CN112391325B - 一种副干酪乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明提供了一种副干酪乳杆菌GRR(Lactobacillus paracasei)GRR，其保藏编号为CCTCC No：M2017777。所述的副干酪乳杆菌GRR在制备稻秸发酵饲料中的应用。本发明的副干酪乳杆菌具有低温适应力强，加速稻秸秆发酵成熟、提高稻秸秆发酵品质、提高有氧稳定性和饲用安全等优点，可广泛应用于稻秸发酵饲料制备领域。
Description
技术领域
本发明公开了一种副干酪乳杆菌及其应用，属于家畜饲料中的微生物发酵技术领域。
背景技术
反刍动物具有食草的特性，以草为主的粗饲料保障问题一直是制约牛羊产业发展的瓶颈。就农区地域环境和资源特点来说，秸秆资源饲料化是解决饲草来源的重要途径。
发酵饲料是目前世界上研究和开发的热点，在保障我国饲料资源、畜产品安全，促进减排、降低环境污染等诸多方面都显示了极大前景。我国南方地区，大量稻草秸秆被弃置或就地焚烧。随着水稻收获机械化程度的不断提高，稻谷收获的同时将新鲜稻草秸秆进行发酵已成为稻秸饲料化的重要方式。大部分稻秸收获季节的气温较低，稻草茎叶上自然附着的乳酸菌少，茎叶中的可溶性碳水化合物含量很低，自然发酵很难调制成具有较高饲用价值的稻秸发酵饲料。
乳酸菌是近年来正在推广的发酵用微生物菌剂，其主要作用是调节发酵原料内的微生物组成，迅速成为优势菌群，竞争抑制有害微生物生长，快速转化有限的糖分，显著地降低原料pH值，从而有效提高秸秆发酵饲料的质量，具有较大潜力和广阔的发展前景。其中植物乳杆菌应用最为广泛。专利文献《一株适用于青贮稻草的植物乳杆菌及其使用方法(CN201210115193.6)》提供了一种能够加速稻草青贮成熟并改善稻草青贮饲料品质的植物乳杆菌，但是青贮发酵是在储藏室完成，没有考虑到每年稻草收获期的低温条件，且青贮PH没有降到优质青贮的4.50以下。专利文献《一种基于正交试验方法优化设计的水稻秸(CN109123104 A)》公布了采用青贮菌、纤维素分解菌或酶和碳源物质组合的方式制成青贮添加剂，青贮的菌剂为市售的菌剂。在微生物菌种资源中，每个菌种都有上百个甚至上千上性能不同的亚种(菌株)，仍需要研究在低温适应性、产酸能力、抑菌能力等方面更加优异的发酵用乳酸菌。另外，根据微生物对生境的适应性和特异性原理，从稻秸中分离土著乳酸菌，将乳酸菌再应用于稻秸，乳酸菌更能迅速产酸，抑制大肠杆菌、霉菌等有害菌的增殖。因此从稻秸中分离乳酸菌，制备稻秸专属的乳酸菌菌剂，是提高发酵稻秸饲料品质、提高稻秸饲用安全的重要保证。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，其目的在于提供一种副干酪乳杆菌及其应用。
本发明的第一个发明目的是提供一种副干酪乳杆菌GRR(Lactobacillusparacasei)GRR，其保藏编号为CCTCC No：M2017777。
所述的副干酪乳杆菌GRR(Lactobacillus paracasei)GRR是从稻草秸秆上筛选出来的，是具有低温适应性强、产酸速度快和抑菌能力强的乳酸菌。
本发明涉及到的微生物的保藏信息如下：
保藏单位：中国典型培养物保藏中心(CCTCC)；
保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内；
分类命名：副干酪乳杆菌GRR(Lactobacillus paracasei)GRR；
保藏号：CCTCC No:M2017777；
保藏日期为：2017年12月25日。
菌株特征：副干酪乳杆菌GRR(Lactobacillus paracasei)GRR的菌落呈乳白色，边缘整齐；细胞显微形态为短杆状，无芽孢，革兰氏染色阳性；接触酶阴性，氧化酶阴性；具有较强的生长及产酸性能，在起始pH值为3.0-8.0的培养基上能生长，在5℃条件下能生长，在10℃-30℃条件下生长状况良好，在不大于6.5％NaCl的条件下生长状况良好。
本发明的第二个发明目的是提供所述的副干酪乳杆菌GRR在制备稻秸发酵饲料中的应用。
本发明的发明人根据微生物对生境的适应性和特异性原理，从稻草秸秆中筛选出提高稻秸发酵品质且抑菌能力强的专属发酵菌：副干酪乳杆菌GRR(Lactobacillusparacasei)GRR，相对于现有技术，本发明的副干酪乳杆菌具有如下预料不到的技术效果：
(1)本发明的菌株低温适应性强，在10℃条件下，15天发酵稻秸饲料的PH下降到4.38，在5℃条件下，30天发酵稻秸饲料的PH下降到4.35。
(2)本发明能显著提高发酵稻秸的淀粉含量，提高稻秸的营养品质；显著增加乳酸、丙酸等含量；异丁酸、丁酸、乙醇和氨态氮含量显著降低，有利于改善发酵稻秸的适口性，提高了稻秸的发酵品质。
(3)本发明能显著提高发酵稻秸中的乳杆菌属、片球菌属、毕赤酵母属等益生菌含量，有利于促进动物的肠道健康；显著降低发酵稻秸中的肥杆菌属、肠球菌属、大肠杆菌志贺菌属等有害肠杆科；分枝杆菌属、短小杆菌属等植物病原菌，确保了稻秸饲用安全；同时显著抑制木霉属、毛霉属、粘帚霉、镰刀霉等霉菌的生长，提高有氧稳定性和饲用安全性。
因此，本发明的副干酪乳杆菌具有低温适应力强，加速稻秸秆发酵成熟、提高稻秸秆发酵品质、提高有氧稳定性和饲用安全等优点，可广泛应用于稻秸发酵饲料制备领域。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明做进一步说明，以下的实施例便于更好地理解本发明，但并不限定本发明。下述实施例中的实验方法，如无特殊说明，均为常规方法。所用的营养肉汤、马铃薯葡萄糖肉汤和培养基均购自北京奥博星生物技术有限公司，抑菌试验指示细菌和真菌均购自中国工业微生物菌种保藏中心。其他试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
实施例1副干酪乳杆菌GRR(Lactobacillus paracasei)GRR的分离与鉴定
1、分离纯化
从稻草秸秆中分离纯化，得到副干酪乳杆菌GRR，具体如下：称取10g常规稻草秸秆样品加入灭菌的90ml蒸馏水中，利用恒温摇床震荡1h，然后10倍梯度稀释，分别取10-3、10-4和10-5倍样品稀释液涂布在MRS固体培养基上，培养48h，然后将其取出，依据菌落的大小、形态和颜色，挑取MRS上生长的单菌落，进行过氧化氢酶实验及革兰氏染色。将过氧化氢酶阴性及革兰氏染色阳性者暂定为乳酸菌，于MRS固体培养基上继续划线纯化2次。-80℃保存于含25％v/v甘油的MRS液体培养基中，菌株命名为副干酪乳杆菌GRR(Lactobacillusparacasei)GRR。
2、生理生化检测
副干酪乳杆菌GRR在起始pH值为3.0-8.0的培养基上能生长，在5℃条件下能生长，在10℃-30℃条件下生长状况良好，在不大于6.5％NaCl的条件下生长状况良好。菌株GRR兼性异型发酵乳糖，能较好地利用葡萄糖、乳糖、果糖、半乳糖、纤维二糖、麦芽糖、甘露糖、松三糖、核糖、蔗糖、海藻糖、山梨醇、甘露醇，可缓慢利用淀粉，不能利用蜜二糖、棉籽糖、鼠李糖、木糖、阿拉伯糖，H2S试验、吲哚试验、明胶液化试验、硝酸盐还原试验均为阴性。
3、分子鉴定
将固体平板上培养48h的副干酪乳杆菌GRR，采用菌落PCR扩增，进行16rRNA基因序列鉴定。引物选用细菌的16S rRNA基因扩增通用引物：27F和1492R。PCR反应体系为50μl：Premix Taq25μl，27F和1492R(均为20μM)1μl，补充灭菌蒸馏水至50μl，直接将菌落加入反应体系，进行PCR扩增，得到PCR产物。将PCR产物纯化后送去测序，结果为序列表中SEQ No.1所示。
经过上述鉴定，副干酪乳杆菌GRR于2017年12月25日，已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址：湖北省武汉市武昌区八一路299号武汉大学校内，分类命名：副干酪乳杆菌GRR(Lactobacillus paracasei)GRR，保藏号：CCTCC No：M2017777，保藏日期为：2017年12月25日。
实施例2副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GRR抑菌活性的检测
菌株活化：将冷冻保存的(Lactobacillus paracasei)GRR(以下简称GRR)接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养24h，如此传代培养2次得到所述的活化GRR，活化后的菌株按3％的接种量重新转接MRS液体培养基中，培养24小时，菌液离心得上清液。
细菌(大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌)、真菌(黄曲霉菌)为指示菌，以营养琼脂培养基作为指示细菌的培养基，以马铃薯葡萄糖琼脂培养基作为指示真菌的培养基。将甘油保存的指示菌株活化。活化后的菌株按3％的接种量重新转接营养肉汤和马铃薯葡萄糖肉汤中，指示细菌37℃条件下培养24h，指示真菌30℃条件下培养72h，用生理盐水分别将指示菌液稀释至OD600吸光值为0.1。向培养皿中倾注10mL高压灭菌过的水琼脂(1.5％琼脂)进行铺底，每个培养皿厚度均一，待水琼脂冷却凝固后，将灭菌后的牛津杯置于琼脂之上。吸取1mL指示菌菌液加入到100mL恒温至50±5℃的营养肉汤琼脂或马铃薯葡萄糖琼脂中，轻轻摇匀。将上述加过菌液的琼脂培养基倒入放有牛津杯的凝固的琼脂培养皿中，每个平皿倒20-25mL，待其冷却凝固。用镊子取出牛津杯，吸取200μL的GRR菌液上清液注入到相应的孔内，设立MRS培养液为空白对照，同时在培养皿上做好标记，将培养皿放入4℃冰箱内放置2h进行样品的扩散。将培养皿分别移入37℃和30℃培养箱培养。在接下来的18h观察GRR对指示细菌(大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌)的抑菌效果，72h观察GRR对真菌(黄曲霉菌)的抑菌效果，结果见表1。
表1：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GRR的抑菌能力
| 病原菌 | 大肠杆菌 | 沙门氏菌 | 金黄色葡萄球菌 | 黄曲霉菌 |
| 抑菌圈(mm) | 21.5±0.8 | 19.2±0.5 | 20.3±0.7 | 18.9±0.9 |
实施例3：副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)GRR在发酵稻秸中的应用
菌株的制备：将冷冻保存的GRR分别接种于MRS液体培养基中，在温度37℃下培养24h，如此传代培2次得到所述的活化GRR菌种。将活化的菌种接种在MRS液体培养基中37℃培养，菌液经离心，冷冻干燥、粉碎、辅料混合制成GRR的冻干粉，使乳酸菌冻干粉的活菌数达到1×1010cfu/g。
稻秸饲料的发酵：稻秸切断至3-4cm，稻秸原料的水分含量控制在65％-70％，称取200g稻秸原料装入真空包装塑料袋中，将上述制备的菌粉按0.025‰(即2.5×105cfu/g)的接种量接种到原料中，采用真空包装机真空包装后，分别置于5℃、10℃、15℃、20℃的生化培养箱中发酵，设置对照组为未添加GRR组，分别在7d、15d、30d开袋测发酵稻秸的PH，结果见表2。
表2不同温度下发酵稻秸PH的影响
由表2可知，在5-20℃的范围内，GRR均能显著降低发酵稻秸的pH。在10℃条件下，15天发酵稻秸饲料的PH下降到4.38，在5℃条件下，30天发酵稻秸饲料的PH下降到4.35。
在30d发酵后，取10℃下的对照组和试验组的发酵样品进行发酵品质分析和营养指标分析。
发酵指标：氨态氮/总氮、有机酸(乳酸、乙酸、丙酸、丁酸)；营养品质：粗蛋白、水溶性碳水化合物、淀粉、中性洗涤纤维、酸性洗涤纤维。结果见表3、表4。
表3副干酪乳杆菌对稻秸发酵品质的影响
表4副干酪乳杆菌对稻秸营养品质的影响
由表3、表4可知，GRR显著提高了发酵稻秸的乳酸和丙酸的含量，显著降低了异丁酸、丁酸、乙醇和氨态氮含量，提高了稻秸的发酵品质，显著提高稻草中的淀粉含量，提高了发酵稻草的营养品质。
为进一步研究发酵稻秸的微生物区系，采用分子微生物学方法系统研究发酵稻秸的微生物组成，提取30d发酵样品的微生物DNA，进行了细菌16SrDNAV3和真菌ITS区的扩增，采用HiSeq平台测序，开展Metastats分析，研究组间差异显著的物种，结果如表5所示。
表5副干酪乳杆菌对稻秸微生物的影响
由表5可知，GRR能显著提高发酵稻秸中的乳杆菌属(Lactobacillus)、片球菌属(Pediococcus)、毕赤酵母属(Pichia)等益生菌含量，有利于提高动物的肠道健康；显著降低发酵稻秸中的肥杆菌属(Hafnia-Obesumbacterium)、肠球菌属(Enterococcus)、大肠杆菌志贺菌属(Escherichia-Shigella)等有害肠杆科的含量；分枝杆菌属(Mycobacterium)、短小杆菌属(Curtobacterium)等植物病原菌显著降低，确保了稻秸饲用安全；同时显著抑制木霉属(Trichoderma)、毛霉属(Mucor)、粘帚霉(Clonostachys)、镰刀霉(Fusarium)等霉菌的生长，提高发酵稻秸的有氧稳定性和饲用安全性。
以上仅为本发明的实施例，并非因此限制本发明的专利范围，凡是利用本发明说明书内容所作的等效变换，或直接或间接运用在其它相关的技术领域，均同理包括在本发明的专利保护范围内。
序列表
<110> 江苏省农业科学院
<120> 一种副干酪乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1413
<212> DNA
<213> 副干酪乳杆菌(Lactobacillus paracasei)
<400> 1
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ggcggacggg tgagtaacac gtgggtaacc tgcccttaag tgggggataa catttggaaa 120
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Claims (2)
1.一种副干酪乳杆菌GRR (Lactobacillus paracasei) GRR，其保藏编号为CCTCC No：M2017777。
2.如权利要求1所述的副干酪乳杆菌GRR在制备稻秸发酵饲料中的应用。
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