CN114262671B - 一株可用于防治胆汁淤积型肝病的瑞士乳杆菌及其应用 - Google Patents
一株可用于防治胆汁淤积型肝病的瑞士乳杆菌及其应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一株分离自传统乳制品的瑞士乳杆菌HH‑LPH17，所述瑞士乳杆菌保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2021725，保藏日期为2021年6月15日。该瑞士乳杆菌具有良好的胃酸耐受性、胆盐耐受性，细胞粘附能力强；具有良好的保存稳定性，可有效抑制肝脏中胆汁酸的淤积，抑制血清中转氨酶含量的升高，在预防和治疗胆汁淤积型肝病方面具有良好的应用前景。
Description
技术领域
本发明属于微生物技术以及益生菌药物领域，具体涉及一株可用于防治胆汁淤积型肝病 的瑞士乳杆菌及其应用。
背景技术
胆汁淤积性肝病是一组以胆汁淤积为主要表现的临床常见疾病，其是由于胆汁流形成、 分泌和排泄障碍，胆汁流不能正常流入十二指肠，而在肝脏中滞留、并进入血液循环的临床 综合征。肝脏肝内胆汁淤积可加重肝脏损害，严重者可导致肝衰竭甚至死亡。针对肝内胆汁 淤积，临床治疗药物尚显不足，迫切需要研发新的治疗药物。
益生菌是对人体健康有益的微生物的总称，随着近年来对益生菌的深入研究，益生菌对 人类健康的作用越来越多地被发掘，逐渐被应用于各种疾病的预防和治疗，益生菌越来越受 到人们的重视，临床研究证明，益生菌对胃肠道疾病具有积极的治疗作用；但是不同种类的 益生菌细胞成分以及分泌物质不同其在人类健康中所发挥的作用不同；而胆汁淤积性肝病的 特点是肠道生态失调和过量的毒性肝胆汁酸(BAs)；因此探究具有改变肠道微环境同时抑制 BA合成的益生菌在治疗胆汁淤积性肝病方面具有积极意义。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供了一株瑞士乳杆菌，本发明还提供了 所述的瑞士乳杆菌的应用，在防治胆汁淤积型肝病方面的应用。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案是：
一株可用于防治胆汁淤积型肝病的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)HH-LPH17，所 述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)HH-LPH17保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏单 位地址为：中国，武汉，武汉大学，保藏号为CCTCC NO：M2021725，保藏日期为2021年 6月15日。
进一步地，所述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)HH-LPH17分离自传统乳制品；该 菌株经测序分析，其16SrRNA序列如SEQ ID NO.1所示，将测序得到的序列与NT数据库进 行比对，获得近源物信息，为瑞士乳杆菌，菌株号为HH-LPH17。
进一步地，所述瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)HH-LPH17在选择培养基上菌落呈 现小的白色菌落。
进一步地，所述的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)HH-LPH17的菌体细胞大小为： 直径为0.6-0.9μm，长度为1.5-6μm。
进一步地，所述的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)HH-LPH17在防治胆汁淤积型肝 病方面的应用。
进一步地，所述的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)HH-LPH17具有良好的胃酸耐受 性、胆盐耐受性，细胞粘附能力强；具有良好的保存稳定性。
进一步地，所述的瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)HH-LPH17可以有效地抑制肝脏 中胆汁酸的淤积，抑制血清中转氨酶含量的升高。
本发明的有益效果
本发明提供了可用于防治胆汁淤积型肝病的瑞士乳杆菌(Lactobacillushelveticus) HH-LPH17，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2021725。
本发明的瑞士乳杆菌具有良好的胃酸耐受性、胆盐耐受性，细胞粘附能力强；具有良好 的保存稳定性，可有效抑制肝脏中胆汁酸的淤积，抑制血清中转氨酶含量的升高，在预防和 治疗胆汁淤积型肝病方面具有良好的应用前景。
附图说明
图1是本发明的瑞士乳杆菌HH-LPH17的镜检图；
图2是本发明的瑞士乳杆菌HH-LPH17的耐胃酸性；
图3是本发明的瑞士乳杆菌HH-LPH17的耐胆盐性；
图4是本发明的瑞士乳杆菌HH-LPH17对胆管结扎小鼠肝脏中胆汁酸含量的影响；
图5是本发明的瑞士乳杆菌HH-LPH17对胆管结扎小鼠血清中ALT含量的影响；
图6是本发明的瑞士乳杆菌HH-LPH17对胆管结扎小鼠血清中AST含量的影响；
具体实施方式
下面将结合具体实施例对本发明的技术方案进行详细描述，实施例中所述的试验方法若 无特殊说明均为常规方法，所述的试剂和生物材料，若无特殊说明，均可从商业途径获得； 同时下列实施例仅用于说明本发明，而不应视为限定本发明的范围。
实施例1
瑞士乳杆菌HH-LPH17菌株的筛选以及鉴定
1.菌种筛选
取传统乳制品，在超净工作台上进行无菌操作以及均质处理后，用接种针蘸取1环，转 接在MRS琼脂固体培养基上，进行划线操作，在36℃～38℃培养24～48h，再挑取单菌落， 用显微镜镜检有无杂菌；如菌落不纯，重复上述划线操作，直至单菌落镜检无杂菌为止；最 终获得单菌落瑞士乳杆菌，菌落呈乳白色圆形，边缘整齐，菌体形态呈杆状(通常为0.6～0.9μm×1.5～6.0μm)，成对或以短链形式存在。
所述的MRS琼脂固体培养基由葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、乙酸钠0.5％、柠檬酸氢二铵0.25％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％、吐温-80 0.1％、琼脂1.8％组成，pH6.8～7.0；
用MRS液体培养基发酵培养获得的单菌落菌种后获得发酵菌液，保藏得到瑞士乳杆菌 HH-LPH17菌株；
所述的MRS液体培养基是由葡萄糖2％、蛋白胨1％、牛肉膏1％、酵母膏0.5％、乙酸钠0.5％、柠檬酸氢二铵0.25％、磷酸氢二钾0.2％、硫酸镁0.058％、硫酸锰0.025％、吐温-80 0.1％组成，pH6.8～7.0。
2.菌种鉴定
分离、纯化菌种：经16SrRNA基因作为Marker片段，通用引物扩增出基因中16SrRNA序列，再进行电泳检测，使用3730XL测序仪进行一代双末端测序，获得abi测序峰图文件，通过软件组装后，与NT数据库进行比对，获得近源物信息，为瑞士乳杆菌，菌株编号为 HH-LPH17，其16SrRNA特征序列如SEQ ID NO.1所示：
gcccagtgggggtgctatacatgcaagtcgagcgagcagaaccagcagatttacttcggtaatgacgctggggacgcgagcggcggatgggt gagtaacacgtggggaacctgccccatagtctaggataccacttggaaacaggtgctaataccggataataaagcagatcgcatgatcagcttat aaaaggcggcgtaagctgtcgctatgggatggccccgcggtgcattagctagttggtaaggtaacggcttaccaaggcaatgatgcatagccg agttgagagactgaacggccacattgggactgagacacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaa gtctgatggagcaacgccgcgtgaggtgaagaaggttttcggatcgtaaagctctgttgttggtgaagaaggatagaggtagtaactggcctttat ttgacggtaatcaaccagaaagtcacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgggcgta aagcgagcgcaggcggaaagaataagtctgatgtgaaagccctcggcttaaccgaggaattgcatcggaaactgtttttcttgagtgcagaaga ggagagtggaactccatgtgtagcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgcaactgacgctg aggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtccatgccgtaaacgatgagtgctaagtgttgggaggtttccgcctctca gtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaagggttgaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcgg tggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttaccaggtcttgacatctagtgccatcctaagagattaggagttccctttcggggac gctaagacaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagttcccgcaacgagcgcaacccttattattagttgccagc attaagttgggcactctaatgagactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgcccctta tgacctgggctacacacgtgctacaatgggcagtacaacgagaagcgagcctgcgaaggcaagcgaatctctgaaagctgttctcagttcgga ctgcagtctgcaactcgactgcacgaagctggaatcgctagtaatcgcggatcagaacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacacc gcccgtcacaccatggaagtctgcaatgcccaaagccggtggcctaaccttcggaaggagccgtctaagcagcaattggcg
3.菌种保藏
瑞士乳杆菌(Lactobacillus helveticus)HH-LPH17，保藏于中国典型培养物保藏中心，保 藏编号为CCTCC NO：M2021725，保藏日期为2021年6月15日。
4.菌种生理生化检测，检测结果如表1所示。
表1.
| 项目 | 结果 |
| 发酵代谢 | 同型发酵，发酵过程中主要产生乳酸 |
| 革兰氏染色 | + |
| 过氧化氢酶 | - |
| β-半乳糖苷酶 | + |
| 最适生长温度 | 37℃ |
| 需氧量 | 兼性厌氧 |
| 过氧化氢产生 | 低水平 |
5.菌种的API50 CHL测试，结果如表2所示。
表2.API50 CHL测试
注：-表示阴性；+表示阳性；
实施例2
瑞士乳杆菌HH-LPH17的性质评价
(1)胃酸耐受性评价
将所述的瑞士乳杆菌HH-LPH17进行活化后，分别接种于对照组的培养基以及pH＝2、pH＝3的MRS培养基中(接种量1％)，于37℃培养，分别记录培养1h、2h、4h的活菌数， 结果如图2所示。
由图2数据可以看出，在pH＝2.0(模拟胃酸的极端酸性)条件下，瑞士乳杆菌在培养时 间达到4h时，活菌数衰减小于1个数量级，依然含有较高的活性，因此说明本发明的瑞士乳 杆菌HH-LPH17具有较好的耐酸性。
(2)胆盐耐受性评价
将所述的瑞士乳杆菌HH-LPH17进行活化后，分别接种于对照组培养基，以及加入质量 分数分别为0.20％、0.30％的猪胆盐的培养基中(接种量1％)，于37℃培养，分别记录培养 1h、2h、4h的活菌数；结果如图3所示。
由图3数据可以看出，在胆盐浓度为0.3％(模拟人体肠道胆盐浓度)条件下，瑞士乳杆 菌在培养时间达到4h时，活菌数衰减量仅为小于1个数量级，依然含有较高的活性，因此说 明本发明的瑞士乳杆菌HH-LPH17具有较好的胆盐耐受性。
(3)细胞粘附能力
瑞士乳杆菌HH-LPH17对结肠上皮细胞HT-29的黏附能力：将1.0×106CFU/mL的瑞士 乳杆菌HH-LPH17加入含有HT-29细胞(细胞汇合度90％左右)的24孔板中，于37℃，5％CO2的恒温培养箱中培养3小时。培养结束后，用无菌PBS润洗3次以去除未黏附的瑞士乳 杆菌。之后，加入1mL 0.05％的胰蛋白酶-EDTA，于37℃，5％CO2的恒温培养箱中消化30 分钟使细胞与培养板底部脱离。然后进行离心，去除上清液，在离心沉淀中加入100μL牛血 清蛋白进行处理。将处理后的溶液进行梯度稀释，然后进行细菌的平板计数(MRS培养基， 37℃，48小时)。对照组中未添加瑞士乳杆菌HH-LPH17，其余操作与实验组一致，在进行 牛血清蛋白处理前需采用血球计数板进行细胞计数。综合实验组中细菌平板计数的结果以及 对照组中血球计数的结果，可得出瑞士乳杆菌HH-LPH17对于HT-29细胞的黏附能力；由实 验结果可知平均每个结肠上皮细胞HT-29被1.71个瑞士乳杆菌HH-LPH17细胞黏附，本发明 的瑞士乳杆菌对结肠上皮细胞HT-29具有良好的粘附能力。
同时本发明还验证了本发明瑞士乳杆菌HH-LPH17对其他种类细胞的粘附能力，经体外 细胞实验证实，本发明瑞士乳杆菌HH-LPH17对结肠上皮细胞T85、结肠上皮细胞HT-29、 人食管癌细胞KYSE-30、人喉癌上皮细胞Hep-2等多种细胞均具有黏附能力；且对结肠上皮 细胞HT-29及人食管癌细胞KYSE-30的黏附能力较强，在浓度为1.0×106CFU/ml的处理条 件下，平均每个结肠上皮细胞HT-29和人食管癌细胞KYSE-30可分别被1.71个和2.43个瑞 士乳杆菌HH-LPH17细胞黏附。
(4)保存稳定性
将本发明的瑞士乳杆菌HH-LPH17分别于4℃、25℃保存，测试其保存稳定性，测试结 果如表3和表4所示。
表3. 4℃下保存稳定性
| 保存时间(月) | 0 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 |
| 活菌数(CFU) | 2.58×1011 | 2.29×1011 | 1.99×1011 | 1.68×1011 | 1.39×1011 | 1.31×1011 |
| 存活率(％) | 100 | 89 | 77 | 65 | 54 | 51 |
表4. 25℃下保存稳定性
| 保存时间(月) | 0 | 3 | 6 | 12 | 18 | 24 |
| 活菌数(CFU) | 2.42×1011 | 1.33×1011 | 1.02×1011 | 8.23×1010 | 5.57×1010 | 4.36×1010 |
| 存活率(％) | 100 | 55 | 42 | 34 | 23 | 18 |
由表3和表4可以看出，在2年的保存周期内，本发明的瑞士乳杆菌HH-LPH17在4℃和25℃保存条件下，活菌数衰减均在1个数量级以内，说明了本发明的瑞士乳杆菌HH-LPH17具有良好的稳定性；
(5)抗生素敏感性
对本发明的瑞士乳杆菌HH-LPH17的抗生素敏感性进行了测试，测试结果如表5所示。
表5.抗生素敏感性
由表5可以看出，本发明的瑞士乳杆菌HH-LPH17具有抗生素敏感性，体现出本发明的 瑞士乳杆菌HH-LPH17菌株内不含有耐药基因，不具有耐药性，菌株具有安全性。
实施例3
瑞士乳杆菌HH-LPH17对胆汁淤积性肝病的影响实验
1、实验材料准备
(1)瑞士乳杆菌菌种
取保存于-80℃超低温冰箱的本发明筛选培养获得的瑞士乳杆菌HH-LPH17菌种，经过活 化、逐级扩培，接种于5000L发酵罐中进行培养。发酵结束后，离心去除上清液，收集菌泥； 之后，采用乳化工艺将菌泥与预先配置好的冻干保护剂进行充分混合，最后经真空冷冻干燥 制成冻干粉，备用；
(2)鼠李糖乳杆菌LGG菌种为从市售商品(购自科汉森股份有限公司(Chr.HansenA/S)) 中分离得到。
(3)干酪乳杆菌PB-LC39菌种来自于郑州和合生物工程技术有限公司。
2、动物模型的构建以及分组
将70只SPF级C57BL/6实验小鼠(雄性，体重20-23g)于室温20±2℃，湿度50±5％进 行为期1周的适应性培养：喂食SPF级饲料，定时更换垫料以保证环境的洁净干燥，并辅以 12小时光照/黑暗来模拟昼夜节律；
将适应性培养后的SPF级C57BL/6实验小鼠随机分成7组(分别为假手术组、阳性对照 组、空白对照组、实验组1、实验组2、实验组3、实验组4)，每组10只；其中假手术组小 鼠除了不进行胆管结扎外其他处理和实验组小鼠相同，其余6组小鼠进行胆管结扎手术；对小鼠进行每天一次灌胃的方式连续灌胃14天：假手术组小鼠每日灌胃同体积无菌磷酸盐缓冲 液(PBS)；阳性对照组(LGG组)小鼠每日口服灌胃109CFU鼠李糖乳杆菌LGG；对照组 (空白对照组)小鼠每日口服灌胃同体积无菌磷酸盐缓冲液(PBS)；实验组1(低剂量组) 小鼠每日口服灌胃108CFU瑞士乳杆菌HH-LPH17；实验组2(高剂量组)小鼠每日口服灌胃 109CFU瑞士乳杆菌HH-LPH17；实验组3(混合组)小鼠每日口服灌胃5×108CFU瑞士乳杆 菌HH-LPH17及5×108CFU干酪乳杆菌PB-LC39；实验组4(无菌上清液组)小鼠每日口服 灌胃同体积的瑞士乳杆菌HH-LPH17的发酵上清液(无菌)；期间小鼠给予定时定量的饮用 水和SPF级饲料饲喂；同时定时更换垫料以保证环境的洁净干燥，并辅以12小时光照/黑暗 来模拟昼夜节律；对小鼠的生长情况进行跟踪观察，记录小鼠的生长情况；完成第14天灌胃 后，对小鼠进行禁食24小时后，采取小鼠血液对各项生化指标进行检测，检测结果如图4、 图5、图6所示。
图4是不同处理组小鼠肝脏中胆汁酸含量；由图4可以看出，实施胆管结扎之后(对照 组)小鼠肝脏中胆汁酸含量显著升高；通过灌胃益生菌可以降低肝脏中胆汁酸含量；其中灌 胃相同剂量的瑞士乳杆菌(实验组2)和鼠李糖乳杆菌(阳性对照组)，实验组2的小鼠肝 脏胆汁酸含量低于阳性对照组；肝脏中胆汁酸降低程度与使用剂量有关，高剂量组(实验组 2)的效果好于低剂量组(实验组1)，无菌上清液组降低胆汁酸含量效果较差。混合组(实 验组3)中瑞士乳杆菌和干酪乳杆菌混合菌种对胆汁酸含量降低最明显，瑞士乳杆菌和干酪 乳杆菌互相具有协同作用，可促进彼此的生长，表现出更高的细胞活性，干酪乳杆菌对瑞士 乳杆菌降低胆汁酸含量具有增效作用。
由图5可以看出，实施胆管结扎之后小鼠血清中ALT含量显著升高，通过灌胃益生菌可 以降低血清中ALT含量，血清ALT降低程度与使用剂量有关，高剂量组的效果好于低剂量 组，无菌上清液效果较差；高剂量瑞士乳杆菌HH-LPH17组效果要好于LGG阳性对照组。
由图6可以看出，实施胆管结扎之后小鼠血清中AST含量显著升高；通过灌胃益生菌可 以降低血清中AST含量；血清AST降低程度与使用剂量有关，高剂量组的效果好于低剂量 组，无菌上清液效果较差；高剂量瑞士乳杆菌HH-LPH17组效果要好于LGG阳性对照组。
综上所述，本发明的瑞士乳杆菌能够有效抑制小鼠肝脏中胆汁酸淤积；能够有效抑制小 鼠血清转氨酶含量的升高，对胆汁淤积造成的肝损伤具有保护作用；在预防胆汁淤积型肝病 方面具有良好的应用前景。
以上所述实施例仅表达了本发明的具体实施方式，其描述较为具体和详细，但并不能因 此而理解为对本发明专利范围的限制。应当指出的是，对于本领域的普通技术人员来说，在 不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干改进，这些都属于本发明的保护范围。因此， 本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
序列表
<120> 一株可用于防治胆汁淤积型肝病的瑞士乳杆菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1474
<212> DNA/RNA
<213> Lactobacillus helveticus
<400> 1
gcccagtggg ggtgctatac atgcaagtcg agcgagcaga accagcagat ttacttcggt 60
aatgacgctg gggacgcgag cggcggatgg gtgagtaaca cgtggggaac ctgccccata 120
gtctaggata ccacttggaa acaggtgcta ataccggata ataaagcaga tcgcatgatc 180
agcttataaa aggcggcgta agctgtcgct atgggatggc cccgcggtgc attagctagt 240
tggtaaggta acggcttacc aaggcaatga tgcatagccg agttgagaga ctgaacggcc 300
acattgggac tgagacacgg cccaaactcc tacgggaggc agcagtaggg aatcttccac 360
aatggacgca agtctgatgg agcaacgccg cgtgaggtga agaaggtttt cggatcgtaa 420
agctctgttg ttggtgaaga aggatagagg tagtaactgg cctttatttg acggtaatca 480
accagaaagt cacggctaac tacgtgccag cagccgcggt aatacgtagg tggcaagcgt 540
tgtccggatt tattgggcgt aaagcgagcg caggcggaaa gaataagtct gatgtgaaag 600
ccctcggctt aaccgaggaa ttgcatcgga aactgttttt cttgagtgca gaagaggaga 660
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gcggctctct ggtctgcaac tgacgctgag gctcgaaagc atgggtagcg aacaggatta 780
gataccctgg tagtccatgc cgtaaacgat gagtgctaag tgttgggagg tttccgcctc 840
tcagtgctgc agctaacgca ttaagcactc cgcctgggga gtacgaccgc aagggttgaa 900
actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggtggagc atgtggttta attcgaagca 960
acgcgaagaa ccttaccagg tcttgacatc tagtgccatc ctaagagatt aggagttccc 1020
tttcggggac gctaagacag gtggtgcatg gctgtcgtca gctcgtgtcg tgagatgttg 1080
ggttaagttc ccgcaacgag cgcaaccctt attattagtt gccagcatta agttgggcac 1140
tctaatgaga ctgccggtga caaaccggag gaaggtgggg atgacgtcaa gtcatcatgc 1200
cccttatgac ctgggctaca cacgtgctac aatgggcagt acaacgagaa gcgagcctgc 1260
gaaggcaagc gaatctctga aagctgttct cagttcggac tgcagtctgc aactcgactg 1320
cacgaagctg gaatcgctag taatcgcgga tcagaacgcc gcggtgaata cgttcccggg 1380
ccttgtacac accgcccgtc acaccatgga agtctgcaat gcccaaagcc ggtggcctaa 1440
ccttcggaag gagccgtcta agcagcaatt ggcg 1474
Claims (1)
1.一株可用于防治胆汁淤积型肝病的瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）HH-LPH17，其特征在于，所述瑞士乳杆菌（Lactobacillus helveticus）HH-LPH17保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M2021725，保藏日期为2021年6月22日。
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