CN112812999A - 一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌slb01及其衍生产品和应用 - Google Patents

一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌slb01及其衍生产品和应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供了一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌SLB01及其衍生产品和应用，属于微生物技术领域。本发明提供了一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SLB01，保藏编号为GDMCCNo：61178。通过体外抑菌实验和体内抑菌实验均表明，与常规乳杆菌相比，该植物乳杆菌SLB01对阴沟肠杆菌具有较强的抑制作用，并且具有耐酸耐胆盐的特性。本发明通过连续食用含植物乳杆菌SLB01的食品或菌剂，结果表明可显著降低肠道中阴沟肠杆菌的丰度，从而达到调节肠道菌群平衡，辅助预防和治疗阴沟肠杆菌引起的肥胖等疾病的目的。

Description

一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌SLB01及其衍 生产品和应用
技术领域
本发明属于微生物技术领域，具体涉及一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌SLB01及其衍生产品和应用。
背景技术
阴沟肠杆菌(Enterobacter cloacae)在自然界中广泛存在，在人和动物的粪便、污水、土壤、植物中均可检测到。在人的肠道中，阴沟肠杆菌作为常见的肠道微生物之一与其它肠道微生物一起寄居于肠道中。阴沟肠杆菌是一种条件致病菌，在健康的肠道中，阴沟肠杆菌受到健康菌群的制约不会引起疾病；但是在宿主免疫力低下、肠道菌群失调时则可引起呼吸道、伤口、尿路感染及菌血症。最新研究表明，阴沟肠杆菌还与肥胖、糖尿病等疾病相关，是引起肥胖、糖尿病的助推因素之一。随着生活水平的提高，人们的饮食结构也发生了变化，高糖、高脂等不健康的饮食习惯打破了原有的肠道菌群平衡，肠道内的阴沟肠杆菌大量增殖引起体内的内毒素含量升高、全身发炎，最后发展成为典型的肥胖、糖尿病和脂肪肝等疾病；阴沟肠杆菌也被称为“肥胖菌”。
长期以来，广谱抗生素尤其是β-内酰胺类抗生素一直是治疗阴沟肠杆菌感染和抑制阴沟肠杆菌生长的首选药物。但是广谱抗生素在抑制阴沟肠杆菌的同时也会抑制体内的有益菌群，进一步加剧肠道菌群失调。
近年来，随着研究的不断深入，出现了许多抑制阴沟肠杆菌的新方法，例如申请号201810395759.2、专利名称为“一种提高肠道中AKK菌/致病菌比值的复合制剂及制备方法与应用”的专利申请公开了一种复合制剂，通过服用该复合制剂可以提高肠道中AKK菌/致病菌比值，降低肠道中阴沟肠杆菌的丰度，所述复合制剂主要是由低聚糖、植物提取物、真菌提取物、牛磺酸钠和沙枣提取物组成。此外，还有采用与阴沟肠杆菌具有拮抗作用的微生物进行治疗的方法，例如申请号2020100467156、专利名称为“一种链球菌及其应用”的专利申请公开了一株链球菌，具有广谱抗性，能够抑制金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、普通变形杆菌、阴沟肠杆菌、鲍曼不动杆菌中的一种或更多种。然而链球菌本身属于致病菌，可能给人体带来新的健康隐患。
发明内容
有鉴于此，本发明的目的在于提供一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌SLB01，该菌株不仅能在体内外有效抑制阴沟肠杆菌作用，而且对人体健康有益，无新的致病风险。
本发明的目的还在于提供植物乳杆菌SLB01的衍生产品和应用，达到丰富抑制阴沟肠杆菌的产品种类的目的。
本发明提供了一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌(Lactobacillusplantarum)SLB01，所述植物乳杆菌SLB01的保藏编号为GDMCC No：61178。
本发明提供了一种对阴沟肠杆菌具有抑制作用的产品，包括所述植物乳杆菌SLB01。
优选的，所述产品包括由所述植物乳杆菌SLB01发酵制备的发酵制品、由所述植物乳杆菌SLB01制备的菌剂和/或含所述植物乳杆菌SLB01的保健品、食品或饮品。
本发明提供了所述植物乳杆菌SLB01在制备治疗肥胖的药物中的应用。
优选的，所述肥胖是由阴沟肠杆菌引起的肥胖症。
本发明提供了所述植物乳杆菌SLB01在制备治疗肠道菌群失衡的药物中的应用。
本发明提供了一种具有抑制阴沟肠杆菌作用的复合菌剂，包括所述植物乳杆菌SLB01和肠道益生菌。
优选的，所述肠道益生菌包括格氏乳杆菌、发酵乳杆菌和唾液乳杆菌。
本发明提供的对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌SLB01，保藏编号为GDMCCNo：61178。在阴沟肠杆菌的体外抑制实验中，取菌液浓度为1×108CFU/ml 0.1ml阴沟肠杆菌菌液与MRS固体培养基混合均匀，制备阴沟肠杆菌平板，将浸有植物乳杆菌SLB01的滤纸片贴于所述平板上，结果表明植物乳杆菌SLB01的抑菌圈直径为2.59cm，而其他菌株，例如植物乳杆菌M910的抑菌圈直径为2.50cm，格氏乳杆菌M982抑菌圈直径为2.40cm，唾液乳杆菌B762抑菌圈直径为2.36cm，格氏乳杆菌M213抑菌圈直径为2.50cm。同时本发明还进行液体抑菌实验和体内抑制实验，结果均表明植物乳杆菌SLB01能有效抑制阴沟肠杆菌的增殖。这表明与常规的乳杆菌菌株相比，植物乳杆菌SLB01具有较强的抑制阴沟肠杆菌的性能。
进一步的，本发明还限定了植物乳杆菌SLB01在含胆盐的pH为酸性的PBS缓冲液中的存活率为72％～75％。本发明通过采用pH值3.0的磷酸盐缓冲液模拟胃液，采用猪胆盐浓度0.15％的溶液模拟肠液，经过胃液和肠液依次培养，模拟植物乳杆菌SLB01经过胃肠消化后存活率，结果表明，与常规的乳杆菌菌株相比，植物乳杆菌SLB01表现出较强的耐酸耐胆盐的特性，胃肠道消化对该菌株不会造成较大损害，因此，适合口服摄入。
生物材料保藏信息
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SLB01，保藏于广东省微生物菌种保藏中心，单位简称GDMCC，地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，保藏时间2020年10月23日，保藏编号为GDMCC No：61178。
附图说明
图1为植物乳杆菌SLB01平板菌落形态；
图2为植物乳杆菌SLB01平板抑菌效果；
图3为无待测菌株接入的对照平板。
具体实施方式
本发明提供了一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌SLB01，保藏编号为GDMCC No：61178。
在本发明中，所述植物乳杆菌SLB01的菌落形态特征如下：在MRS固体培养基上，菌落为圆形，乳白色，菌落突起、光滑，边缘整齐，不透明。革兰氏染色后显微镜观察显色，菌株为杆状，革兰氏阳性。经PCR扩增菌株SLB01的16S rDNA序列，对序列进行比对分析。结果显示其中一株菌株的序列与NCBI数据库中植物乳杆菌的同源性高达99.73％，因此结合形态特征和分子鉴定结果，将该菌株SLB01鉴定为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌SLB01。
在本发明中，所述植物乳杆菌SLB01对阴沟肠杆菌的抑菌圈直径为2.58～2.62cm。所述植物乳杆菌SLB01在含猪胆盐质量浓度0.15％、pH值3.0的磷酸盐缓冲液中存活率优选为72％～75％，更优选为73.75％。所述植物乳杆菌SLB01的保藏编号优选为GDMCC No：61178。
本发明提供了一种对阴沟肠杆菌具有抑制作用的产品，包括所述植物乳杆菌SLB01。
在本发明中，所述产品优选包括由所述植物乳杆菌SLB01发酵制备的发酵制品、由所述植物乳杆菌SLB01制备的菌剂和/或含所述植物乳杆菌SLB01的保健品、食品或饮品。所述发酵制品包括乳制品、发酵饮料和泡菜等发酵食品。所述发酵制品的发酵温度优选为37～40℃，更优选为37℃。发酵时间优选为7～9h，更优选为8h。所述菌剂为植物乳杆菌SLB01经过种子活化、一级培养、二级培养和发酵培养后，得到的植物乳杆菌SLB01菌体，再与冻干保护剂混合，冻干，制备得到菌剂。实验证明，连续食用含有上述植物乳杆菌SLB01的发酵食品一个月后通过检测食用前后肠道中阴沟肠杆菌的丰度，食用含有上述植物乳杆菌SLB01的发酵食品可降低肠道中阴沟肠杆菌的丰度；同时服用所述菌剂后，与对照相比，能有效降低受试者肠道中阴沟肠杆菌数量，从而调节肠道菌群平衡。因此，本发明提供的含有植物乳杆菌SLB01的产品具有抑制阴沟肠杆菌的作用。
由于阴沟肠杆菌能够引起肥胖，所述植物乳杆菌SLB01能够有效抑制阴沟肠杆菌的生长及降低肠道内阴沟肠杆菌丰度，本发明提供了所述植物乳杆菌SLB01在制备治疗肥胖的药物中的应用。所述肥胖优选是由阴沟肠杆菌引起的肥胖症。本发明对所述药物的剂型不做具体限定，采用本领域所熟知的药物剂型即可，优选口服剂，例如片剂，口服液、粉剂等。本发明对所述药品的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物即可。
本发明提供了所述植物乳杆菌SLB01在制备治疗肠道菌群失衡的药物中的应用。体内抑菌实验表明，植物乳杆菌SLB01通过微生物间的拮抗作用抑制肠道内的阴沟肠杆菌，降低肠道内阴沟肠杆菌的丰度，调节肠道菌群平衡。本发明对所述药物的剂型不做具体限定，采用本领域所熟知的剂型即可，优选口服剂，例如片剂，口服液、粉剂等。本发明对所述药品的制备方法没有特殊限制，采用本领域所熟知的药物即可。
本发明提供了一种具有抑制阴沟肠杆菌作用的复合菌剂，包括所述植物乳杆菌SLB01和肠道益生菌。
在本发明中，所述肠道益生菌优选包括格氏乳杆菌、发酵乳杆菌和唾液乳杆菌。通过体外抑菌实验结果表明，格氏乳杆菌、发酵乳杆菌和唾液乳杆菌等多种乳杆菌均具有抑制阴沟肠杆菌作用，因此，可以作为肠道益生菌联合阴沟肠杆菌制备成复合菌剂。本发明验证格氏乳杆菌、发酵乳杆菌和唾液乳杆菌能够与植物乳杆菌SLB01共同培养，不会发生菌种的拮抗作用。本发明对所述共同培养的方法不做具体限定，采用本领域所熟知的复合菌剂的培养方法即可。
下面结合实施例对本发明提供的一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌SLB01及其衍生产品和应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
实施例1
植物乳杆菌SLB01是从广西健康长寿老人的粪便样品中筛选获得。具体地，所述植物乳杆菌SLB01的筛选和鉴定方法如下：
1)称取1.0g新鲜的粪便样品加入9.0mL无菌生理盐水中，震荡混合均匀制成菌悬液。取5mL上述菌悬液加入45mL富集培养基中，37℃厌氧培养7d。富集培养基配方为：胰蛋白胨10.0g、牛心浸粉9g、牛肉粉4.0g、酵母粉2.0g、葡萄糖11.0g、氯化钠2.5g、磷酸氢二钠1.5g、磷酸氢二钾1.0g、柠檬酸氢二铵1.0g、乙酸钠2.5g、硫酸镁0.1g、硫酸锰0.02g、吐温801.0g，蒸馏水1000mL，pH值6.5，115℃灭菌20min。
2)将培养好的富集培养液用无菌生理盐水进行梯度稀释，取适当稀释度的稀释液涂布于MRS显色培养基上。在37℃下厌氧培养4d，挑取有黄色变色圈的菌株进行划线纯化，纯化好的菌株进行斜面保藏备用。MRS显色培养基配方为：蛋白胨10.0g、牛肉粉8.0g、酵母粉4.0g、葡萄糖20.0g、磷酸氢二钾2.0g、柠檬酸氢二铵2.0g、乙酸钠5.0g、硫酸镁0.2g、硫酸锰0.04g、吐温801.0g、溴甲酚紫0.1g、琼脂粉18.0g、蒸馏水1000mL，pH值6.5，115℃灭菌20min。
3)将指示菌阴沟肠杆菌接种于MRS液体培养基中，在37℃下培养至菌体浓度为108CFU/ml。取0.2ml阴沟肠杆菌菌液于一无菌培养皿中，倾入20ml冷却至40℃左右的MRS固体培养基，充分摇匀。待培养基凝固后用无菌牙签挑取保藏的菌株点接于培养基上，在37℃下厌氧培养4d，观察所点接的菌株有无产生抑菌圈并测量抑菌圈大小。挑选抑菌圈大的菌株备用。MRS固体培养基为MRS显色培养基去除溴甲酚紫得到。MRS液体培养基为MRS固体培养基去除琼脂粉得到。
4)将步骤3)中挑选出的菌株加入到pH值3.0的磷酸缓冲液和0.15％猪胆盐溶液中进行耐酸耐胆盐实验，挑选存活率高的菌株。观察该菌株的菌落形态特征：在MRS固体培养基上，菌落呈圆形，乳白色，菌落突起、光滑，边缘整齐，不透明。对所述菌株进行理化检测发现，革兰氏染色后显微镜观察显色，菌株为杆状，革兰氏阳性。
5)对步骤4)中挑选出的存活率较高的菌株进行生理生化鉴定(包括革兰氏染色)，并进行PCR扩增菌株的16S rDNA序列(送上海生工测序)，对序列进行比对分析。结果显示，其中该菌株的序列与NCBI数据库中植物乳杆菌的同源性高达99.73％，因此将该菌鉴定为植物乳杆菌，命名为植物乳杆菌SLB01。该菌株于2020年10月23日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏号为GDMCC No：61178。
实施例2
阴沟肠杆菌的体外抑制实验
方法一：平板抑菌实验
将阴沟肠杆菌接入MRS液体培养基中，37℃厌氧培养活化至菌液浓度为1×108CFU/ml。取0.1ml阴沟肠杆菌菌液于一无菌平皿中，定量倾入14ml温度为40℃的MRS固体培养基，将培养基与菌液混合均匀，静置使平板凝固，制备成阴沟肠杆菌平板。
将待测菌株接入MRS液体培养基中37℃下厌氧培养48h。离心取上清。用无菌镊子将无菌圆形滤纸片在上清液中浸泡片刻，取出将滤纸片贴于阴沟肠杆菌平板中央，盖上盖子。将平板至于37℃下厌氧培养48h，观察滤纸片周围有无抑菌圈并测量抑菌圈直径。每个菌株做三个平行，各菌株抑菌圈的平均值如下表1所示。
表1各菌株抑菌圈的平均值
菌株编号 抑菌圈直径(cm)
植物乳杆菌SLB01 2.59
植物乳杆菌M910 2.50
发酵乳杆菌B713 2.65
格氏乳杆菌M982 2.40
唾液乳杆菌B762 2.36
格氏乳杆菌M213 2.50
由表1结果可知，本发明筛选的植物乳杆菌SLB01对阴沟肠杆菌的抑菌圈直径为2.59cm，较其他乳杆菌菌株相比，有明显的优势。
方法二：液体抑菌实验
将阴沟肠杆菌及待测菌株用液体培养基活化24h，活化结束后将菌液浓度调整至同一数量级。取无菌培养管装入81ml MRS液体培养基，实验组接入1ml阴沟肠杆菌菌液及1ml待测菌液，对照组接入1ml阴沟肠杆菌菌液及1ml无菌水，混匀后置于37℃培养24h。培养结束将培养液梯度稀释后涂布于MRS平板进行平板计数。计数结果入下表2所示。
表2不同菌株对阴沟肠杆菌的抑菌情况
Figure BDA0002895430790000071
实施例3
耐酸耐胆盐实验
菌悬液制备：将菌株从保藏斜面上转接活化2次，用无菌生理盐水将菌体从斜面上洗下制备成菌悬液，并将菌悬液浓度调整至1×109CFU/ml。
耐酸实验：实验组：取0.1ml菌悬液添加入2mL pH值3.0的磷酸盐缓冲液中，在37℃厌氧培养3h；培养结束将菌液梯度稀释后涂布于MRS平板进行平板计数。对照组：用无菌生理盐水替代pH值3.0的磷酸盐缓冲液，其余操作相同。根据公式I计算存活率。
存活率＝(实验组平板菌落数/对照组平板菌落数)×100％ 式I
耐酸耐胆盐实验：实验组：取0.1ml菌悬液添加入2mL pH值3.0的磷酸盐缓冲液中，37℃厌氧培养1h；从培养结束的pH值3.0的磷酸盐缓冲液中取1ml加入到9ml猪胆盐浓度为0.15％的溶液中，37℃厌氧培养48h；培养结束将菌液梯度稀释后涂布于MRS平板进行平板计数。对照组：用无菌生理盐水替代pH值3.0的磷酸盐缓冲液及0.15％猪胆盐溶液，其余操作相同。根据公式I计算存活率。
存活率统计结果如下表3所示。
表3不同菌株的耐酸及耐酸耐胆盐结果
菌株编号 耐酸实验存活率(％) 耐酸耐胆盐实验存活率(％)
植物乳杆菌SLB01 86.42 73.75
植物乳杆菌M910 79.67 64.19
发酵乳杆菌B713 69.13 61.55
格氏乳杆菌M982 88.21 67.69
唾液乳杆菌B762 39.58 34.17
格氏乳杆菌M213 67.86 69.34
实施例4
植物乳杆菌SLB01冻干菌粉的制备方法
将植物乳杆菌SLB01接种至MRS固体培养基中进行活化，将活化后的菌株接种至MRS液体培养基中制备种子液。制备好的种子液以2％接种量接种至MRS液体培养基中，在37℃下培养24h进行大批量发酵。发酵结束镜检确认无污染后，将菌液在4℃条件下4000～6000r/min离心10min收集菌体。
在收集好的菌体中按1:1加入脱脂乳粉等常规冻干保护剂，混合均匀制备成菌悬液。将菌悬液转移至冻干容器中，梯度降温至-80℃冷冻，再用真空冷冻干燥机进行冻干，即可得到植物乳杆菌SLB01菌粉。
实施例5
阴沟肠杆菌的体内抑制应用
将实施例4制备的植物乳杆菌SLB01菌粉与常规辅料(如硬脂酸镁)用常规工艺混合均匀并压片制成含有植物乳杆菌SLB01的口服片。
将22名受试者随机分成两组，第一组每日餐后食用一片含有植物乳杆菌SLB01的口服片，第二组每日餐后食用一片未添加植物乳杆菌SLB01的空白对照口服片，连续食用1个月，监测受试者食用口服片前后肠道内阴沟肠杆菌的数量变化。
肠道微生物检测采用高通量测序方法。在食用口服片前以及食用口服片1个月后采集受试者新鲜的粪便样品，提取粪便样品中所有微生物的总DNA，通过高通量测序分析样品中微生物的组成及数量进而评价实验效果。受试者食用口服片1个月后肠道中的阴沟肠杆菌数量较食用前降低5％以上即判定有效，否则判定无效。各组的有效率＝(该组有效受试者人数/该组总人数)×100％。各组有效率统计结果如下表4所示。
表4植物乳杆菌SLB01体内抑制阴沟肠杆菌结果
组别 有效率
植物乳杆菌SLB01组 63.6％
空白对照组 18.2％
实施例6
含有植物乳杆菌SLB01的发酵牛乳的制备方法
将脱脂牛乳按常规工艺进行巴氏杀菌，冷却至37℃后加入植物乳杆菌SLB01菌粉，搅拌均匀。在37℃条件下发酵8h，即得含有植物乳杆菌SLB01的发酵牛乳。
以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

Claims (8)

1.一株对阴沟肠杆菌具有抑制作用的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)SLB01，其特征在于，所述植物乳杆菌SLB01的保藏编号为GDMCC No：61178。
2.一种对阴沟肠杆菌具有抑制作用的产品，其特征在于，包括权利要求1所述植物乳杆菌SLB01。
3.根据权利要求2所述对阴沟肠杆菌具有抑制作用的产品，其特征在于，所述产品包括由所述植物乳杆菌SLB01发酵制备的发酵制品、由所述植物乳杆菌SLB01制备的菌剂和/或含所述植物乳杆菌SLB01的保健品或食品。
4.权利要求1所述植物乳杆菌SLB01在制备治疗肥胖的药物中的应用。
5.根据权利要求4所述应用，其特征在于，所述肥胖是由阴沟肠杆菌引起的肥胖症。
6.权利要求1所述植物乳杆菌SLB01在制备治疗肠道菌群失衡的药物中的应用。
7.一种具有抑制阴沟肠杆菌作用的复合菌剂，其特征在于，包括权利要求1所述植物乳杆菌SLB01和肠道益生菌。
8.根据权利要求7所述复合菌剂，其特征在于，所述肠道益生菌包括格氏乳杆菌、发酵乳杆菌和唾液乳杆菌。
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