CN114276949B - 一株副干酪乳杆菌及在制备构叶青贮饲料中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株副干酪乳杆菌，分类命名为Lactobacillus paracasei R‑8，已于2021年10月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20211244。本发明还公开了该菌株在制备高水分构叶青贮饲料中的应用。本发明还公开了高水分构叶青贮饲料的制备方法。本发明的副干酪乳杆菌，菌繁殖速度快，产酸能力强，能够快速降低高水分构叶青贮的pH值，提高乳酸的含量，抑制丁酸和氨态氮的产生，抑制梭菌和霉菌的生长，减少在青贮过程中营养物质的损耗，提高青贮的发酵品质的同时也改善了青贮饲料的适口性和有氧稳定性，最大程度地保留了构叶青贮原料的营养品质，具有很好的应用前景。

Description

一株副干酪乳杆菌及在制备构叶青贮饲料中的应用

技术领域

本发明涉及一株副干酪乳杆菌及其在制备高水分构树叶青贮饲料中的应用，属于微生物应用技术领域。

背景技术

青贮饲料主要用于饲喂反刍动物，已经成为反刍动物的重要饲料来源。杂交构树与野生构树相比具有更强的抗逆性和更高的产量，粗蛋白含量高于野生构树且叶片上没有被覆的绒毛，具有更好的适口性。杂交构树因其具有的优点可以作为优质的饲料原料来源，既可以缓解常规饲料原料(例如：大豆、玉米)紧缺的现状，又能够提高反刍动物的产量。杂交构叶在采摘之后含有大量的水分，一般情况下是经过晾晒后降低含水量再进行青贮，虽然含水量降低之后进行青贮能够很好地抑制有害菌的生长，但是青贮的周期也随之变长。高水分青贮可以解决青贮周期长的问题，但是高水分的环境非常有利于腐败菌和霉菌的生长，从而造成青贮的腐败变质。

如何解决青贮发酵过程中的腐败变质是难题，以往的经验是在青贮开始时添加甲酸、单宁酸、丙酸和山梨酸钾等化学添加剂。添加化学添加剂可以改善发酵品质，但是成本较高。微生物添加剂作为已经被批准的饲料添加剂现已被广泛地应用在饲料行业中，特别是青贮饲料。乳酸菌作为一种益生菌可产生乳酸抑制腐败菌和霉菌的繁殖，还可以使青贮饲料产生酸香味提高反刍动物的摄食量，同时又能提高摄食动物的健康水平，但是目前应用在构树叶青贮发酵的乳酸菌制剂较少；特别是在含水率高的条件下，能够正常进行青贮发酵的功能菌剂应用的更少。

发明内容

针对上述现有技术，为了改善高水分构叶青贮饲料的品质，本发明提供了一株可以用于高水分构叶青贮发酵的副干酪乳杆菌。

本发明是通过以下技术方案实现的：

一株副干酪乳杆菌，分类命名为Lactobacillus paracasei R-8，已于2021年10月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20211244，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

所述副干酪乳杆菌的形态特征为：如图1所示，细菌呈杆状、通过革兰氏染色观察到菌体颜色呈蓝紫色，菌落形态呈乳白色不透明、圆形、表面光滑。

所述副干酪乳杆菌的生理生化特性为：革兰氏染色阳性，硝酸盐还原实验结果呈阳阴性，明胶液化试验结果呈阴性，MR实验结果呈阴性，过氧化氢酶实验结果呈阴性，糖发酵实验：甘油阴性，半乳糖、果糖、葡萄糖、蔗糖、水杨苷、甘露醇阳性。

所述副干酪乳杆菌的16s rDNA序列如下所示(如SEQ ID NO.1所示)：

5’-GGGGATAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAGATCCAAGAACCGCATGGTTCTTGGCTGAAAGATGGCGTAAGCTATCGCTTTTGGATGGACCCGCGGCGTATTAGCTAGTTGGTGAGGTAATGGCTCACCAAGGCGATGATACGTAGCCGAACTGAGAGGTTGATCGGCCACATTGGGACTGAGACACGGCCCAAACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGACGCAAGTCTGATGGAGCAACGCCGCGTGAGTGAAGAAGGCTTTCGGGTCGTAAAACTCTGTTGTTGGAGAAGAATGGTCGGCAGAGTAACTGTTGTCGGCGTGACGGTATCCAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGCGAGCGCAGGCGGTTTTTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCTCGGCTTAACCGAGGAAGCGCATCGGAAACTGGGAAACTTGAGTGCAGAAGAGGACAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTGTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAATGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGCATTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTTTGATCACCTGAGAGATCAGGTTTCCCCTTCGGGGGCAAAATGACAGGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTATGACTAGTTGCCAGCATTTAGTTGGGCACTCTAGTAAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGATGACGTCAAATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGATGGTACAACGAGTTGCGAGACCGCGAGGTCAAGCTAATCTCTTAAAGCCATTCTCAGTTCGGACTGTAGGCTGCAACTCGCCTACACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCACGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCGAAGCCGGTGGCGTAACCCTTTAGGGAGCGAGCCGTCTAAGGTGACA-3’。

所述副干酪乳杆菌在制备高水分构叶青贮饲料中的应用。所述高水分是指构树叶青贮饲料中水分含量在73％～83％。

一种高水分构叶青贮饲料的制备方法：取构叶(水分含量在73％以上)，粉碎处理，接种上述副干酪乳杆菌，密封，室温放置青贮发酵至少20天。

进一步地，所述构叶选择植高80～120cm杂交构树的叶片。

进一步地，所述副干酪乳杆菌菌液的浓度为1×10⁸cfu/ml，接种量为10％(w/v)。

本发明的副干酪乳杆菌，菌繁殖速度快，产酸能力强，能够快速降低高水分构叶青贮的pH值，提高乳酸的含量，抑制丁酸和氨态氮的产生，抑制梭菌和霉菌的生长，减少在青贮过程中营养物质的损耗，提高青贮的发酵品质的同时也改善了青贮饲料的适口性和有氧稳定性，延长青贮饲料的保存期限，最大程度地保留了构叶青贮原料的营养品质，具有很好的应用前景。

本发明使用的各种术语和短语具有本领域技术人员公知的一般含义。提及的术语和短语如有与公知含义不一致的，以本发明所表述的含义为准。

附图说明

本发明的副干酪乳杆菌，分类命名为Lactobacillus paracasei R-8，已于2021年10月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC M 20211244，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

图1：乳酸菌的光学显微镜图片。

图2：不同含水率和菌株处理下的pH值示意图。

图3：不同含水率和菌株处理下的氨态氮含量示意图。

图4：不同含水率和菌株处理下的乳酸含量示意图。

图5：不同含水率和菌株处理下的丁酸含量示意图。

具体实施方式

下面结合实施例对本发明作进一步的说明。然而，本发明的范围并不限于下述实施例。本领域的专业人员能够理解，在不背离本发明的精神和范围的前提下，可以对本发明进行各种变化和修饰。

本发明对试验中所使用到的材料以及试验方法进行一般性和/或具体的描述。虽然为实现本发明目的所使用的许多材料和操作方法是本领域公知的，但是本发明仍然在此作尽可能详细描述。

下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。

下述试验中，构叶收获于山东省泰安市杂交构树种植基地株高为80～120cm的杂交构树，构叶在收获后进行粉碎处理。

试验1菌株的筛选

步骤如下：

1)取发酵40天的高水分构叶青贮饲料1g，加入无菌蒸馏水，在恒温振荡器中120rpm/min振荡30min，稀释成10^-5、10^-6、10^-7三个梯度的稀释液，吸取稀释液采用涂布法涂布到添加1.5％CaCO₃的MRS固体培养基，37℃恒温厌氧培养72h，挑选溶钙圈明显的菌落在MRS固体培养基连续划线培养3次，得到纯化的菌株。

所述高水分构叶青贮饲料的常规制备方法为：将10g青贮宝溶解于5千克水，均匀混入1吨粉碎的构叶中，装入密封袋中密封放置，进行厌氧青贮发酵。

2)将步骤1)中得到的纯化菌株在MRS固体培养基上划线培养36h，挑取菌落进行革兰氏染色和过氧化氢酶接触实验，选择革兰氏染色阳性和接触酶阴性的符合乳酸菌菌落特征的单菌落采用甘油保藏法保藏在-80℃，以便后续实验使用。

3)将步骤2)中保藏的乳酸菌进行活化后，以5％的接种量接种到20mL MRS液体培养基中在37℃下厌氧培养24h，吸取2ml菌液送至青岛蔚来生物技术有限公司进行菌种鉴定。

经过筛选，得到5株菌株，经鉴定，这5株菌株分别属于鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸杆菌和植物乳杆菌，将这5株乳酸菌作为青贮添加剂进行后续试验。

试验2乳酸菌作为青贮添加剂在高水分构叶青贮发酵过程中的应用

将试验1筛选得到的5株乳酸菌(鼠李糖乳杆菌、副干酪乳杆菌、干酪乳杆菌、乳酸杆菌、植物乳杆菌)接种于MRS液体培养基中，37℃过夜培养扩繁，培养至乳酸菌的浓度为1×10⁸cfu/ml，以10％(w/v)的接种量分别接种到50g粉碎的构叶中。通过烘干测得新鲜原料的含水率为73％，将含水率为73％的构树鲜叶设为对照组，通过计算分别在含水率为73％的构叶原料中添加不同量的蒸馏水依次设置五个梯度，分别为75％、77％、79％、81％和83％。使用真空密封机进行密封，室温放置青贮发酵20d后，分析其发酵品质和营养成分。

发酵品质分析：取5g青贮样品，加入到45mL蒸馏水中，4000rpm，10min，4℃静置2个小时，过16层滤布采集滤液，采用pH计测定pH值，对羟基联苯比色法测定乳酸含量，靛酚蓝-分光光度法测定氨态氮(NH₃-N)含量，高效液相色谱法测定丁酸的含量，结果如表1、2、3、4、图2、3、4、5所示。

表1

表2

表3

表4

由表1和图2可知，在不同含水率和菌株处理下，副干酪乳杆菌处理组的pH低于对照组，与其他处理组无显著差异(P>0.05)，并且在含水率为83％时显著低于对照处理组(p<0.05)，说明副干酪乳杆菌能够有效地降低青贮饲料的pH。

由表2和图3可知，在不同含水率和菌株处理下，副干酪乳杆菌处理组的氨态氮含量在含水率高于77％时与其他处理组差异不显著，副干酪乳杆菌处理组内较少有蛋白质发生降解，能够保留较多的营养物质。

由表3和图4可知，副干酪乳杆菌处理组的乳酸含量在构树叶含水率81％、83％时显著高于鼠李糖乳杆菌、干酪乳杆菌和植物乳杆菌处理组(p<0.05)，说明副干酪乳杆菌能够在高水分构树叶青贮发酵过程中产生大量乳酸。

通过表4和图5的分析结果可知，副干酪乳杆菌处理组在含水率83％的处理下产生了丁酸，但含量仅为1.47μg/μL，显著低于鼠李糖乳杆菌处理组和植物乳杆菌的含量(p<0.05)。

通过对pH、氨态氮、乳酸和丁酸含量的分析发现，在含水率为83％时，由图2和图3可知副干酪乳杆菌与其他处理组无显著差异，通过图4可得到乳酸含量高但与乳酸杆菌差异不显著(p>0.05)，由图5可知丁酸含量显著低于对照组和乳酸杆菌处理组(p<0.05)，综合分析图4和图5可知，本发明的副干酪乳杆菌的效果最佳，既可以产生大量的乳酸，同时能很好地抑制丁酸的产生。本发明的副干酪乳杆菌，能够有效地降低高水分构叶青贮的pH，有效抑制其他微生物的繁殖，在青贮发酵的整个体系中可以使乳酸菌成为优势菌群，同时在青贮发酵过程中产生了大量的乳酸和少量的氨态氮，从而减少了蛋白质的降解消耗，提高青贮饲料的质量。

张新全等人(2019)(张新全，关皓，闫艳红等.副干酪乳杆菌761及其应用，青贮饲料添加剂，青贮饲料.)对一株副干酪乳杆菌进行发酵实验，60d后测得乳酸含量为63.15mg/g，通过上述试验2中对乳酸含量的测定，本发明的副干酪乳杆菌在含水率83％、发酵20d时的乳酸含量为103.9mg/g。本发明与对照菌株在试验处理方法上基本一致，对照文献采用高效液相色谱法(HPLC)测乳酸含量，而本发明采用对羟基联苯比色法测定乳酸含量，在20d时测得的乳酸含量远高于对照文献中60d时测得的乳酸含量。目前，国内副干酪乳杆菌应用在青贮发酵中的文献较少，特别是能在高水分条件下进行正常青贮发酵的文献资料仅检索到一篇，本发明对该领域的研究进行了补充。

试验3副干酪乳杆菌的理化特性分析

对试验1筛选得到的副干酪乳杆菌进行生理生化特性分析，包括硝酸盐还原实验、明胶液化实验、MR实验和糖发酵实验，结果见表5。

表5

2)对实施例1中的乳酸菌进行抗逆性分析，结果见表6(表6中，+：生长Positive；-：不生长Negative；W：微弱生长Weaklypositive.)。

表6

耐胆盐实验：将上述乳酸菌按5％的接种量分别接种于分别含有胆盐浓度0.1％(w/v)、0.3％(w/v)、0.5％(w/v)的MRS培养基中，37℃培养24h，测定其耐胆盐性。

耐酸实验：将上述乳酸菌按5％的接种量分别接种于pH分别是2、2.5、3、3.5、4、4.5和5的MRS培养基中，37℃培养24h，测定其耐酸性。

16S rDNA核苷酸序列分析：16S rDNA核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，将以上序列通过在NCBI数据库中进行对比，结果显示菌株R-8与Lactobacillus paracasei同源性在99％以上。

给本领域技术人员提供上述实施例，以完全公开和描述如何实施和使用所主张的实施方案，而不是用于限制本文公开的范围。对于本领域技术人员而言显而易见的修饰将在所附权利要求的范围内。

Claims (5)

1.一株副干酪乳杆菌，分类命名为：副干酪乳杆菌R-8(Lactobacillus paracasei R-8)，已于2021年10月08日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M20211244，保藏地址为：湖北省武汉市武昌区八一路珞珈山。

2.权利要求1所述的副干酪乳杆菌在制备构叶青贮饲料中的应用，其特征在于：所述构叶的水分含量在73％～83％。

3.一种构叶青贮饲料的制备方法，其特征在于：取水分含量在73％～83％的构叶，粉碎处理，接种权利要求1所述的副干酪乳杆菌，密封，室温放置青贮发酵至少20天。

4.根据权利要求3所述的构叶青贮饲料的制备方法，其特征在于：所述构叶选择植高80～120cm杂交构树的叶片。

5.根据权利要求3所述的构叶青贮饲料的制备方法，其特征在于：所述副干酪乳杆菌菌液的浓度为1×10⁸cfu/ml，接种量为10％。

Images