CN102851233A - 一株耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1及其应用。本发明所述乳酸菌保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.6078，保藏日期为2012年5月3日。本发明所述乳酸菌为格兰氏染色阳性杆菌，为葡萄糖同型发酵，耐酸，生长速度快，生育温域宽，在低温或常温环境下可显著改善青贮饲料的发酵品质。

Description

一株耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1及其应用

技术领域

本发明涉及微生物应用和饲料调制加工领域，具体涉及一株耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1及其在青贮饲料调制中的应用。 

背景技术

青贮饲料是在厌氧和酸性环境下长期贮存的新鲜牧草、饲料作物等多水分饲料。近年来，随着我国奶牛业的快速发展，青贮饲料的生产量在迅速增长，2003年全国青贮饲料的生产量就已超过了2亿吨(中国奶业协会，2003)。可见青贮饲料的生产、利用对畜牧业生产，特别是高产奶牛来说具有非常重要的意义。它既能保证奶、肉产品的数量与品质，又可节约饲用粮食，另外通过青贮还可使粗糙或带异味而不易直接饲用的植物材料，以及不易干燥的高水分饮料、食品加工副产物等得到充分利用，提高生物资源的利用、转化效率(内田，1999；曹致中，2005)。 

实际操作中，青贮饲料的发酵品质受多种因素的影响，其中乳酸菌在调制青贮饲料中起主导作用。乳酸菌为革兰氏阳性菌，抗过氧化氢酶，厌氧，无孢子，无运动性。在青贮过程中，可促进乳酸发酵，提高青贮发酵品质，减少营养损失。当青贮窖密封后，厌氧微生物可以快速繁殖，如果条件适宜，乳酸菌将快速酸化环境，当pH下降到一定程度时，与其竞争的有害微生物将不能生存，这样便得到稳定的青贮饲料。反之，不良微生物快速生长，导致青贮饲料腐败或品质下降。乳酸菌是青贮发酵的关键菌，如果材料本身附着的乳酸菌数量较少，或乳酸菌数量虽多，但品质不优(乳酸菌活力较弱)或不耐特殊环境(如低温)，就很难获得优质青贮饲料。 

青贮时添加甲酸等酸类化学物质，可以直接降低pH，改善青贮料的发酵品质，但因成本高、腐蚀性强、作业不安全等因素，在生产中难以利用。改善青贮饲料发酵品质的乳酸菌添加剂在市场上也比较多，但一股没有考虑到低温条件，或在低温环境下改善效果不明显。 

发明内容

本发明的目的在于根据现有技术中存在的上述不足，提供一株耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1。 

本发明另一目的在于提供上述耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1的应用。 

本发明上述目的通过以下技术方案予以实现： 

一株植物乳杆菌Lactobacillus plantarum （CCZZ1），保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.6078，保藏日期为2012年5月3日。 

本发明耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1的生物学特性为革兰氏染色阳性杆菌，葡萄糖异型发酵，耐酸性强(在pH3.8可以正常生长)，生长速度快(MRS培养基培养24小时pH可降到4.0以下)，生育温域宽(10-45℃可正常生长)，耐10℃低温。 

本发明耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1的获得方法是：富集培养该菌，稀释平板法筛选获得：将装有500mL蒸馏水的锥形瓶、装有9mL蒸馏水的试管、MRS固体培养基及平板灭菌，灭菌后再将MRS培养基倒入平板内。无菌条件下，取10g青贮40天的玉米样于塑料袋内，再加入90mL灭菌蒸馏水振荡均匀，使其终浓度为100g·L^-1，然后再取稀释后样品1mL加入含有9mL灭菌蒸馏水的试管振荡均匀，使其终浓度为10g·L^-1，此时取该液体0.03mL反复进行平板划线分离，直至得到单菌落，将单菌落用接种针插入含有MRS固体培养基的试管中心，于4℃冰箱内保存。其中MRS培养基为：蛋白胨(Proteose peptone NO.3)10.0g；牛肉膏(Beef extract)10.0g；酵母提取物(Yeast extract)5.0g；葡萄糖(Dextrose)20.0g；吐温(Polysorbate 80)1mL；柠檬酸铵(Ammonium citrate)2.0g；醋酸钠(NaAc)5.0g；硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.1g；硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)0.05g；磷酸氢二钾(K₂HPO₄)2.0g；蒸馏水(H₂O)1000mL，固体培养基再加15g/L琼脂(Agar)，121℃，灭菌20min。 

本发明从90株乳酸菌中，用生理生化方法筛选出耐低温、耐酸及生长速度快的乳酸菌CCZZ1。提取乳酸菌CCZZ1全长基因，然后运用PCR扩增引物25f(SEQ ID NO：1)和1492r(SEQ ID NO：2)(Hurek et al，1997)，扩增出16S rDNA基因，在NCBI上对比相关序列，确定其相似菌种。最后，将筛选出的菌株及对照菌分别添加到不同饲草中，并将其放于低、常温环境中青贮，开封后分析青贮发酵品质并进行对比，确认CCZZ1可以显著提高低/常温环境下青贮饲料的发酵品质。 

本发明耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1可以用于调制青贮饲料。具体方法为： 

(1)将待发酵饲料切断混合均匀；

(2)每千克待发酵饲料加入Lactobacillus plantarum CCZZ1 1.0×10⁸个以上；

(3)将饲料真空密封后贮藏。

作为一种优选方案，步骤(1)所述待发酵饲料切断至1～2cm。 

作为一种优选方案，步骤(3)所述的贮藏温度为10～45℃，pH值为3.75～9.0。 

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果： 

(1)本发明利用微生物改善青贮饲料的发酵品质，成本低，安全，可靠，易于利用。

(2)本发明菌株可在我国各地使用，特别是低/常温环境下效果独特，克服了因乳酸菌数量不足或耐低温乳酸菌较少造成青贮饲料发酵不佳的问题。 

(3)本发明使用的植物乳杆菌菌株Lactobacillus plantarum CCZZ1在低/常温环境下比现有乳酸菌添加剂效果更佳。 

具体实施方式

以下结合实施例来进一步解释本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。 

实施例1筛选耐低温优良乳酸菌 

从王草、柱花草、玉米、野生稻等材料上分离乳酸菌菌株90株，进行革兰氏染色和细胞形状观察，并根据生育温度(10、15、20、25、30、35、40、45、50℃)和生育pH(3.5、3.75、4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0)等实验筛选出耐低温、耐酸及生长速度快的乳酸菌CCZZ1。结果表明，CCZZ1菌株为革兰氏阳性，同型发酵的杆菌，在10℃和pH3.75条件下皆可生长，具有较强的耐低温、耐酸性，可发酵大多数糖类(表1)。

表1菌株CCZZ1的特性 

菌株	CCZZ1
		来源	玉米
形状	杆状
		革兰氏染色	+
发酵类型	同型
		生育温度
10℃	+
		15℃	++
45℃	+
		50℃	-
生育pH值
		3.50	-
3.75	±
		4.00	++
8.50	+
		9.00	±
发酵糖类
		L-阿拉伯糖	+
核糖	+

 

半乳糖	+
		D-葡萄糖	+
D-果糖	+
		D-甘露糖	+
甘露醇	+
		山梨醇	+
α-甲基-D-甘露糖苷	+
		N-乙酰葡萄糖胺	+
杏仁苷	+
		熊果苷	+
七叶灵	+
		水杨苷	+
纤维二糖	+
		麦芽糖	+
乳糖	+
		海藻糖	+
蜜二糖	+
		松三糖	+
D-蜜三糖/棉籽糖	+
		D-松二糖	+

乳酸菌CCZZ1的生理生化试验、培养基及其配制的方法如下所述：

1)革兰氏染色、发酵类型及形状观察参照东秀珠主编的《常见细菌系统鉴定手册》。

2)乳酸菌生长pH调节使用4mol/L NaOH和4mol/L HCl。 

3)糖发酵采用API 50CHL(bioMérieux，l’Etoile，France)分析。 

4)培养基 

1.MRS培养基(用于乳酸菌的培养)：

蛋白胨(Proteose peptone NO.3)10.0g；牛肉膏(Beef extract)10.0g；酵母提取物(Yeast extract)5.0g；葡萄糖(Dextrose)20.0g；吐温(Polysorbate 80)1mL；柠檬酸铵(Ammonium citrate)2.0g；醋酸钠(NaAc)5.0g；硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.1g；硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)0.05g；磷酸氢二钾(K₂HPO₄)2.0g。将上述试剂溶解，用蒸馏水定容至1000mL，固体培养基再加15g/L琼脂(Agar)，121℃灭菌20min。

2.API 50CHL培养基： 

蛋白胨(Proteose peptone NO.3)10.0g；酵母提取物(Yeast extract)5.0g；吐温(Polysorbate 80)1mL；醋酸钠(NaAc)5.0g；柠檬酸铵(Ammonium citrate)2.0g；硫酸镁(MgSO₄·7H₂O)0.2g；磷酸氢二钾(K₂HPO₄)2.0g；硫酸锰(MnSO₄·4H₂O)0.05 g；溴甲酚紫(Bromcresol purple)0.17g。将上述试剂溶解，用蒸馏水定容至1000mL，分装在15mL的试管中，每试管10mL，121℃灭菌20min。

实施例2乳酸菌的鉴定 

菌株在5mL的MRS培养基中37℃培养过夜，菌液移入1.5mL的离心管中，10000rpm/min离心3min～5min收集菌，用TE0.1(10mmol/L Tris-HCl，0.1mmol/L EDTA，pH 8.0)清洗两次，再用TIANamp Bacteria DNA Kit(TIANGEN BIOTECH CO.，LTD，Beijing，China)试剂盒提取DNA，在OD600nm处检测其吸光值。然后，进行PCR扩增，16S rDNA的扩增引物为25f(SEQ ID NO：1)和1492r(SEQ ID NO：2)，RCR反应为95℃(5min)-94℃(30s)-55℃(1min)-72℃(1.5min)-72℃(10min)，其中94℃(30s)-55℃(1min)-72℃(1.5min)反应循环30次。扩增产物送博尚生物科技有限公司(中国)测序，结果在NCBI的基因库中比对，找出与此菌亲缘相近的标准菌株植物乳杆菌IMAD 80188(Lactobacillus plantarum IMAD 80188)、瑞士乳杆菌IMAU 10104(L.helveticus IMAU10104)等，用DNAman软件分析，将筛选菌株的16S rDNA的部分序列(约1400bp～1500bp)与标准菌进行相似度分析，CCZZ1与植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)相似度超过99％，应为同一种。

实施例3添加到青贮饲料中的效果 

以轻度预干(预干是指晾晒，以降低水分含量)和未预干的黑麦草为材料进行了青贮添加试验。黑麦草切短至1cm～2cm，混合均匀，每kg新鲜材料加入菌株CCZZ1约1.0×10⁸个。添加菌株CCZZ1后的黑麦草饲料装入30cm×20cm的聚乙烯青贮袋，每个处理装3袋，每袋约200g，用真空密封机(SINBO Vacuum Sealer，Hong Tai Home Electrical Appliance Co.Ltd.)抽气、密封，置于15℃贮藏30d。

水稻切短至1～2cm，混合均匀，每kg新鲜材料加入菌株CCZZ1约1.0×108个。添加菌株CCZZ1后的水稻饲料装入30cm×20cm的聚乙烯青贮袋，每个处理装3袋，每袋约200g，用真空密封机抽气、密封，置于常温(25℃-30℃)贮藏30d。 

表2青贮前饲草的化学及微生物成分 

项目	未预干黑麦草	预干黑麦草	水稻
				干物质(％)	16.37	30.03	50.73
粗灰分(％DM)	9.86	10.28	10.04
				可溶性碳水化合物(％DM)	13.7	12.39	11.16
粗蛋白(％DM)	14.36	14.87	6.19
				粗脂肪(％DM)	4.13	3.12	2.11
粗纤维(％DM)	-	-	-

 

中性洗涤纤纤维(％DM)	53.98	50.35	59.80
				酸性洗涤纤维(％DM)	32.14	29.95	34.22
pH值	6.13	6.02	5.88
				缓冲能(mE/kgDM)	233.6	213.9	118.2
氨态氮(％TN)	2.7	4.9	1.60
				乳酸菌(1gcfu/g FM)	4.4	4.2	7.34
好气性细菌(1g cfu/g FM)	7.5	7.9	7.99
				酵母菌(1g cfu/g FM)	5.4	5.6	6.32
霉菌(1g cfu/gFM)	4.2	4.4	5.75

DM：干物质；FM：鲜物质；lg：数据以10为底取对数；cfu/g：菌落形成单位。

在15℃低温条件下，同青贮宝商品菌剂一样，CCZZ1菌株也使新鲜黑麦草青贮料的pH、氨态氮含量、好气性细菌和酵母菌数量显著降低(P＞0.05)，乳酸含量显著增加(P＞0.05)，明显改善了低温条件下新鲜黑麦草的青贮发酵品质。经过预干(水分含量70％)的黑麦草，添加菌株CCZZ1的青贮料，其pH及氨态氮含量显著低于对照组及在我国普遍使用的商品乳酸菌添加剂(P＞0.05)，提高了预干黑麦草的发酵品质。在新鲜/预干黑麦草青贮饲料中，CCZZ1菌株均明显降低青贮料中氨态氮的含量，且效果优于商品菌剂。 

表315℃条件下添加乳酸菌CCZZ1对黑麦草青贮发酵品质的影响 

^a-d表示同一列数据的差异(P＜0.05)；DM：干重；cfu/g：菌落形成单位；TN：总氮；CCZZ1-Lactobacillus plantarum CCZZ1。

在水稻青贮中，添加CCZZ1，对全株水稻的青贮指标均有显著改善，可显著降低pH值、氨态氮含量及酵母菌、好气性细菌数量(P＞0.05)，增加乳酸菌数量(P＞0.05)。与水稻用商品添加剂相比，添加CCZZ1的青贮料具有较低的pH，其乳酸含量和乳酸乙酸比显著高于商品添加剂(P＞0.05)(表4)。可见，CCZZ1对全株水稻的添加效果不仅优于对照，在某些指标上也比现有的水稻专用乳酸菌添加剂好。 

表4添加乳酸菌对水稻青贮发酵品质的效果(25℃-30℃) 

^a-c表示同一列数据的差异(P＜0.05)；未检测到丙酸和丁酸；DM：干重；cfu/g：菌落形成单位；TN：总氮；CCZZ1-Lactobacillus plantarum CCZZ1。

以上结果表明，CCZZ1菌株在低/常温条件下显著优于现有商品菌剂，即使在高水分的黑麦草青贮条件下，也具有与商品菌剂同样或以上的效果。 

营养成分及青贮发酵指标测定方法如下： 

1)新鲜材料营养成分及微生物分析：干物质(DM)含量采用70℃干燥法测定，粗蛋白含量采用凯氏定氮法测定(定氮仪KDN-103F，上海纤检仪器有限公司)，粗纤维、中性洗涤纤维含量采用滤袋法测定，粗脂肪含量采用残余法测定(SLF-06，杭州托普仪器有限公司)，粗灰分含量采用灼烧法测定(2003，张丽英)。可溶性碳水化合物(Water soluble-carbohydrates，WSC)含量采用蒽酮-硫酸法测定(1996，韩雅珊)，氨态氮含量用凯氏定氮仪直接蒸馏测定，缓冲能采用盐酸、氢氧化钠滴定法测定，乳酸菌、细菌、酵母菌和霉菌数量分别采用MRS(de-Man Rogosa Sharpe)琼脂培养基、营养琼脂培养基(Nutrient ager，广东环凯微生物有限公司)、马铃薯葡萄糖琼脂培养基(Potato-dextrose agar，广东环凯微生物有限公司)计数(1996，McDonald P.)。乳酸菌用厌氧箱37℃培养2d～3d；细菌、酵母菌、霉菌用生化培养箱30℃培养2d～4d。

2)发酵品质分析：青贮袋开封后，取20g混匀的青贮料放入聚乙烯塑料封口袋中，加入80mL蒸馏水，在4℃下浸泡18h后过滤，用pH计(PHS-3B，上海鹏顺科学仪器有限公司)测定浸提液pH值。乳酸菌、细菌、酵母菌和霉菌数量测定同鲜样相同，有机酸含量采用岛津LC-20AT型高效液相色谱仪测定：色谱条件：色谱柱(KC-811)，流动相为3mmol/L的HClO₄液，流速1mL/min，柱温60℃，检测波长210nm。 

名称：一株耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1及其应用

申请人：华南农业大学

 

SEQ ID NO:1  25f      

AAC TGA AGA GTT TGA TCC TGG CTC

 

SEQ ID NO:2 1492r

TAC GGC TAC CTT GTT ACG ACT

Claims (5)

1.一株耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1，其特征在于保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地点为北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCC NO.6078，保藏日期为2012年5月3日。

2.权利要求1所述耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1在调制青贮饲料中的应用。

3.根据权利要求2所述应用，其特征在于包括如下步骤：

（1）将待发酵饲料切断混合均匀；

（2）每千克待发酵饲料加入耐低温乳酸菌Lactobacillus plantarum CCZZ1 1.0×10⁸ 个以上；

（3）将饲料真空密封后贮藏。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤（1）所述待发酵饲料切断至1~2cm。

5.根据权利要求3所述的应用，其特征在于步骤（3）所述的贮藏温度为10~45℃，pH值为3.75~9.0。