CN115161234A - 一株贝莱斯芽孢杆菌及其在青贮防腐的应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种贝莱斯芽孢杆菌及其在青贮中的应用，属于微生物菌株技术领域，所述的贝莱斯芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M2022500；所述贝莱斯芽孢杆菌用于在乳酸菌发酵的环境中抑制有害微生物生长，同时可以用于乳酸菌发酵青贮的防腐。本发明从青贮中找到了一种芽孢杆菌，可以耐受青贮发酵时高温、高酸的环境，同时能够显著抑制有害微生物的生长，但不抑制乳酸菌的生长，不仅保证了青贮发酵过程中乳酸菌的发酵，而且能够抑制杂菌，保证发酵过程不受杂菌干扰，同时也不会产生有害物质，也不改变青贮原有的营养价值，具有很好的实用性，可以显著提升青贮发酵的稳定性，具有很高的商业价值。

Description

一株贝莱斯芽孢杆菌及其在青贮防腐的应用

技术领域

本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株贝莱斯芽孢杆菌及其在青贮防腐的应用。

背景技术

青贮饲料(Silage)是将新鲜的青饲料在厌氧条件下经乳酸菌发酵而形成的一类多 汁、耐贮、营养丰富的饲料，可突破时间限制，更是反刍动物越冬饲料的重要保证， 青贮(Ensile)过程中乳酸菌代谢产生大量乳酸、乙酸、甲酸等有机酸形成酸性环境， 使青贮体系pH快速降低至4.0左右，抑制其他微生物的活动，同时产生乳酸链球菌素 (Nisin)、ε-聚赖氨酸(ε-poly-lysine，ε-PL)、苯乳酸(Phenyllactic acid，PLA)等 拮抗代谢物，抑制腐败和致病菌生长，并提高青贮饲料的营养品质。饲草的青贮在一 定程度上解决了我国部分养殖地区冬季饲草料缺失的问题，但在实际生产应用中因饲 草自身携带腐败菌、泥土等杂质混入，原料填压不紧实等因素，使青贮料面临着污染 与腐败变质的问题，特别是在开罐喂养时期，青贮饲料与氧气接触，使原本受抑制的 腐败菌复苏存活，大量繁殖，青贮饲料pH值升高，青贮料有氧稳定性降低，导致青贮 料品质劣变，营养流失，并产生多种霉菌毒素，危害动物健康，造成动物性食品安全 隐患。

青贮饲料中除了有大量的乳酸菌外，还有丰富好氧菌如酵母菌、大肠菌、霉菌 等，这些微生物严重影响青贮有氧暴露期间的稳定性，其中导致青贮料腐败变质的主 要有镰刀菌、黑曲霉、黄曲霉、青霉等霉菌，通常喷洒柠檬酸、富马酸、甲酸等酸度 调节剂作为防腐剂以抑制腐败菌的增殖，减缓损失，但要反复喷洒，成本高且饲料适 口性差，本试验以此为出发点，选育一株芽孢杆菌，利用微生物之间的拮抗作用，抑 制致病菌、腐败菌生长，但不影响乳酸菌的生长。

发明内容

本发明的目的提供一种贝莱斯芽孢杆菌，该菌株为圆形菌落，乳白色，光滑，凸起，边缘整齐，不透明，革兰氏阳性，片球菌。最适生长温度37℃，最高生长温度45-47℃。

该菌株从青贮饲料中筛选得到的，该贝莱斯芽孢杆菌可以抑制腐败菌，但不抑制乳 酸菌，已于2022年4月27日保藏于在中国典型培养物保藏中心，该贝莱斯芽孢杆菌的 保藏号为：CCTCC No：M2022500，拉丁名：Bacillus velezensis B.V602，地址：湖北省 武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052。其菌落状态和革兰氏染色图见 图1和图2。

其中，所述贝莱斯芽孢杆菌用于在乳酸菌发酵的环境中抑制有害微生物生长。

其中，所述贝莱斯芽孢杆菌还可以用于青贮防腐。

本发明还提供了一种提高青贮饲料有氧稳定性的方法，所述方法为在添加乳酸菌发 酵青贮时或发酵完成后添加贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌保藏在中国典型培养 物保藏中心，保藏号为：CCTCC No:M2022500。

其中，所述贝莱斯芽孢杆菌的添加量为1～5％(V/m)。

有益效果

本试验团队从腐殖质土壤样品中分离菌株，结合细菌形态学、生理生化特征、分子生物学鉴定，其16S rRNA基因序列与枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis strainB.Subtilis (MN093877.1)相似度达100％，但在进化发育程度上与贝莱斯芽孢杆菌Bacillus velezensis strain 3726(MT538583.1)最为接近，综合分析确定所获得的菌株贝莱斯芽孢 杆菌为贝莱斯芽孢杆菌。芽孢杆菌在生长与繁殖过程中会产生许多具有抑菌活性的代谢 产物[23]，有研究表明B.velezensis对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、禾谷镰刀菌等致病、 致腐菌有良好的拮抗作用，具有促动物生长和抗病的潜能，这与本试验结果相佐。此外 本研究所筛菌株对黑曲霉也有一定的抑制作用，但对罗伊氏乳杆菌、屎肠球菌、干酪乳 杆菌无抑制作用，这一特性为该菌株在青贮防腐中的应用奠定了基础。

在青贮发酵过程中，青贮中心温度最高可达70℃，在快速发酵阶段青贮体系pH迅速降至4左右，在本研究中，贝莱斯芽孢杆菌在缺氧条件筛获，可在pH为2～10的环境 中存活，可耐受70℃。贝莱斯芽孢杆菌的pH稳定性、热稳定性较好，有良好的抗菌谱 特性，乳酸耐受性良好，可应用于青贮的各个阶段。

乳酸菌作为兼性厌氧菌，当饲料暴露于空气后，乳酸菌的生长在一定程度上受到了 抑制，同时促进了酵母菌、霉菌等好氧菌的生长，同时大量的有机酸挥发，青贮熟料pH上升，pH对酵母菌及霉菌的生长抑制作用减弱，随暴露时间延长，酵母菌、霉菌等腐败 菌逐渐成为了优势菌。贝莱斯芽孢杆菌具有抑制霉菌、不抑制乳酸菌的特点，因此贝莱 斯芽孢杆菌组中酵母菌霉菌总数明显低于H₂O处理组，而乳酸菌总数低于原始样品，高 于H₂O处理组。

氨态氮(NH₃-N)以游离氨(NH₃)或铵盐(NH⁴⁺)形式存在于青贮饲料中，两者 的组成比例取决于青贮饲料的pH，当pH偏高时，以游离态形式存在，反之，以铵盐形 式存在。良好品质的青贮料中，氨态氮以氨盐形式存在，但是当青贮饲料腐败严重时， 会闻到刺鼻的氨味。青贮饲料中氨态氮主要是含氮有机物质受植物酶和好氧性细菌作用 的分解的产物。因此，氨态氮的含量可以作为青贮饲料的蛋白质分解程度的指标。氨态 氮与总氮的比值(NH4+-N/TN)是反映青贮饲料中蛋白质及氨基酸分解程度，比值越大， 说明蛋白质分解越多，青贮质量不佳。试验中NH4+-N/TN值按原始样品组、贝莱斯芽 孢杆菌处理组、H₂O处理组依次升高，说明氧气暴露引起了青贮饲料中的蛋白分解，但 经贝莱斯芽孢杆菌处理可以有效减缓，表明菌株贝莱斯芽孢杆菌对青贮饲料有氧稳定性 有保护作用，可延缓青贮饲料在氧气暴露下的保质期。本发明从青贮中找到了一种芽孢 杆菌，可以耐受青贮发酵时高温、高酸的环境，同时能够显著抑制有害微生物的生长， 但不抑制乳酸菌的生长，这样的条件是非常稀少的，不仅保证了青贮发酵过程中乳酸菌 的发酵，而且能够抑制杂菌，保证发酵过程不受杂菌干扰，同时也不会产生有害物质， 也不改变青贮原有的营养价值，具有很好的实用性，可以显著提升青贮发酵的稳定性， 具有很高的商业价值。

附图说明

图1为本发明贝莱斯芽孢杆菌选育及革兰氏染色结果。

图2为本发明贝莱斯芽孢杆菌16S rDNA PCR扩增电泳结果。

图3为本发明贝莱斯芽孢杆菌系统进化发育树。

图4为本发明贝莱斯芽孢杆菌生长特性。

图5为本发明贝莱斯芽孢杆菌的抑菌效果。

图6为本发明16S rDNA的测序结果图。

具体实施方式

以下结合实例对本发明进行详细说明。所有方法及技术，如无特别说明，均为常规方法和技术。

本发明中，青贮饲料由安徽农业大学生物饲料研究室提供。培养基有NA培养 基、LB培养基、PDA培养基、MRS培养基，固体培养基添加琼脂粉20g/L。指示 菌：以大肠杆菌(Escherichia coli，E.coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus，S.aureus)作为致病指示菌；以黑曲霉(Aspergillus niger，A.niger)、尖孢镰 刀菌(Fusariumoxysporum，F.oxysporum)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum，F. graminearum)作为腐败指示菌；以干酪乳杆菌(Lactobacillus casei，Lc)、罗伊氏乳杆 菌(Lactobacillusreuteri，L.reuteri)、屎肠球菌(Enterococcus Faecium，E.Faecium)作 为乳酸菌或益生指示菌。

实施例1

本发明提供一种贝莱斯芽孢杆菌B.V602(Bacillus velezensis B.V 602)，于2022年 4月27日保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No：M2022500。该菌株为在NA琼脂培养基上生长良好，菌落呈乳白色，近圆形、边缘不规则，表面粗糙不透 明，中间隆起，有褶皱。革兰氏染色呈紫红色阳性杆菌，有芽孢。生理生化鉴定结果见 表1。保藏中心的地址：湖北省武汉市武汉大学，邮编：430072，电话：027-68754052。

表1菌株贝莱斯芽孢杆菌生理生化鉴定结果

注：“+”阳性；“-”阴性

实施例2

本实施例提供一种利用贝莱斯芽孢杆菌的筛选选育过程，具体如下：

对菌株进行PCR扩增后，获得大小为1438bp的片段，见图2，将测序结果在 NCBI上进行BLAST比对分析，显示该菌株其与枯草芽孢杆菌基因序列同源性为 99.51％～100％，与Bacillus subtilis strain B.Subtilis(MN093877.1)相似性为100％。选 取Bacillusamyloliquefaciens strain CP28(MH667455.1)作为外类群，取上述序列，与相 似度最接近的10种菌株的16SrDNA，利用MEGA 7.0软件构建系统发育进化树， Bootstraps>1000次进行统计学检验，结果如图3所示，结合菌株形态学观察、生理生 化鉴定结果。

生长特性的测试结果，取平均值，以时间为横坐标，OD₆₀₀值为纵坐标，绘制生长 曲线，结果如图4-A，在0～2h，B.velezensis本发明保藏的芽孢杆菌处于延滞期，菌 体量无明显增长；在2～10h，菌体进入旺盛的对数生长期，菌体量呈现几何型增长； 10～16h，菌体量增长减缓进入稳定期；16h以后，菌体生长进入衰亡期。根据生长曲 线取稳定期菌液，将等量活菌(×10⁵cfu/mL)经不同温度处理12h后，本发明保藏的 芽孢杆菌在不同温度段均能存活，图4-B所示，且在40℃时活菌量显著增加(P< 0.01)；将等量活菌(10⁵cfu/mL)经不同pH处理12h后，本发明保藏的芽孢杆菌在不 同pH条件下均能存活(图4-C)，但当pH＝2时，活菌量为1.45×10³cfu/mL，明显减少 (P<0.01)；且在pH＝6时，活菌量2.63×10⁶cfu/mL显著增加(P<0.01)。结果显示菌 株本发明保藏的芽孢杆菌，生长迅速、适应性强，对pH和温度等适应范围广。

实施例3

本发明保藏的菌株的抑菌试验

抑菌性参照纸片扩散法(K-B法)评估菌株的抑菌能力，取稳定期的供试菌、乳 酸菌、致病菌，用PBS调整菌液浓度至×10⁶cfu/mL；取稳定期霉菌培养基，用含有 0.05％吐温80的无菌生理盐水冲洗孢子并刮取菌丝，制备孢子悬液或菌丝悬液。用无 菌拭子将指示菌混悬液涂布于固体培养基，将致病菌涂布于LB培养基，将腐败菌涂布 于PDA培养基，将乳酸菌涂布于MRS培养基。取干燥的无菌纸片

紧贴于 培养基表面，吸取供试菌液，数次滴加至纸片上，滴加总量为10μL，并做重复组，在 37℃(细菌)或28℃(霉菌)条件下培养24h～3d，观察并记录结果，见表2和图5。

图5中，从左往右依次为：金黄色葡萄球菌、黑曲霉、尖孢镰刀菌、禾谷镰刀 菌；大肠杆菌、罗伊氏乳杆菌、屎肠球菌、干酪乳杆菌。

经抑菌试验验证B.velezensis本发明保藏的芽孢杆菌对本试验所选定的致病菌、腐败菌均有不同程度的抑制作用，而对L.reuteri、E.Faecium、Lc为代表的三株乳酸 菌或益生菌则无抑制作用(表2)。本发明中贝莱斯芽孢对致病菌的抑菌效果从强到弱 依次为F.graminearum>S.aureus>F.oxysporum>E.coli>A.niger。

表2本发明保藏的芽孢杆菌抑菌谱

注：“-”表示阴性，无抑菌作用；不同字母表示差异显著(P<0.05)

实施例4

本发明保藏的菌株的耐受性试验，具体操作方法如下

1)耐乳酸性配制NA培养液，用乳酸调节pH至4，模拟青贮pH条件，经 0.2μm微孔滤膜除菌，调节供试菌液至1×10⁶CFU/mL，按2％接种，分别在静置0、 12、24、36、48h取样进行活菌平板计数，并做重复组。

2)药敏性参照美国临床和试验室标准协会(Clinical and LaboratoryStandards Institute， CLSI)的微量肉汤稀释法操作标准，测定菌株本发明保藏的芽孢杆菌对抗菌药物的敏感 性。采用2倍系列梯度稀释法对欧洲食品安全局(EFSA)规定的芽孢杆菌属必检的8种 抗生素的最小抑制浓度(minimum inhibitory concentration，MIC)进行测定。试验所用 的8种抗生素的浓度范围为(mg/L)：万古霉素(0.25～16.00)；庆大霉素(0.25～32.00)； 红霉素(0.25～16.00)；克林霉素(0.25～8.00)；四环素(0.5～32.00)；氯霉素(1.00～64.00)； 卡那霉素(1.00～64.00)；链霉素(0.25～32.00)。接种菌液的微孔板置于35℃，培养20h 后判定MIC值，根据EFSA规定的用作饲料添加剂的活菌成分对抗生素敏感标准进行 结果判断。

表3本发明保藏的芽孢杆菌在青贮pH中的存活率

注：不同字母表示差异显著(P<0.05)。

由表3可知，在模拟青贮pH＝4的条件下，24h内本发明保藏的芽孢杆菌存活率为100％，并且活菌数显著增加(P<0.05)；36h～48h内活菌数量降低，但与起始时活菌 数无显著差异(P>0.05)，存活率超97％，表明该菌株具有较强的耐乳酸特性。结合 菌体生长曲线，本发明保藏的芽孢杆菌在6h后进入衰亡期，在pH＝4的条件下，本发 明保藏的芽孢杆菌在24h时活菌数仍在增加，但活菌数与12h时差异不显著(P> 0.05)，推测在该条件下延长了本发明保藏的芽孢杆菌的稳定期，36h后培养基中营养 物质消耗殆尽，菌体进入衰亡期，活菌数减少，但在48h略有上升但无差异(P> 0.05)，实验表明本发明保藏的芽孢杆菌可耐受青贮酸性环境，并在其中增殖，为其抑 制腐败菌特性的发挥奠定了重要基础。

抗生素耐受性

菌株本发明保藏的芽孢杆菌药敏试验结果如表4所示。从表4中可以看出，对菌 株本发明保藏的芽孢杆菌来说，EFSA规定的用作饲用活菌添加剂的芽孢杆菌必检的8 种抗生素其MIC值均低于该局限定值，为相应抗生素的敏感菌株，符合EFSA对拟用 作饲料添加剂活菌成分的药物敏感性判断标准。

表4菌株本发明保藏的芽孢杆菌的抗生素敏感试验结果

注：S敏感

实施例5

根据本发明保藏的芽孢杆菌的特性，刚好可以用于青贮饲料的发酵，青贮饲料是一 类饲料，由含水分多的植物性饲料经过密封、发酵后而成，主要用于喂养反刍动物。青贮饲料比新鲜饲料耐储存，营养成分强于干饲料。

取发酵成熟的新鲜青贮饲料，随机分为等量三组：第一组，按样品∶菌液＝100g∶2mL，添加OD₆₀₀＝1.0的本发明保藏的芽孢杆菌菌悬液，充分混合，作为为试验组；第 二组，以等量无菌水为对照组；第三组，作为原始样本组存放于-20℃。将一、二组用 保鲜膜覆盖，置于恒温恒湿(28℃，75％RH)环境中培养，每12h暴露于空气中，无 菌玻璃棒充分搅拌5min，于第10天进行取样检测，并与原始样本组进行比较。

采用MRS平板进行乳酸菌计数，将接种好的平板置于37℃、厌氧环境中培养3d 后计菌落数；采用孟加拉红平板进行酵母菌、霉菌计数，将接种好的平板置于28℃环 境中培养3d后计菌落数；采用酸度计法测定青贮饲料pH；采用凯氏定氮法测定青贮 饲料中的氨态氮(NH4⁺-N)和总氮(TN)含量，采用范氏(Van Soest)洗涤纤维分析 法，测定中性洗涤纤维(NDF)和酸性洗涤纤维(ADF)，根据青贮饲料感官评价表对 青贮料进行评价。

通过微生物量、营养品质、感官评分三个维度来评价本发明保藏的芽孢杆菌对青贮饲料品质的影响从而确定其对青贮熟料的氧稳定性的影响，结果如表5所示。

与原始样品相比，本发明保藏的芽孢杆菌处理组中酵母菌霉菌总数、pH显著增大(P<0.05)，乳酸菌总数、感官得分显著降低(P<0.05)，而NH4+-N、TN、NDF、 ADF、水分等指标在不同程度上有所增减但并无显著差异(P>0.05)；H₂O处理组 中，除NDF、ADF、水分三个指标外，均和原始样品组及本发明保藏的芽孢杆菌处理 组存在显著差异(P<0.05)，其中酵母菌霉菌总数、NH4+-N含量、pH均最大，而乳 酸菌总数、TN、感官得分均为最低。结果表明本发明保藏的芽孢杆菌可有效延长青贮 饲料的有氧稳定性。而其他芽孢杆菌会抑制乳酸菌生长，无法达到乳酸菌发酵的目 的。

经过发明人的测试，当OD₆₀₀＝1.0时，芽孢杆菌菌悬液的添加量为1～5％(V/m) 均可以抑制有害微生物的生长，经过测算，其中的孢子浓度为1×10⁶～6×10⁵之间。

表5本发明保藏的芽孢杆菌处理对青贮饲料品质的影响

注：不同字母表示差异显著(P<0.05)；青贮感官等级评定标准：8～10分为优良，5～7 分为中等，0～4分为劣质。

表6青贮饲料感官评价表

Claims (5)

1.一种贝莱斯芽孢杆菌，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No:M2022500。

2.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的用途，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌用于在乳酸菌发酵的环境中抑制有害微生物生长。

3.一种权利要求1所述的贝莱斯芽孢杆菌的用途，其特征在于：所述贝莱斯芽孢杆菌用于青贮防腐。

4.一种乳酸菌发酵青贮的防腐方法，其特征在于，所述乳酸菌发酵青贮的防腐的方法为在添加乳酸菌发酵青贮时或发酵完成后添加贝莱斯芽孢杆菌，所述贝莱斯芽孢杆菌保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏号为：CCTCC No:M2022500。

5.根据权利要求4所述的乳酸菌发酵青贮的防腐方法，其特征在于，所述贝莱斯芽孢杆菌的添加量为1~5%（V/m）。

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