CN102640885A - 一株植物乳杆菌在全株小麦青贮中的应用 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一株植物乳杆菌在全株小麦青贮中的应用。所述植物乳杆菌为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5027，该菌株能够提高乳熟期小麦(Triticumspp.)的茎、叶和种子青贮的营养价值，青贮15天后大肠杆菌低于检测线，且不含易引起恶臭的丁酸。与自然青贮相比，接种Z3-1青贮发酵30d，pH较低，有机酸中乳酸的含量提高了196％，乙酸的含量提高了159％，粗蛋白的含量提高了8.32％，粗纤维的含量降低了12.6％。应用本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1CGMCC No.5027接种青贮全株小麦具有效果好、成本低廉等优点，可用于生产绿色环保生物饲料。
Description
技术领域
本发明涉及一株植物乳杆菌在全株小麦青贮中的应用。
背景技术
研究表明，乳熟期小麦(Triticum spp.)的茎、叶和种子可以为牲畜提供可消化纤维和一定的能量(9.0MJ/kg，DM)，比干草的营养价值高10％～20％，与玉米相比，其粗蛋白含量相对较高。全株青贮小麦是泌乳期奶牛和肉牛的良好饲料。由于青贮乳熟期小麦的茎、叶和种子具有饲用价值高的优点，目前一些国家和地区开始注重开发青贮全株小麦的饲用价值。我国青贮原料主要是牧草(黑麦草、苜蓿、三叶草)和玉米，而小麦的青贮研究及应用较少。寻求适合的青贮添加剂，以此来改善青贮发酵，减少青贮损失，最终提高动物的生产性能，而选择微生物添加剂将不失为一条高效的途径。
发明内容
本发明的一个目的是提供植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在制备青贮饲料中的应用；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5027；所述青贮饲料为全株小麦(Triticum spp.)青贮饲料；所述全株小麦青贮饲料的青贮原料为全株小麦(Triticum spp.)，具体可为发育至乳熟期的小麦(Triticum spp.)的茎、叶和种子；
所述青贮饲料是将所述青贮原料在厌氧的条件下进行发酵得到的饲料；
所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1的菌落呈乳白色，边缘整齐；细胞显微形态为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；接触酶阴性，氧化酶阴性；具有较强的生长及产酸性能，30℃条件下，在MRS液体培养基中培养24h，菌体浓度可达到108～109cfu/mL，pH≤3.5；其碳源发酵实验结果如表1所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示；
该植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027具有以下生物学特性：
1)在起始pH2.5～pH9.0的条件下能够生长；
2)在5℃～10℃或50℃温度环境下呈现微弱生长，在15℃～45℃条件下生长状况良好；
3)在≤6.5％NaCl的条件下生长状况良好。
本发明的另一个目的是提供一种全株小麦青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：用所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1对全株小麦(Triticum spp.)进行固体发酵，收集所有发酵产物，得到所述全株小麦青贮饲料；所述进行固体发酵所用的全株小麦(Triticum spp.)为发育至乳熟期的小麦(Triticum spp.)的茎、叶和种子。
在上述全株小麦青贮饲料的制备方法中，所述发酵按照每克所述全株小麦(Triticum spp.)接种105～106cfu所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1进行。
在上述全株小麦青贮饲料的制备方法中，所述发酵的温度为室温；所述室温为15℃～25℃。
在上述全株小麦青贮饲料的制备方法中，所述发酵的时间为30d～60d。
上述任一所述方法制备得到的全株小麦青贮饲料均属于本发明保护的范围。
本发明的另一个目的是提供一种青贮饲料添加剂，所述青贮饲料添加剂的活性成分为所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1；
所述青贮饲料添加剂为制备青贮饲料过程中添加的菌剂。
本发明还提供上述青贮饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：将所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在用于培养植物乳杆菌的培养基上培养，得到所述青贮饲料添加剂。
本发明还提供培养所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1的方法，该方法包括将所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在用于培养植物乳杆菌的培养基上培养的步骤。
在上述青贮饲料添加剂的制备方法及培养所述植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1的方法中，所述用于培养植物乳杆菌的培养基可为MRS培养基，具体可为MRS液体培养基或MRS固体培养基；所述MRS液体培养基的溶剂为水，溶质为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温-80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，所述溶质蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温-80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰在所述MRS液体培养基中的浓度分别为10.0g/L、10.0g/L、5.0g/L、2.0g/L、20.0g/L、1.0g/L、5.0g/L、2.0g/L、0.58g/L和0.25g/L，所述MRS液体培养基的pH值为6.5；所述MRS固体培养基是按照每升所述MRS液体培养基加15克琼脂制备得到的培养基。
实验证明，与自然青贮相比，每克全株小麦(Triticum spp.)接种105～106cfu植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027青贮15d，全株小麦中的大肠杆菌即低于检测线，而自然青贮30d大肠杆菌才低于检测线；接种Z3-1青贮后发酵产物的pH降低较快，5d即降到4.0以下，而自然青贮至30d pH值仍高于4.0；接种Z3-1青贮30d～60d，有机酸中乳酸的含量较自然青贮提高196％，乙酸提高159％，粗蛋白含量提高8.32％，粗纤维含量降低12.6％。因此，与自然青贮相比，接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027能够明显提高全株小麦青贮的营养价值。
应用本发明所提供的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027发酵全株小麦具有发酵效率高、成本低廉等优点，可用于生产绿色环保生物饲料。
附图说明
图1为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027发酵液对革兰氏阳性及阴性指示菌的抑菌圈。
具体实施方式
下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
MRS液体培养基：溶剂为水，溶质为蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温-80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰，溶质蛋白胨、牛肉膏、酵母膏、柠檬酸氢二铵、葡萄糖、吐温-80、乙酸钠、磷酸氢二钾、硫酸镁和硫酸锰在MRS液体培养基中的浓度分别为10.0g/L、10.0g/L、5.0g/L、2.0g/L、20.0g/L、1.0g/L、5.0g/L、2.0g/L、0.58g/L和0.25g/L，pH值为6.5。
MRS固体培养基：每升上述MRS液体培养基添加15g琼脂制备得到的培养基。
红薯茎叶：为发育至红薯成熟时期的红薯(Ipomoea batatas)茎叶经过刈割处理后得到的，平均粒径为2mm，含水量为75.5％，切割为5cm长度。
麸皮：为小麦最外层的表皮，小麦被磨面机加工后得到的，含水量为为18.1％。
玉米糁：将玉米的成熟籽粒去皮后磨成的小颗粒，平均粒径为1mm，含水量为18.2％。
豆粕：含水量为10％。
花菜外包叶：为发育至花菜成熟时期的花菜(Brassica oleracea)外包叶，含水量为81.1％，切割长度为5cm。
实施例1、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027的分离、纯化与鉴定
取河南郑州地区青贮玉米秸秆10g，加入90mL蒸馏水，用震荡器震荡5min，10-1-10-5梯度稀释。分别从各梯度稀释液中取20μL涂布于MRS固体培养基上，静置厌氧培养48h，挑取菌落形态、大小、颜色和光泽度等有明显差别的单菌落，重复划线，直至得到纯菌落。将菌株接种于MRS液体培养基中30℃培养24h，10000rpm离心10min后，取20μL上清液，以藤黄微球菌(Micrococcus luteus)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)、沙门氏菌(Salmonella enterica)、铜绿假单胞杆菌(Pseudomonas aeruginosa)和大肠杆菌(Escherichia coli)分别作为指示菌，用牛津杯双层平板法进行抑菌试验，如图1所示，从中筛选出抑菌效果好的Z3-1菌株。
将Z3-1菌株在MRS固体培养基上培养24h后，观察菌落的大小、颜色、边缘状况及革兰氏染色镜检细菌形态。利用API 50CH检测Z3-1菌株对49种不同碳源的同化能力。结果：Z3-1菌株菌落呈现乳白色，边缘整齐；Z3-1菌株细胞显微形态为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；Z3-1菌株接触酶阴性，氧化酶阴性；Z3-1菌株具有较强的生长及产酸性能，在MRS液体培养基中培养24h，菌体浓度可达到108～109cfu/mL，pH≤3.5。Z3-1菌株的碳源发酵实验结果如表1所示；16S rRNA基因序列如序列表中序列1所示。
根据细胞显微形态、碳源发酵实验结果和16S rRNA基因序列数据，将菌株Z3-1鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)，并于2011年7月5日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称CGMCC，地址为：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所)，保藏登记编号为CGMCC No.5027。
表1.Z3-1菌株的碳源发酵实验结果
| 碳源 | Substrate | Z3-1 |
| 甘油 | Glycerol | - |
| 赤藓醇 | Erythritol | - |
| D-阿拉伯糖 | D-Arabinose | - |
| L-阿拉伯糖 | L-Arabinose | + |
| 核糖 | Ribose | + |
| D-木糖 | D-Xylose | - |
| L-木糖 | L-Xylose | - |
| 阿东醇 | Adonitol | - |
| β-甲基-D木糖甙 | β-Methyl-xyloside | - |
| 半乳糖 | Galactose | + |
| D-葡萄糖 | D-Glucose | + |
| D-果糖 | D-Fructose | + |
| D-甘露糖 | D-Mannose | + |
| L-山梨糖 | L-Sorbose | - |
| 鼠李糖 | Rhamnose | - |
| 卫茅醇 | Dulcitol | - |
| 肌醇 | Inositol | - |
| 甘露醇 | Mannitol | + |
| 山梨醇 | Sorbitol | + |
| α-甲基-D-甘露糖甙 | α-Methyl-D-mannoside | + |
| α-甲基-D-葡萄糖甙 | α-Methyl-D-glucoside | - |
| N-乙酰-葡萄胺 | N-acetyl glucosamine | + |
| 苦杏仁甙 | Amygdaline | + |
| 熊果甙 | Arbutine | + |
| 七叶灵 | Esculine | + |
| 柳醇 | Salicine | + |
| 纤维二糖 | Cellobiose | + |
| 麦芽糖 | Maltose | + |
| 乳糖 | Lactose | + |
| 蜜二糖 | Melibiose | + |
| 蔗糖 | Saccharose | + |
| 海藻糖 | Trehalose | + |
| 菊糖 | Inuline | - |
| 松三糖 | Melezitose | + |
| D-棉子糖 | D-Raffinose | w |
| 淀粉 | Starch | - |
| 糖原 | Glycogene | - |
| 木糖醇 | Xylitol | - |
| β-牻牛儿糖 | β-Gentiobiose | + |
| D-松二糖 | D-Turanose | + |
| D-来苏糖 | D-Lyxose | - |
| D-塔格糖 | D-Tagatose | - |
| D-岩糖 | D-Fucose | - |
| L-岩糖 | L-Fucose | - |
| D-阿拉伯糖醇 | D-Arabitol | w |
| L-阿拉伯糖醇 | L-Arabitol | - |
| 葡萄糖酸盐 | Gluconate | + |
| 2-酮基-葡萄糖酸盐 | 2-ceto-gluconate | - |
| 5-酮基-葡萄糖酸盐 | 5-ceto-gluconate | - |
注：“+”为阳性；“-”为阴性；“w”为弱阳性。
以下实施例中所述Z3-1如无特殊说明，均为植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1 CGMCC No.5027。
实施例2、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027在不同pH、温度及盐浓度环境条件下的生长
用1mol/L的盐酸和1mol/L的氢氧化钠将MRS培养基的起始pH值分别调至2.0、3.0、3.5、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、7.0、8.0、9.0，30℃恒温静置培养植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.502724h，培养过程中不调酸，用分光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)。结果如表2所示，Z3-1菌株能够在起始pH2.5～pH9.0的条件下生长。
将活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027菌株接种于MRS液体培养基，分别在5，10，15，20，25，30，35，40，42，50℃等温度下培养24h，用分光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)。结果如表2所示，Z3-1菌株在5℃～10℃或50℃温度环境下呈现微弱生长，在15℃～45℃条件下生长状况良好。
将活化的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027菌株分别接种于含NaCl的质量百分含量为3％和6.5％的MRS液体培养基中培养24h，用分光光度计测定600nm处光吸收值(OD600)。结果如表2所示，Z3-1菌株能够在3％和6.5％NaCl的条件下生长。
表2.Z3-1菌株CGMCC No.5027在不同环境条件下的生长情况
| pH | Z3-1 | 温度 | Z3-1 | NaCl(％) | Z3-1 |
| 2.5 | + | 5℃ | w | 3.0 | + |
| 3.0 | + | 10℃ | w | 6.5 | + |
| 3.5 | + | 15℃ | + | ||
| 4.0 | + | 20℃ | + | ||
| 4.5 | + | 25℃ | + | ||
| 5.0 | + | 30℃ | + | ||
| 5.5 | + | 35℃ | + | ||
| 6.0 | + | 40℃ | + | ||
| 7.0 | + | 45℃ | + | ||
| 8.0 | + | 50℃ | w | ||
| 9.0 | + |
注：“+”表示生长，“-”表示不生长“W”表示微弱生长。
实施例3、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027青贮全株小麦
全株小麦：为发育至乳熟期的小麦(Triticum spp.)的茎、叶和种子切割成1～2cm长度，含水量为54％。
方法I
1、制备菌悬液
无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL的菌悬液。
2、设两个处理(每个处理3次重复，结果以平均值形式表示)
处理1(接种Z3-1青贮)：取100g全株小麦，按每克青贮原料加105cfu Z3-1取步骤1制备的Z3-1菌悬液，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋内气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放。
处理2(自然青贮)：取100g全株小麦加入与处理1同样体积的不含Z3-1的MRS液体培养基，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋内气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放。
分别于0、3、5、10、15、30d时开封，记录各处理发酵产物的pH值，并采用稀释平板计数法测定发酵产物中的活菌数。30d开封时测定各处理得到的发酵产物中有机酸组成、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维含量及氨态氮占总氮的百分比。
上述有机酸组成及含量测定条件为：采用色谱柱Column Type：CarbomixH-NP10：8％，7.8×300mm，柱温：55℃，流速：0.6ml/min，流动相：2.5mM H2SO4，注入样品量：10ul，旋光性：非极性，UV检测器214nm。
上述粗蛋白、粗脂肪、粗纤维含量及氨态氮占总氮的百分比的检测由农业部农产品质量监督检验测试中心(郑州)测试，检测依据分别为GB/T 6432-1994、GB/T6433-2006、GB/T 6434-2006和Q/NYNJ 02-2002。
3、实验结果
如表3～5所示，结果表明：全株小麦经青贮后均检测不到容易引起恶臭的丁酸。与自然青贮相比，接种Z3-1青贮后发酵产物的pH降低较快，5d即降到4.0以下，而自然青贮至30d，pH值仍高于4.0。接种Z3-1青贮15d全株小麦大肠杆菌即低于检测线，而自然青贮30d大肠杆菌才低于检测线。接种Z3-1青贮30d有机酸中乳酸的含量较自然青贮提高196％，乙酸提高159％，粗蛋白含量提高8.32％，粗纤维含量降低12.6％。因此，与自然青贮相比，接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027能够明显提高全株小麦青贮的营养价值。
表3.自然青贮和接种Z3-1青贮过程中的pH及微生物含量(lg cfu/g FM)
注：nd为低于检测线；FM为新鲜样的重量。
表4.青贮30d全株小麦的pH及有机酸组成(％FM)
| 青贮方式 | pH | 乳酸 | 乙酸 | 丙酸 | 丁酸 |
| 自然青贮 | 4.20 | 1.25 | 0.37 | - | - |
| 接种Z3-1青贮 | 3.49 | 3.70 | 0.96 | - | - |
注：％FM为新鲜样中有机酸的质量百分含量。
表5.青贮30d全株小麦的营养成分
| 青贮方式 | 粗蛋白(％DM) | 粗脂肪(％DM) | 粗纤维(％DM) | 氨态氮/总氮(％) |
| 自然青贮 | 9.62 | 3.24 | 26.28 | 11.0 |
| 接种Z3-1青贮 | 10.42 | 3.32 | 22.97 | 10.8 |
注：％DM为干物质中营养物质的质量百分含量。
方法II
1、制备菌悬液
无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL的菌悬液。
2、设两个处理(每个处理3次重复，结果以平均值形式表示)
处理1(接种Z3-1青贮)：取100g全株小麦，按每克青贮原料加106cfu Z3-1取步骤1制备的Z3-1菌悬液，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋内气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放。
处理2(自然青贮)：取100g全株小麦加入与处理1同样体积的不含Z3-1的MRS液体培养基，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋内气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放。
于60天时开封，分别记录两个处理发酵产物的pH值，并采用稀释平板计数法测定发酵产物中的活菌数。60天开封时按照与方法I相同的方法测定各处理得到的发酵产物中有机酸组成、粗蛋白、粗脂肪、粗纤维含量及氨态氮占总氮的百分比。
3、实验结果
与自然青贮相比，接种Z3-1青贮全株小麦后乳酸、乙酸和粗蛋白含量明显提高，粗纤维含量明显降低。因此，接种植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027能够明显提高全株小麦青贮的营养价值。
实施例4、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027青贮红薯茎叶
方法I
1、制备菌悬液：无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL的菌悬液。
2、设4个处理(每个处理3次重复，结果以平均值表示)
按表6分别取青贮原料100g，按每克青贮原料加105cfu Z3-1取步骤1制备的Z3-1菌悬液，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放30d时开封，记录发酵产物的pH值，采用稀释平板计数法测定发酵产物的活菌数，并测定各处理发酵产物中的有机酸组成及含量。
上述有机酸组成及含量测定采用色谱柱Column Type：Carbomix H-NP10：8％，7.8×300mm，柱温：55℃，流速：0.6ml/min，流动相：2.5mM H2SO4，注入样品量：10ul，旋光性：非极性，UV检测器214nm。
表6.4个处理的青贮原料组成及含水量(I)
| 处理 | 青贮原料组成 | 含水量 |
| 1 | 红薯茎叶 | 75.5％ |
| 2 | 红薯茎叶与麸皮(以90.42∶9.58的质量比混合) | 70％ |
| 3 | 红薯茎叶与玉米糁(以90.4∶9.6的质量比混合) | 70％ |
| 4 | 红薯茎叶与豆粕(以91.6∶8.4的质量比混合) | 70％ |
3、实验结果
红薯茎叶单独青贮和以红薯茎叶与麸皮或玉米糁混合组成的含水量为70％的混合物青贮，30d开封，各处理组中的乳酸菌在107～108之间，已检测不到大肠杆菌、酵母及霉菌。如表7所示，与红薯茎叶单独青贮相比，红薯茎叶与麸皮或玉米糁混合青贮，pH较低，乳酸含量明显较高。各处理均未检测到容易引起恶臭的丁酸。红薯茎叶与豆粕混合组成的含水量为70％的混合物青贮，30d开封时pH值测定结果为5.0，且气味不佳。
表7.红薯茎叶、红薯茎叶与麸皮或玉米糁或豆粕混合成含水量为70％的混合物青贮30d的pH值及有机酸组成
注：FM为新鲜样的重量。
方法II
1、制备菌悬液：无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL的菌悬液。
2、设4个处理(每个处理3次重复，结果以平均值形式表示)
按表8分别取青贮原料100g，按每克青贮原料加106cfu Z3-1取步骤1制备的Z3-1菌悬液，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放60d时开封，记录发酵产物的pH值，采用稀释平板计数法测定发酵产物的活菌数，并测定各处理发酵产物中的有机酸组成及含量，测定方法同方法I。
表8.4个处理的青贮原料及其含水量(II)
| 处理 | 青贮原料组成 | 含水量 |
| 1 | 红薯茎叶 | 75.5％ |
| 2 | 红薯茎叶与麸皮(以72.99∶27.01的质量比混合) | 60％ |
| 3 | 红薯茎叶与玉米糁(以72.95∶27.05的质量比混合) | 60％ |
| 4 | 红薯茎叶与豆粕(以76.34∶23.66的质量比混合) | 60％ |
3、实验结果
以红薯茎叶单独青贮和以红薯茎叶与麸皮或玉米糁混合制成的含水量为60％的混合物青贮，60d开封，各处理组中的乳酸菌在107～108cfu/g FM之间，已检测不到大肠杆菌、酵母及霉菌。如表9所示，与红薯茎叶单独青贮相比，红薯茎叶和麸皮、玉米糁混合青贮，pH较低，乳酸含量明显较高。各处理均未检测到容易引起恶臭的丁酸。红薯茎叶与豆粕混合组成的含水量为60％的混合物青贮，60d开封时pH值测定结果为4.8，且气味不佳。
表9.红薯茎叶、红薯茎叶与麸皮或玉米糁或豆粕混合成含水量为60％的混合物青贮60d的pH值及有机酸组成
注：FM为新鲜样的重量。
实施例5、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027青贮花菜外包叶
1、制备菌悬液：无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)Z3-1CGMCCNo.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL。
2、设4个处理(每个处理3次重复，结果以平均值表示)
按表10分别取青贮原料100g，按每克青贮原料加105cfu Z3-1取步骤1制备的Z3-1菌悬液，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放30d，并于30d开封，记录发酵产物的pH值，采用稀释平板计数法测定发酵产物的活菌数，并测定各处理发酵产物中的有机酸组成及含量。
上述有机酸组成及含量测定采用色谱柱Column Type：Carbomix H-NP10：8％，7.8×300mm，柱温：55℃，流速：0.6ml/min，流动相：2.5mM H2SO4，注入样品量：10ul，旋光性：非极性，UV检测器214nm。
表10.4个处理的青贮原料及其含水量
| 处理 | 青贮原料组成 | 含水量 |
| 1 | 花菜外包叶 | 81.1％ |
| 2 | 花菜外包叶与麸皮(以82.38∶17.62的质量比混合) | 70％ |
| 3 | 花菜外包叶与玉米糁(以82.35∶17.65的质量比混合) | 70％ |
| 4 | 花菜外包叶与豆粕(以84.39∶15.61的质量比混合) | 70％ |
3、实验结果
以花菜外包叶单独青贮和以花菜外包叶与麸皮或玉米糁混合组成的含水量为70％的混合物青贮，30d开封，各处理组中每克发酵产物中的乳酸菌在107～108cfu之间，已检测不到大肠杆菌、酵母及霉菌。如表11所示，与花菜外包叶单独青贮相比，花菜外包叶与麸皮或玉米糁混合青贮，pH较低，乳酸含量明显较高。各处理均未检测到容易引起恶臭的丁酸。然而，花菜外包叶与豆粕混合组成的含水量为70％的混合物青贮，30d开封时pH值测定结果为5.3，且气味不佳。
表11.花菜外包叶单独、花菜外包叶与麸皮或玉米糁混合制成的含水量为70％的混合物青贮30d的pH值、有机酸组成及微生物组成
注：％FM为新鲜样中有机酸的质量百分含量；cfu/g FM为每克新鲜样中微生物的活菌数。
实施例6、植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCC No.5027青贮花花菜外包叶
1、制备菌悬液：无菌条件下，取植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1CGMCCNo.5027，接种于MRS液体培养基中30℃培养，得到Z3-1含量为108～109cfu/mL。
2、设4个处理(每个处理3次重复，结果以平均值表示)
按表12分别取青贮原料100g，按每克青贮原料加106cfu Z3-1取步骤1制备的Z3-1菌悬液，装入青贮袋中混匀，抽气后(袋中的气压为零)厌氧15℃～25℃(室温)存放60d，并于60d开封，记录发酵产物的pH值，采用稀释平板计数法测定发酵产物的活菌数，并测定各处理发酵产物中的有机酸组成及含量。
上述有机酸组成及含量的测定方法同实施例5。
表12.4个处理的青贮原料及其含水量
| 处理 | 青贮原料组成 | 含水量 |
| 1 | 花菜外包叶 | 81.1％ |
| 2 | 花菜外包叶与麸皮(以66.51∶33.49的质量比混合) | 60％ |
| 3 | 花菜外包叶与玉米糁(以66.45∶33.55的质量比混合) | 60％ |
| 4 | 花菜外包叶与豆粕(以70.32∶29.68的质量比混合) | 60％ |
3、实验结果
以花菜外包叶单独青贮和以花菜外包叶与麸皮或玉米糁混合制成的含水量为60％的混合物青贮，60d开封，各处理组中每克发酵产物中的乳酸菌在107～108cfu之间，已检测不到大肠杆菌、酵母及霉菌。如表13所示，与花菜外包叶单独青贮相比，花菜外包叶和麸皮、玉米糁混合青贮，pH较低，乳酸含量明显较高。各处理均未检测到容易引起恶臭的丁酸。然而，花菜外包叶与豆粕混合组成的含水量为60％的混合物青贮，60d开封时pH值测定结果为4.69，且气味不佳。
表13.花菜外包叶单独、花菜外包叶与麸皮或玉米糁混合制成的含水量为60％的混合物青贮60d的pH值、有机酸组成及微生物组成
注：％FM为新鲜样中有机酸的质量百分含量；cfu/g FM为每克新鲜样中微生物的活菌数。
将含水量较高的花菜外包叶和含水量较低的麸皮或玉米糁混合成含水量为60％～70％的混合物青贮，不仅可以把含水量调整到适合青贮的水平，还由于混合后的饲料营养成分较为全面、均衡。饲喂此混合青贮饲料能够在保证干物质摄入量的同时，有效增加乳酸菌及其代谢产物的摄入量。
Claims (9)
1.植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在制备青贮饲料中的应用；所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心的登记入册编号为CGMCC No.5027；所述青贮饲料为全株小麦(Triticum spp.)青贮饲料。
2.一种小麦青贮饲料的制备方法，包括如下步骤：用权利要求1所述植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1对全株小麦(Triticum spp.)进行固体发酵，收集所有发酵产物，得到所述全株小麦青贮饲料。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于：所述发酵按照每克所述全株小麦(Triticum spp.)接种105～106cfu所述植物乳杆菌(Lac tobacillus plantarum)Z3-1进行。
4.根据权利要求2或3所述的方法，其特征在于：所述发酵的温度为室温，所述室温为15℃～25℃。
5.根据权利要求2-4中任一所述的方法，其特征在于：所述发酵的时间为30d～60d。
6.权利要求2-5中任一所述方法制备得到的全株小麦青贮饲料。
7.一种青贮饲料添加剂，其特征在于：所述青贮饲料添加剂的活性成分为权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1。
8.权利要求7所述青贮饲料添加剂的制备方法，包括如下步骤：将权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在用于培养植物乳杆菌的培养基上培养，得到权利要求7所述的青贮饲料添加剂。
9.培养权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1的方法，包括将权利要求1所述的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)Z3-1在用于培养植物乳杆菌的培养基上培养的步骤。
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