM-2
					pH	3.98	3.82	3.87	3.85
乳酸(％DM)	5.72	9.06	7.07	8.44
					乙酸(％DM)	1.45	1.65	1.21	1.42
丙酸(％DM)	0.51	0.48	0.55	0.47
					丁酸(％DM)	未检出	未检出	未检出	未检出
乳酸/乙酸	3.94	7.31	5.84	5.94
					乳酸/总酸	0.74	0.84	0.80	0.82
氨态氮(％DM)	0.383	0.343	0.351	0.362

由表4可知，添加植物乳杆菌DBNZW02的青贮其pH值迅速降低，且在青贮30天时显著低于对照组及添加其他植物乳杆菌菌株的处理组，其乳酸含量显著高于其他处理组，表明DBNZW02能够利用可溶性碳水化合物迅速产生大量乳酸；添加DBNZW02的青贮氨态氮含量显著低于其他组，这是由于菌株DBNZW02能够快速降低青贮pH值，抑制有害微生物增殖及有害微生物对蛋白质的分解，从而尽可能多的保存原料中的营养成分，提高青贮饲料的营养价值与发酵品质。

(2)青贮饲料开封后pH变化

如图1所示，青贮打开后，随着暴露于空气时间的延长，青贮饲料的pH均呈上升趋势。打开后前8天，各处理青贮料的pH上升不显著，从第8天开始到第10天，pH均显著升高。第9天，对照组青贮料的pH显著高于乳酸菌处理组，达到5.0以上，第10天，乳酸菌处理组pH均达5.0以上，DBNZW02处理组pH显著低于其他2组处理组。

(3)青贮饲料黄曲霉毒素含量比较

表5不同植物乳杆菌菌株对青贮开封后有氧稳定性的影响

	开封当天	pH5.0时
			CK	0.32	6.81
DBNZW02	0.00	0.07
			BL-3	0.08	3.14
LM-2	0.00	2.88

从表5可以看出，全株玉米青贮料打开当天，仅对照组和BL-3处理组青贮饲料检出有黄曲霉毒素，且对照组黄曲霉毒素含量显著高于BL-3处理组，其余未检出黄曲霉毒素。青贮饲料打开后第10天测定的黄曲霉毒素含量均显著高于开封当天黄曲霉毒素含量。pH达5.0时取样测得，对照组黄曲霉毒素含量显著高于乳酸菌处理组，而DBNZW02处理的青贮饲料黄曲霉毒素含量仅为0.07。由此可见，植物乳杆菌DBNZW02作为一种发酵剂用于青贮发酵，发酵过程中，抑制黄曲霉菌等好气性菌的繁殖和代谢，同时，通过吸附或降解的作用机制减少已产生的黄曲霉毒素含量，开封后，维持青贮酸度和抑制好氧微生物活动，更有能力通过各种机制抑制或降解黄曲霉毒素的含量。植物乳杆菌DBNZW02作用温和，显著提高饲料品质，同时还能有效减少发酵及开封后的霉菌毒素含量。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一株植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)菌株，其保藏号为CGMCC No.12849。

2.含有权利要求1所述菌株的青贮饲料发酵剂。

3.如权利要求2所述的青贮饲料发酵剂，其特征在于，其为菌粉，所述菌粉还含有保护剂。

4.如权利要求3所述的青贮饲料发酵剂，其特征在于，所述的冻干保护剂含有20％的脱脂奶粉、5％的蔗糖、1％的维生素C和1％的谷氨酸钠。

5.如权利要求2-4任一项所述的青贮饲料发酵剂，其特征在于，所述布氏乳杆菌的含量为1×10¹⁰～1×10¹¹CFU/g。

6.一种权利要求1所述的植物乳杆菌菌株的发酵方法，其包括如下步骤：按体积比为1％-5％的接种量向发酵培养基中接入培养16-22h的所述布氏乳杆菌种子液，发酵过程中控制pH7.0-7.5，发酵温度37℃，转速80rpm，通气比1:0.4，罐压0.05MPa。

7.如权利要求5所述的植物乳杆菌菌株的发酵方法，其特征在于，所述的发酵培养基含有下述重量百分比的组分：蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母膏0.5％，柠檬酸氢二铵0.2％，葡萄糖2％g，吐温80 0.1％，乙酸钠0.5％，磷酸氢二钾0.2％，硫酸镁0.058％，硫酸锰0.025％。

8.一种青贮饲料发酵方法，其特征在于，将青贮原料切碎至1-2cm,按15g～20g菌粉/吨青贮原料的比例，将所述的植物乳杆菌菌粉用自来水进行溶解稀释，均匀的喷洒在原料上，以保证每克原料上达到10⁶cfu的乳酸菌，发酵时间至少30天。