CN104073455A - 一株具有降低胆固醇能力的植物乳杆菌 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一株从青藏高原传统发酵牦牛酸奶中分离出的具有降低胆固醇能力的植物乳杆菌，保藏号为CGMCC No.9017，能够显著降低总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的含量，能够应用于发酵乳制品的制备以及保健食品和药品的制备。

Description

一株具有降低胆固醇能力的植物乳杆菌

技术领域

本发明涉及生物技术领域，尤其涉及功能性乳酸菌开发与应用领域，特别是指一株具有降低胆固醇能力的植物乳杆菌。 

背景技术

随着社会发展人民生活水平不断提高，日常饮食结构也在不断变化。不合理的膳食结构所带来的负面影响是冠心病、高血压、动脉粥样硬化等心脑血管疾病的发病率不断提高。而血清中胆固醇的含量被认为是诱发心脑血管疾病的主要因素。 

胆固醇是人体必不可少的营养成分。对人体而言，胆固醇可以合成多种激素；形成胆酸，促进脂肪的消化；构成细胞膜；并有助于血管壁的修复与保持完整功能。正常成年人血液中胆固醇含量在2.82～5.95mmol/L。胆固醇是非水溶性物质，在血液中常结合低密度脂蛋白和高密度脂蛋白进行转运。低密度脂蛋白的功能是将肝脏中合成的胆固醇转运到外围组织，该指标超标意味着过多的胆固醇存在于血液循环之中，血脂升高，造成动脉粥样硬化。流行病学证实，这是发生动脉硬化最主要的危险因素。高密度脂蛋白的主要功能是运载胆固醇离开细胞回到肝脏，然后经肝脏转化为其它物质。高密度脂蛋白可防止胆固醇在血管壁的沉积，以维系血液中胆固醇的动态平衡，被认为是抗动脉硬化因子。 

益生菌在自然界中分布广泛，是一种可以通过改善肠道微生物的平衡，来对宿主产生有益影响的微生物。目前应用最为广泛的益生菌是乳杆菌和双歧杆菌等，它们是人体肠道内重要的生理菌，对机体有多种生理作用。益生菌可以调整肠道菌群平衡，提高蛋白质和维生素的代谢，产生抗菌素来抑制有害菌群生长，抗肿瘤，增强免疫力，降低血清胆固醇，抗氧化延缓衰老等。因此将益生菌应用于功能性食品开发具有重要意义。但是，现用的乳酸菌的降胆固醇能力较低，例如，尹军霞等(2008)从发酵蔬菜汁中分离出一株降胆固醇能力较好的乳酸乳球菌，体外降胆固醇能力达到47.58％。陆晓娜 等(2006)从新疆马奶酒中分离出了10株降胆固醇能力最强的乳酸菌，降解率最强的为61.7％。居华(2007)从酸奶中分离得到了一株植物乳杆菌，该菌株对化合物源的胆固醇清除率为48.1％，而对蛋黄源胆固醇的清除率为58.22％。此外还有从发酵肉、蔬菜等食品上分离的降胆固醇乳酸菌的报道，但是降解率都不高，在食品保健品及药品上的应用价值不高。 

因此，筛选出具有高降胆固醇能力的乳酸菌株，对于增强人体的免疫力、降低胆固醇以及维持人体的健康具有十分重要的意义。 

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种高原植物乳杆菌，具有高降血清胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白及肝脏脂肪沉积等的作用。 

为实现上述目的，本发明从青藏高原传统发酵牦牛酸奶中筛选乳酸菌，步骤如下： 

(1)从青藏高原传统发酵牦牛酸奶中分离乳酸菌菌株，并纯化，得到纯分离的菌株，命名为菌株Lp5； 

(2)通过过氧化氢酶实验、革兰氏染色、菌体形态和16SrRNA序列分析，鉴定步骤(1)得到所述菌株Lp5为植物乳杆菌； 

(3)通过领苯二甲醛比色法测定步骤(2)鉴定出的所述菌株Lp5的降胆固醇特性。 

本发明所述具有降低胆固醇能力的植物乳杆菌Lp5(拉丁文命名为Lactobacillus plantarum)已于2014年4月3日保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，保藏编号为CGMCC No.9017。 

本发明提供上述具有降低胆固醇能力的植物乳杆菌具有良好的人工胃液、肠液的耐受性和细胞疏水性，并对维持肠道微生物菌群平衡具有一定作用。能够应用在制备发酵乳制品及保健食品和药品中。 

本发明提供上述具有降低胆固醇能力的植物乳杆菌降解胆固醇的能力非常强，远远高于现有的菌株，而且具有良好的人工胃液，人工肠液耐受性和细胞疏水性，能够广泛应用在食品和保健品中，可以降低血清胆固醇，提高机体免疫力。 

附图说明

图1为本发明实施例5中SD大鼠粪便中大肠杆菌数量变化对比图； 

图2为本发明实施例5中SD大鼠粪便中乳杆菌数量变化对比图； 

图3为本发明实施例5中SD大鼠粪便中双歧杆菌数量变化对比图； 

图4为本发明实施例5中SD大鼠第八周血清总胆固醇含量对比图； 

图5为本发明实施例5中SD大鼠第八周甘油三酯含量对比图； 

图6为本发明实施例5中SD大鼠第八周低密度脂蛋白含量对比图； 

图7为本发明实施例5中SD大鼠第八周高密度脂蛋白含量对比图； 

图8为本发明实施例5中空白对照组SD大鼠肝脏组织切片图； 

图9为本发明实施例5中高胆固醇组SD大鼠肝脏组织切片图； 

图10为本发明实施例5中高胆固醇+乳杆菌Lp5组SD大鼠肝脏组织切片图。 

具体实施方式

为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明进一步详细说明。 

实施例1本发明所述具有高降胆固醇能力的植物乳酸杆菌Lp5的筛选和鉴定 

一、样品来源 

来源于我国青海省果洛藏族自治州传统发酵牦牛乳制品。 

二、从传统牦牛乳制品中分离筛选得到乳酸菌 

取1ml发酵牦牛乳制品按1:10比例，用灭菌生理盐水稀释，此为10^-1稀释度。然后吸取1ml上述稀释液，再10倍稀释，为10^-2稀释度，以此类推。选取10^-6稀释度，吸取100ul稀释液于SL培养基，37℃厌氧培养48小时，挑取特征菌落，并进一步纯化，得到纯分离的菌株，命名为Lp5。 

三、对菌株进行鉴定 

(1)革兰氏染色、过氧化氢酶实验 

革兰氏染色：挑取平板上的菌落进行涂片、固定、结晶紫初染、碘液媒染、酒精脱色、番红复染、干燥、油镜镜检。蓝紫色为革兰氏阳性菌，红色为革兰氏阴性菌。 

过氧化氢酶实验：将菌以划线的方式接种到PYG斜面培养基上37℃条件下培养48h后，先将菌苔在空气中暴露30min，滴加3％-15％(体积分数)过 氧化氢，2-3分钟后观察有气泡产生的为阳性，无为阴性。 

该菌株革兰氏染色为阳性，过氧化氢酶实验为阴性，可初步视为乳酸菌。 

(2)16SrRNA鉴定 

纯化后的乳酸菌在MRS培养基中培养8h后，10000rpm/min离心3-5min收集菌体，按照试剂盒使用方法提取DNA。然后进行PCR扩增，在细菌的通用引物27F和1492R(Monis et al,2005)的扩增下，进行16SrRNA的扩增。扩增条件：95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min30s；72℃5min，30次循环。PCR产物送上海美吉生测序公司进行序列分析。将测得乳酸菌菌株16S rRNA基因序列用BLAST(http：//wwwncbi.nlm.nih.gov/blast/)在GenBank中搜索，与待测菌株同源性最高的已知分类地位的菌种初步确定待测菌株的种属。利用16S rRNA基因序列同源性分析的方法进行鉴定，基因序列与植物乳杆菌比对，发现与植物乳杆菌的同源性为100％，结合生理生化特征，鉴定菌株Lp5为植物乳杆菌。 

实施例2降胆固醇能力的测定和对比 

调整植物乳杆菌Lp5菌的数量至1.0×10⁹cfu/mL，按照1％的接种量接种于10ml含有胆固醇50mg/ml的MRS液体培养基里，37℃静置培养。摇匀后立即取样1mL,4000rpm/min离心5min，吸取上清液0.5mL，用邻苯二甲醛法测定胆固醇含量。接种后发酵液于37℃静置培养48h后用同样的方法测定上清液中胆固醇含量。采用如下公式计算胆固醇的降解率： 

胆固醇降解率＝(0h上清液中胆固醇含量－48h上清液中胆固醇含量)/0h上清液中胆固醇含量×100％ 

表1植物乳杆菌L_p5降胆固醇率 

本发明所筛选的植物乳杆菌Lp5对胆固醇的降解率为72.59％，高于现有文献报道的植物乳杆菌或其他乳酸菌菌种对胆固醇的降解程度。 

实施例3：消化道模拟试验 

将挑选的植物乳杆菌Lp5进行人工胃液，人工肠液耐受性实验。 

对人工胃液耐受性测定：菌体活化2代后种子液5000r/min离心10min，灭菌生理盐水洗涤3次后悬浮。取菌悬液l mL于过滤除菌的人工胃液 中(含pH3.0人工胃液9mL)，混匀后37℃恒温静置培养。在实验一开始和3h后分别取样，灭菌生理盐水10倍稀释。选取适当稀释度，取0.l mL菌悬液于MRS平板中涂布，设2个重复。37℃厌氧恒温培养48h后计数。试验结果见表2。 

对人工肠液耐受性测定：取lmL处理3h的含菌人工胃液，接种于9mL除菌的人工肠液中，人工肠液pH8.0。37℃恒温静止培养，在试验开始0h、3h、6h分别取样，灭菌生理盐水适当稀释，选取适当稀释度涂布，方法同上。37℃厌氧恒温培养48h后计数。用平板计数法测定活菌数，计算其存活率(％)。试验结果见表3。 

存活率(％)＝lgN/lgN₀×100％(N——消化一定时间后消化液中活菌数；N₀——消化0h的活菌数。) 

实验结果表明植物乳杆菌Lp5具有良好的耐胃液肠液的能力。 

表2.植物乳杆菌Lp5在pH3人工胃液中消化3h存活率 

表3.植物乳杆菌Lp5在pH9人工肠液中消化6h存活率 

实施例4：疏水性试验 

细胞表面疏水性检测方法：试验植物乳杆菌Lp5在液体MRS培养基37℃培养16-18h，收集菌体(5000rpm×15min离心)，用0.1mol KNO₃(PH6.2)洗涤两次后，用该溶液悬浮菌液，在600nm处测量其初始吸光度A₀。再吸取菌悬液3ml，加入1ml二甲苯，室温预培养10min涡流快速混合2min，室温静止放置15min使之分层，小心用无菌移液管移取下层水相，以缓冲液为空白对照，在600nm测量最终吸光度A并进行记录。试验做3组重复。试验结果见表4。 

乳酸菌细胞的表面疏水率的计算：细胞表面疏水性(H％)＝(A₀－A)/A₀×100％，其中A₀和A分别是与二甲苯混匀前、后菌液在600nm下测量得到的 吸光值。疏水性与菌体的粘附性呈正相关，即疏水性越高粘附性越好。实验结果表明植物乳杆菌Lp5具有良好的疏水性。 

表4植物乳杆菌Lp5对二甲苯疏水性 

实施例5：SD大鼠体内试验 

(1)实验动物及分组 

实验使用5周龄雄性SD大鼠30只，体重范围118.7-133.7g，平均值为126.6g。每只分别喂养于单独隔离的鼠笼，室温维持在23±2℃，相对湿度为55±5％，并且定时12小时光照和12小时黑暗。饲料和水由老鼠自由取食。SD大鼠在第一周适应期间所喂食饲料购自北京科澳协力饲料有限公司。适应一周后，将大鼠随机分为3组，每组10只，组别如下： 

C：空白对照组，此组SD大鼠喂食基础普通饲料(购自北京科澳协力饲料有限公司) 

HC：高胆固醇组，此组SD大鼠喂食高胆固醇饲料(添加1.25％胆固醇和0.3％胆酸钠)(购自江苏美迪森生物科技有限公司) 

HL：高胆固醇+植物乳杆菌Lp5组，此组SD大鼠喂食高胆固醇饲料，并且每天灌胃1ml乳酸菌菌液，菌数在1×10¹⁰CFU/ml 

(2)实验内容 

每周记录大鼠体重，采集新鲜粪便，用无菌生理盐水适当稀释涂布于LBS、BSM、EMB三种培养基，37℃厌氧培养48h后计数，结果见图1、2、3。结果显示饲喂高脂饲料以后对大鼠粪便中各大肠杆菌、乳杆菌和双歧杆菌数量有一定影响，但是喂食植物乳杆菌Lp5组大鼠粪便中各菌数量与普通饲料组大鼠没有明显区别。 

实验进行8周后，将大鼠禁食12h后乙醚麻醉，心脏采血2ml放入4℃冰箱。此外，将肝脏、脾脏、肾脏取出用生理盐水冲洗并擦拭干净后称重，计算脏器指数，结果见表5。结果表明饲喂植物乳杆菌Lp5对大鼠没有明显毒副作用，且可以减少脂肪在肝脏组织内的沉积。 

表5大鼠各脏器指数比较 

注：^abc表示相应指标间存在的差异显著性，同列数据上标字母不同表示差异显著(P<0.05)，字母相同表示差异不显著(P>0.05)。 

最后切取肝脏组织块(1cm×1cm)放入10％甲醛溶液中固定。 

(3)血清样品制备及胆固醇各指标分析 

采集到的血液样品放置于4℃冰箱过夜，低温低速离心取上层淡黄色液体，立即冷冻于-20℃冰箱，直到测定胆固醇各指标。 

血清样品中总胆固醇含量、甘油三酯含量、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白四个指标，均利用市售相应指标的常规试剂盒来测定，结果见图4、5、6、7。结果表明植物乳杆菌Lp5可以显著降低大鼠血清中总胆固醇、甘油三酯、低密度脂蛋白的含量，但是对高密度脂蛋白的含量没有明显改变。 

(4)肝脏组织病理学切片 

固定好的肝脏组织进行石蜡包埋、切片、固定、HE染色等步骤得到肝脏组织病理学切片，在40倍光学显微镜下观察切片，结果见图8、9、10。结果表明植物乳杆菌Lp5可以有效减少肝脏细胞的脂肪浸润。 

本发明提供的菌株植物乳杆菌Lp5可以起到显著降低胆固醇的功效，具有良好的人工胃液、肠液的耐受性和细胞疏水性，并对维持肠道微生物菌群平衡具有一定作用。本发明提供的菌株植物乳杆菌Lp5的上述特性使其能够应用于制备发酵乳制品及制备保健食品和药品中。 

所属领域的普通技术人员应当理解：以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。 

Claims (4)

1.一种具有降低胆固醇能力的植物乳杆菌，保藏编号为CGMCCNo.9017。

2.一种权利要求1所述的植物乳杆菌的筛选鉴定方法，其特征在于，包括以下步骤：

(1)从青藏高原传统发酵牦牛酸奶中分离乳酸菌菌株，并纯化，得到纯分离的菌株；

(2)通过过氧化氢酶实验、革兰氏染色、菌体形态和16SrRNA序列分析，鉴定步骤(1)得到所述菌株为植物乳杆菌；

(3)通过领苯二甲醛比色法测定步骤(2)鉴定出的所述植物乳杆菌的降胆固醇特性。

3.权利要求1所述的具有降低胆固醇能力的植物乳杆菌在制备发酵乳制品中的应用。

4.权利要求1所述的具有降低胆固醇能力的植物乳杆菌在制备保健食品和药品中的应用。