CN115927116B

CN115927116B - 一种具有降甘油三酯、降胆固醇、减脂的发酵乳杆菌菌株及其应用

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Publication number: CN115927116B
Application number: CN202211732392.1A
Authority: CN
Inventors: 罗卫飞; 韦新利; 何盈宣; 蒙丽丽; 柴智慧; 凌敏; 黄连飞; 卢恩秋
Original assignee: Guangxi Aisheng Life Technology Co ltd
Current assignee: Guangxi Aisheng Life Technology Co ltd
Priority date: 2022-12-30
Filing date: 2022-12-30
Publication date: 2023-09-15
Anticipated expiration: 2042-12-30
Also published as: CN115927116A

Abstract

本发明提供了一种具有降甘油三酯、降胆固醇、减脂的发酵乳杆菌(Lactobacillusfermentum)菌株及其应用，属于功能微生物技术领域。本发明提供了具有降甘油三酯、降胆固醇、减脂的发酵乳杆菌菌株A21227，保藏编号为GDMCCNo:62962。所述菌株A21227是从百岁长寿老人肠道中分离纯化得到，具有同时降甘油三酯、降胆固醇、减脂的生物功能，是一种耐人工胃肠液、具有较强的自身疏水性及粘附肠道细胞的能力的菌株，同时对肠道致病菌具有抑制作用。本发明提供的菌株A21227为肥胖、高血脂症或心脑血管疾病的治疗提供了新思路。

Description

一种具有降甘油三酯、降胆固醇、减脂的发酵乳杆菌菌株及其应用

技术领域

本发明属于功能微生物技术领域，具体涉及一种具有降甘油三酯、降胆固醇、减脂的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株及其应用。

背景技术

甘油三酯(Triglyceride，缩写TG)，是由食物脂肪与肝脏合成的，是长链脂肪酸和甘油形成的脂肪分子。它是血液中血脂最重要的一种，同时也是人体内含量最多的脂类，大部分组织均可以利用甘油三酯分解产物供给能量，同时肝脏、脂肪等组织还可以进行甘油三酯的合成，在脂肪组织中贮存。但如果甘油三酯过量，囤积于皮下就会使身体肥胖，囤积于血管壁则造成动脉硬化，囤积于心脏就会导致心脏肥大，囤积于肝脏则会造成脂肪肝。目前我国有近1/3的成年人的血脂偏高，高血脂症现在已成为人类健康的第一隐形杀手。

人体内胆固醇通常是游离和胆固醇酯两种形式存在于细胞和组织中，在脑及神经组织、肾、皮肤、肝脏和胆汁中分布较高，是体内膜结构中的重要组分，参与形成生物膜，在血浆脂蛋白合成、脂类代谢、神经兴奋的传导过程中也起重要作用，还是胆汁酸，维生素D以及多种激素的合成原料，因此，胆固醇是维持机体生理机能所不可缺少的重要物质，在体内承担着重要的生理功能，然而人体血清中胆固醇含量往往过高，血清胆固醇过高所造成的一系列心血管疾病普遍存在。现代研究已发现，动脉粥样硬化、静脉血栓形成与高胆固醇血症有密切的相关性。WTO曾预测，到2030年心血管疾病将是导致死亡的主要原因，影响着全世界大约2.36亿人们的健康。

随着生活水平的提高，人们的饮食结构和生活方式不断发生变化。近年来，动脉粥样硬化、冠心病等心脑血管疾病和高脂血症的发病率逐渐上升。肥胖、三高等“富贵病”的发病率也不断上升。由于治疗药物价格高、副作用大，只有建立起健康的生活方式，特别是遵循健康饮食标准，才能达到预防和减轻的效果。因此，通过针对性地补充富含益生菌的食品来调节人体内环境平衡与生理节律十分必要。近年来，国内外研究者已证明一些乳酸菌如乳杆菌、双歧杆菌等具有降低胆固醇的益生功能，具有降甘油三酯功能的乳酸菌鲜见报道，而同时具备降胆固醇、降甘油三酯和抑制脂肪积累功能的乳杆菌尚未见报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种发酵乳杆菌菌株，具有同时降甘油三酯、降胆固醇和减脂的作用。

本发明提供了一种具有降甘油三酯、降胆固醇、减脂的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株A21227，保藏编号为GDMCC No:62962。

本发明提供了一种益生菌剂，包括所述发酵乳杆菌菌株A21227和辅料。

优选的，所述发酵乳杆菌菌株A21227的活菌数为(1～1000)×10⁹CFU/ml。

本发明提供了一种减肥药，包括所述发酵乳杆菌菌株A21227和医学上可接受辅料。

优选的，所述减肥药包括口服制剂。

本发明提供了所述发酵乳杆菌菌株A21227在制备降血脂的益生菌剂或减肥的药物中的应用。

本发明提供了所述发酵乳杆菌菌株A21227或所述益生菌剂在制备治疗高血脂症的药物中的应用。

本发明提供了一种发酵剂，包括所述发酵乳杆菌菌株A21227和载体介质。

本发明提供了所述发酵乳杆菌菌株A21227或所述发酵剂在制备降油三酯、降胆固醇和减脂的发酵制品中的应用。

本发明提供了一种具有降甘油三酯、降胆固醇、减脂的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株A21227，保藏编号为GDMCC No:62962。通过邻苯二甲醛法等方法测定菌株A21227的降甘油三酯、胆固醇效果，并且测定了菌株对线虫脂肪积累的影响，结果表明菌株A21227具有同时降甘油三酯和降胆固醇能力，还具有减脂作用，具体的降甘油三脂降解率为53.15％以上，降胆固醇能力为58.75％以上，脂肪抑制率68.39％以上。可见，本发明提供菌株A21227为肥胖、高血脂症的治疗提供了新思路。

附图说明

图1为A21227菌株平板菌落形态及革兰氏染色结果；

图2为胆固醇标准曲线；

图3为线虫脂肪粒油红O染色结果；

图4为A21227模拟人工胃肠液生长情况；

图5为A21227对NCM460细胞的粘附性能力。

生物材料保藏信息

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)A21227，保藏日期为2022年11月11日，保藏单位为广东微生物菌种保藏中心，单位简称GDMCC，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏号为GDMCC No:62962。

具体实施方式

在本发明中，所述菌株A21227是从百岁长寿老人肠道中分离纯化得到，具有发酵乳杆菌的典型特征，革兰氏阳性，兼性厌氧，无芽孢，菌落多元型，灰白色，表面光滑，中间隆起，边缘整齐，直径2～4mm，液体培养有气泡产生；细胞呈短杆状，单个或成对排列；在MRS培养基培养，菌株菌落为灰白色，直径约2-4mm，表面光滑、边缘整齐、中间隆起，镜检形态为短杆状。采用16SrDNA法对所分纯的菌株进行分子鉴定。其16SrDNA序列在NCBI数据库中进行比对，结果发现该菌株的基因序列，在所有相似的序列中，与发酵乳杆菌的同源性为99.93％，因此结合生理生化特征，鉴定菌株是发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。

在本发明中，开展了菌株自身疏水性、细胞粘附性试验、耐人工胃肠液试验，结果表明菌株A21227是一种耐人工胃肠液，具有较强自身疏水性及粘附肠道细胞能力的菌株，同时抗菌实验实验表明所述菌株A21227对肠道致病菌(大肠杆菌和埃希大肠杆菌)具有抑制作用。

在本发明中，还检测了所述菌株A21227对甘油三酯的降解率，对胆固醇的降解率，对秀丽隐杆线虫(简称为线虫)脂肪积累的影响，结果表明，同时具备降甘油三酯、降胆固醇和减脂功能。其降甘油三脂降解率为53.15％以上，降胆固醇能力为58.75％以上，脂肪抑制率68.39％以上。

在本发明中，所述发酵乳杆菌菌株A21227的活菌数为(1～1000)×10⁹CFU/ml，优选为1×10¹⁰CFU/ml。本发明对所述益生菌剂的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的益生菌剂的制备方法即可。所述益生菌剂辅料种类与剂型有关，在此不做具体限定。

基于发酵乳杆菌菌株A21227具有降甘油三酯、降胆固醇和减脂的作用，因此，本发明提供了一种减肥药，包括所述发酵乳杆菌菌株A21227和医学上可接受辅料。

在本发明中，所述发酵乳杆菌菌株A21227的活菌数优选为(1～1000)×10⁹CFU/ml，更优选为1×10¹⁰CFU/ml。本发明对所述减肥药的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的减肥药的制备方法即可。所述减肥药辅料种类与剂型有关，在此不做具体限定。

在本发明中，所述减肥药优选包括口服制剂。由于发酵乳杆菌菌株A21227具有良好的强酸强碱耐受性及自身疏水性和细胞粘附性都很强，同时所述发酵乳杆菌菌株A21227还具有抑制大肠杆菌和埃希大肠杆菌等主要肠道致病菌的生物学性质，因此适合制备口服制剂。本发明对所述口服制剂的类型没有特殊限制，采用本领域所熟知的口服制剂的种类即可，例如片剂、口服液、胶囊、粉剂等。

在本发明中，血液中脂肪的含量高通常表现为甘油三酯、胆固醇的含量高，基于所述发酵乳杆菌菌株A21227具有体外降解甘油三酯、胆固醇以及血脂的特性，因此，所述发酵乳杆菌菌株A21227具有预防和/或治疗高血脂症的作用。

在本发明中，所述发酵制品优选包括发酵乳。

在本发明中，所述发酵乳杆菌A21227种子液的制备方法有选为将发酵乳杆菌A21227接种到MRS液体培养基中培养，得到接种液。所述培养的条件优选为接种量为3％，37℃下培养12h。

在本发明中，所述发酵培养的温度优选36～38℃，更优选为37℃，所述发酵培养的时间优选为2％～4％，更优选为3％。所述原料优选包括纯净水、茯苓提取物、玫瑰花提取物、山楂提取物、橘皮提取物、决明子提取物，葛根提取物、红枣粉、山药粉和酵母粉。上述茯苓提取物、玫瑰花提取物、山楂提取物决明子提取物、葛根提取物、红枣粉、山药粉购买于西安田禾药业有限公司；橘皮提取物购买于西安恒基化工有限公司；酵母粉购买于北京鸿润宝顺科技有限公司。每800ml～1000ml的所述纯净水溶解以下含量的组分：茯苓提取物0.5g～1g、玫瑰花提取物0.5g～2g、山楂提取物0.5g～1g、橘皮提取物0.5g～1g、决明子提取物1g～3g、葛根提取物1g～3g，红枣粉0.5g～2g、山药粉0.5g～2g和酵母粉0.5g～1g；更优选为800ml所述纯净水溶解以下含量组分：茯苓提取物1g、玫瑰花提取物2g、山楂提取物1g、橘皮提取物1g、决明子提取物3g、葛根提取物3g，红枣粉优2g、山药粉优2g和酵母粉1g。所述破壁处理的方法优选在高压喷雾破壁机中完成。所述高压喷雾破壁机的压力设置为18～22MPa，更优选为20MPa，处理的时间优选为0.5～1h。所述调味品优选包括蜂蜜和果汁浓缩汁。所述蜂蜜和果汁浓缩汁的体积比为优选为1.8～2.2:2.5～3.5，更优选为2：3。所述果汁浓缩汁优选为水蜜桃浓缩汁。所述水蜜桃浓缩汁的制备方法优选为去皮的水蜜桃丁预煮20min后，加入2～3倍的纯净水，用研钵研磨捣碎，然后用纱布过滤得到汁液，高温杀菌，待冷却后，即得水蜜桃浓缩汁。

下面结合实施例对本发明提供的一种具有降甘油三酯、降胆固醇、减脂的发酵乳杆菌菌株及其应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

发酵乳杆菌A21227的筛选和鉴定

1.菌株分离和纯化

取来自百岁老人的新鲜粪便样品按照10倍梯度稀释至10^-5，分别取10^-3、10^-4、10^-5三管稀释液各0.1ml，采用平板涂布法，将样品稀释液涂布于MRS固体培养基上进行分离。平板于37℃培养48h后，挑取疑似目标菌株的单菌落，划线转移到新的MRS固体平板上，划线纯化2代后，经镜检确认为纯种后，接种到斜面培养基培养24h后，置4℃冰箱保存备用。

MRS固体培养基配方及条件为：称取蛋白胨10.0g，乙酸钠5.0g，牛肉浸粉5.0g，Tween-801.0mL，葡萄糖20.0g，K₂HPO₄2.0g，酵母浸粉4.0g，MnSO₄·4H₂O0.05g，柠檬酸三铵2.0g，MgSO₄0.2g，琼脂12.0g，加入800mL的蒸馏水，混匀至溶质完全溶解后调pH至6.2±0.2，定容至1L，121℃高压灭菌20min后，趁热倒平板，冷却凝固后置于4℃保存备用。

2菌株鉴定

对分离纯化后得到的乳杆菌进行细菌形态观察和革兰氏染色后细胞形态观察，通过参照《伯杰士细菌学手册》及《乳酸细菌分类鉴定及实验方法》对乳杆菌进行鉴定。分离和纯化的菌株菌落多元型，灰白色，表面光滑，中间凸起，边缘整齐，直径2-4mm，液体培养有气泡产生；细胞呈短杆状，单个或成对排列。菌株革兰氏染色阳性，菌株无运动性，兼性厌氧型，在厌氧条件下生长良好(图1)。

3菌株16SrDNA

采用16SrDNA法对所分纯的菌株进行分子鉴定。16SrDNA扩增及序列测定由生工生物工程(上海)股份有限公司完成。测序完成提交菌株A21227的16SrDNA序列(GGCGGGCGGGTGCTATACATGCAAGTCGAACGCGTT GGCCCAATTGATTGATGGTGCTTGCACCTGATTGATTTTGGTCGCCAACGAGTGGCGGACGGGTGAGTAACACGTAGGTAACCTGCCCAGAAGCGGGGGACAACATTTGGAAACAGATGCTAATACCGCATAACAACGTTGTTCGCATGAACAACGCTTAAAAGATGGCTTCTCGCTATCACTTCTGGATGGACCTGCGGTGCATTAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGCGATGATGCATAGCCGAGTTGAGAGACTGATCGGCCACAATGGGACTGAGACACGGCCCATACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCACAATGGGCGCAAGCCTGATGGAGCAACACCGCGTGAGTGAAGAAGGGTTTCGGCTCGTAAAGCTCTGTTGTTAAAGAAGAACACGTATGAGAGTAACTGTTCATACGTTGACGGTATTTAACCAGAAAGTCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTATCCGGATTTATTGGGCGTAAAGAGAGTGCAGGCGGTTTTCTAAGTCTGATGTGAAAGCCTTCGGCTTAACCGGAGAAGTGCATCGGAAACTGGATAACTTGAGTGCAGAAGAGGGTAGTGGAACTCCATGTGTAGCGGTGGAATGCGTAGATATATGGAAGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTACCTGGTCTGCAACTGACGCTGAGACTCGAAAGCATGGGTAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCATGCCGTAAACGATGAGTGCTAGGTGTTGGAGGGTTTCCGCCCTTCAGTGCCGGAGCTAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGACCGCAAGGTTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCTACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCTTGCGCCAACCCTAGAGATAGGGCGTTTCCTTCGGGAACGCAATGACAGGTGGTGCATGGTCGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTTACTAGTTGCCAGCATTAAGTTGGGCACTCTAGTGAGACTGCCGGTGACAAACCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAGATCATCATGCCCCTTATGACCTGGGCTACACACGTGCTACAATGGACGGTACAACGAGTCGCGAACTCGCGAGGGCAAGCAAATCTCTTAAAACCGTTCTCAGTTCGGACTGCAGGCTGCAACTCGCCTGCACGAAGTCGGAATCGCTAGTAATCGCGGATCAGCATGCCGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACACCATGAGAGTTTGTAACACCCAAAGTCGGTGGGGTAACCTTTTAGGAGCCAGCCGCATTAAAGCCCT，SEQ ID NO:1)在NCBI(National Center forBiotechnologyInformation，美国国立生物技术信息中心)数据库中进行比对，结果发现菌株A21227的基因序列，在所有相似的序列中，与发酵乳杆菌的同源性为99.93％，因此结合生理生化特征，鉴定菌株A21227是发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)。该分离百岁长寿老人肠道的发酵乳杆菌，菌株已于2022年11月11日保藏于广东微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No:62962。

实施例2

发酵乳杆菌A21227的体外降甘油三脂效果

1.实验菌株的制备

(1)第一次活化培养：将保藏于-80℃的菌株冻存管取出至冰上，用接种环蘸取菌液于MRS固体培养基平板划线，37℃静置培养24～48h。

(2)第二次活化培养：挑取单菌落于5mL MRS液体培养基中，37℃静置培养18～20h。

(3)将第三次活化培养得到的菌液以3％接种量接种于5mL含有甘油三酯的MRS液体培养基中，同时将未接种菌液的甘油三酯MRS液体培养基作为对照，37℃静置培养24h。

MRS液体培养基的配制及条件：称取蛋白胨2.0g，乙酸钠5.0g，牛肉浸粉40g，Tween-80 1.0mL，葡萄糖20.0g，K₂HPO₄ 2.0g，酵母浸粉4.0g，MnSO₄·4H₂O 0.04g，柠檬酸三铵2.0g，MgSO₄ 0.2g，加入800mL的蒸馏水，混匀至溶质完全溶解后调pH至5.7，定容至1L，121℃高压灭菌，冷却室温保存备用。

含甘油三酯MRS液体培养基配制及条件：将2％的聚乙烯醇水溶液与发酵油按体积比3：1混合，用超声波处理(控制参数每次超声5s，间隔时间5s，共超声12min)后混合均匀制成发酵油乳化液，作为甘油三酯的来源。将上述制备的发酵油乳化液按5％的比例加入到MRS液体培养基中，调pH至6.5±0.2，115℃，30min灭菌，制成甘油三酯培养基并于4℃冰箱贮存备用。

2.甘油三酯含量测定试验(单试剂GPO-PAP法)

将培养后的菌液及未接种菌液的甘油三酯培养基分别取1mL于4℃，8000r/min离心10min。取上清液，按甘油三酯(TG)测试盒说明书(南京建成生物试剂公司A110-1-1)进行操作。按照表1操作。

表1甘油三酯测试步骤

震荡孔板混匀，37℃孵育10分钟，波长546nm，酶标仪测定各孔吸光度值。

甘油三酯(TG)含量(mmol/L)＝(A样本孔-A空白孔)/(A标准孔-A空白孔)×C标准公式I

甘油三酯(TG降解率(％)＝(总TG含量-残留TG含量)/总TG含量×100％公式II

其中，总TG含量——未接种菌液的甘油三酯培养基中甘油三酯(TG)含量；残留TG含量——接种菌液培养24h后的甘油三酯培养基中甘油三酯(TG)含量。

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)A21227甘油三酯降解率为53.15％。

实施例3

发酵乳杆菌A21227的体外降胆固醇效果

1.实验菌株的制备

将第三次活化培养得到的菌液以5％接种量接种于5mL含有高胆固醇MRS(MRS-CHOL)液体培养基中，同时将未接种菌液的MRS-CHOL液体培养基作为对照，37℃静置培养24h。

含高胆固醇MRS(MRS-CHOL)液体培养基配制及条件：称取MRS培养基54g，胆固醇1.0g，吐温80 20mL，牛胆盐3.0g，先将胆固醇置于吐温中溶解，用水浴锅加热，并趁热倒入培养基中，定容至1L，121℃高压灭菌20min后，冷却后保存备用。

2.邻苯二甲醛法测定胆固醇含量

将活化好的菌株，接种于MRS高胆固醇液体培养基，37℃厌氧培养24h，菌液于10000r/min离心10min，收集上清液，采用邻苯二甲醛法测定胆固醇含量(100μl发酵上清液，750μl显色剂，250μl冰乙酸和1mL浓硫酸，暗反应10min)以未接种的MRS-CHOL培养基为对照组，A_550nm处测量吸光度。并按照以下公式III计算胆固醇的去除率。

胆固醇去除率(％)＝(A1-A2)/A1×100％公式III

式中，A1为未接种的MRS-CHOL培养基上清液胆固醇含量，A2为接种后的发酵上清液胆固醇含量。

邻苯二甲醛显色剂：称量10mg邻苯二甲醛，冰乙酸定容至100ml，避光保存。

胆固醇标准曲线的测定

配制0μg/ml、10μg/ml、20μg/ml、30μg/ml、40μg/ml、50μg/ml浓度的胆固醇标准溶液，测定胆固醇浓度，以胆固醇含量为横轴，吸光度值为纵轴作标准曲线(图2)。

经试验测得菌株A21227的降胆固醇能力为58.75％。

实施例4

发酵乳杆菌A21227的减脂效果

1菌株、线虫培养

将大肠杆菌OP50培养于LB培养基中，过夜培养后取适量涂板于线虫培养基(nematode growth medium，NGM)上，过夜培养。将解冻的线虫离心后加至有OP50的NGM培养基上，放置于20℃培养箱培养。A21227活化两后接种于MRS液体培养基中，37℃恒温培养18～20h。

2线虫同期化处理

用M9缓冲液悬浮线虫，吸至培养管中，每管线虫加入裂解液(5M NaOH和5％次氯酸钠溶液)，裂解6min，3500r/min离心1min，弃上清液，用M9 buffer反复清洗4次，弃上清液，转移NGM培养基上，20℃恒温过夜培养，即得L 1期幼虫；随后用M9 buffer冲洗离心一次后，将线虫加在有OP50的NGM平板上，20℃培养28～30h即可得到同期化线虫。

3.线虫脂肪粒实验

分别将100条同期化线虫挑入涂有OP50和A21227的平板中，隔天换板；在喂食第5天后，用冷却的M9 buffer洗三次后，将线虫重悬在4％的多聚甲醛中，各样本在室温下轻微摇动1h，3000～4000rpm离心1min，去上清后用M9 buffer洗两次；随后将线虫重悬在60％异丙醇和0.01％Triton X-100的PBS溶液中，孵育15min；待线虫沉降后，去除异丙醇，加入1mL40％油红O染色剂，在25℃摇床孵育动物1～2h；待线虫沉降后去除染料，用M9buffer清洗两次，加入200μL M9 buffer，在倒置荧光显微镜下逐条线虫拍照，并用Image J统计图像数据、用GraphPad Prism5统计脂肪粒降解率数据(图3)。

其中，M9 buffer:2.2mM KH₂PO₄，4.2mM Na₂HPO₄，8.55mM NaCl，定容至1L，高压灭菌备用。

NGM琼脂培养基：3g NaCl，2.5g细菌蛋白胨，17g琼脂，975mL无菌水，121度灭菌，冷却到55度，依次加入1mL5mg/ml胆固醇、1mL 1MCaCl2、1mL 1M MgSO₄和25mL 1M磷酸缓冲液。

0.5％油红O：将50mg油红O粉剂加入到50ml的异丙醇中，加热以及充分搅拌使其完全溶解后，过滤除菌，4℃保存。

经试验，结果显示喂养5d后的线虫经油红O染色后，与喂养OP50的线虫相比，喂养A21227的线虫脂肪粒明显减少，抑制率为68.39％(P＜0.05或P＜0.01)。

实施例5

发酵乳杆菌A21227的耐人工胃肠液试验

1.菌株模拟人工胃液实验

将活化三次的菌液震荡摇匀，取1ml菌悬液于9ml人工胃液(pH＝3.0)中，37℃静置培养3h，分别取培养0h和3h的人工胃液进行平板活菌计数。以0h作为对照，公式IV计算存活率。

模拟人工胃液存活率(％)＝Nt/N0*100％公式IV

式中，Nt表示培养th后的活菌数，N0表示0h时的活菌数。

2.菌株模拟人工肠液实验

取培养3h后的人工胃液1ml于9ml人工肠液(pH＝8.0)中，37℃静置培养2h，4h，6h和8h。分别取培养0h，2h，4h，6h和8h的人工肠液进行平板活菌计数。以0h作为对照，公式V计算存活率。

模拟人工肠液存活率(％)＝Nt/N0*100％公式V

式中，Nt表示培养th后的活菌数，N0表示0h时的活菌数。

结果见表2和图4。

表2A21227模拟人工胃肠液的耐受性

由表2和图4可知，A21227菌株模拟胃液处理3h时后，菌株存活率达56.76％，活菌对数值还达到7；模拟肠液处理8h后，菌株存活率高达132.08％，活菌对数值还达到6以上，说明A21227菌株在模拟胃肠液中的存活能力强，

综上，说明该菌株能够有效抵抗胃肠液的影响，从而能够在通过消化道后依然维持较高活性。

实施例6

发酵乳杆菌A21227的抗菌活性试验

致病菌大肠杆菌/埃希大肠杆菌制备：取致病菌株冻存管划线活化，挑取单菌落于5mlLB液体培养基中，大肠杆菌/埃希大肠杆菌37℃恒温过夜培养。

将活化三次的实验菌液震荡摇匀，取1ml培养液于4℃，8000rpm离心10min，取上清液进行过滤除菌。

制备固体培养基：将培养至对数期的致病菌，取菌悬液100μL均匀涂布于LB固体培养基上，用镊子将无菌牛津杯竖于涂布有菌液的平皿中，每个牛津杯中加入200μL受试样品上清，其中受试样品包括发酵乳杆菌A21227、LGG(分离自从Today便利店购买的简爱·身体知道LGG酸奶)、植物乳杆菌P-8(分离自从淘宝购买的益适忧益生菌粉产品)，同时还设置阴性对照(MRS液体培养基)。将平皿置于4℃冰箱12h后放入37℃恒温培养箱中，培养24h后观察拍照，并用游标卡尺计量抑菌圈直径。结果见表3。

表3A21227对大肠杆菌和埃希大肠杆菌的抑菌作用

通过试验结果可以得出，A21227对胃肠道中主要肠道致病菌有明显抑菌作用。

LB培养基配制及条件:蛋白胨3g，酵母浸粉1.2g，磷酸氢二钾0.5g，麦芽糖3g，无水乙酸钠0.9g，柠檬酸铵0.6g，七水硫酸镁0.06g，氯化锰0.03g，琼脂4.5g，吐温80 300μl，用超纯水定容300ml，121℃高压蒸汽灭菌15min。

实施例7

发酵乳杆菌A21227的自身疏水性实验

将5％二次活化的菌株接种于无菌MRS培养基中37℃培养16～18h，离心(8000r/min，4℃，10min)收集菌体，50mmol/L磷酸盐缓冲液离心洗涤2次，将沉淀用缓冲液悬浮。以缓冲液为空白对照，调整菌体浓度，使其初始浓度在600nm波长处吸光度值约为1.0(A₀)。取4mL调整浊度后的菌液，加入0.8mL二甲苯，高速涡旋2min，静置10min分层，取下层水相在600nm波长处测其吸光度。按公式VI计算乳酸菌细胞表面疏水性：

疏水性(％)＝(A₀-A)/A₀×100％公式VI

式中，A₀和A分别为与二甲苯混匀前、后菌液在600nm波长测得的吸光度值。

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)A21227的自身疏水性为73.97％。

实施例8

发酵乳杆菌A21227细胞粘附性能力试验

(1)NCM460正常肠上皮细胞培养与种板：将复苏好的NCM460进行消化，种6孔板(含细胞爬片)，3×10⁵/孔，37℃，5％CO₂恒温培养箱过夜培养。

菌悬液制备：将活化三次的实验菌液震荡摇匀，收集菌液，PBS洗2次，加入高糖DMEM培养基重悬菌体，调整菌浓度为1×10⁸CFU/ml。

将菌液加入至6孔板中，1ml/孔，每个样品三个孔重复。菌液与细胞共孵育2h。取出6孔板，用PBS洗5次，尽可能把未粘附的细胞洗掉。然后用酒精灯固定细胞爬片，进行革兰氏染色。多个视野观察实验菌株的细胞粘附情况，按照公式VII计算粘附率。

细菌粘附率＝被粘附的细胞数/视野内总细胞数×100％公式VII

图5为其中一个视野。每个NCM460细胞上粘附A21227的数量>100个，粘附率为86％，说明A21227对NCM460细胞具有很好的粘附性。

实施例9

发酵乳杆菌A21227饮品制备

(1)培养液制备：将纯净水800ml、茯苓提取物1g、玫瑰花提取物2g、山楂提取物1g、橘皮提取物1g、决明子提取物3g、葛根提取物3g，红枣粉2g、山药粉2g和酵母粉1g进行混合，得到混合浆料；然后进行120℃高压灭菌30min，然后冷却至40℃，得到灭菌培养液；

(2)将发酵乳杆菌A21227接种到MRS液体培养基中，接种量为3％，37℃下培养12h得到接种液；将接种液接种于灭菌培养液中，接种量为3％，37℃下培养22～24h，得到发酵液；将发酵液输送至高压喷雾破壁机中，压力设置20MPa，进行破壁处理1h，得到破壁发酵液；破壁发酵液与调味品(蜂蜜：水蜜桃浓缩汁＝2：3)混合调味后，进行巴氏灭菌，得到发酵乳杆菌饮品。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims

1.一种具有降甘油三酯、降胆固醇、减脂的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)菌株A21227，其特征在于，保藏编号为GDMCC No:62962。

2.一种益生菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述发酵乳杆菌菌株A21227和辅料。

3.根据权利要求2所述益生菌剂，其特征在于，所述发酵乳杆菌菌株A21227的活菌数为(1～1000)×10⁹CFU/ml。

4.一种减肥药，其特征在于，包括权利要求1所述发酵乳杆菌菌株A21227和医学上可接受辅料。

5.根据权利要求4所述减肥药，其特征在于，所述发酵乳杆菌菌株A21227的活菌数为(1～1000)×10⁹CFU/ml。

6.根据权利要求4所述减肥药，其特征在于，所述减肥药包括口服制剂。

7.权利要求1所述发酵乳杆菌菌株A21227在制备降血脂的益生菌剂或减肥的药物中的应用。

8.权利要求1所述发酵乳杆菌菌株A21227或权利要求2或3所述益生菌剂在制备治疗高血脂症的药物中的应用。

9.一种发酵剂，其特征在于，包括权利要求1所述发酵乳杆菌菌株A21227和载体介质。

10.权利要求1所述发酵乳杆菌菌株A21227或权利要求9所述发酵剂在制备降油三酯、降胆固醇和减脂的发酵制品中的应用。