CN109679882B - 一株屎肠球菌dt1-1及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一株益生菌—屎肠球菌DT1‑1及其应用。本发明的菌株于2018年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.16603。本发明的这一株屎肠球菌DT1‑1具有黏附性强及抑菌性好，有很好的耐酸、耐胃肠道及耐胆盐能力，可在草食动物饲养中的应用，也可在制备草食动物的饲料添加剂中的应用，或者在制备草食动物的饲料中的应用。

Description

一株屎肠球菌DT1-1及其应用

技术领域

本发明涉及一株屎肠球菌DT1-1及其应用。

背景技术

20世纪以来，饲料中添加抗生素对集约化畜牧业发展做出重大贡献的同时，其产生的副作用如内源性感染和二重感染、耐药性的产生、肠道正常菌群的破坏和畜产品及环境中的残留等对养殖业、动物以及人类食品安全带来严重威胁，也高度引起了人们的重视。而益生菌制剂就是以活的微生物为主，宿主摄入一定量后，在胃肠道特定部位有一定数量的菌株能够黏附、定植和生长，主要通过调节肠道微生物菌群结构和平衡，对动物生长和健康起到有益作用的制剂，是一种良好的替代抗生素的新型绿色安全添加剂。

但大多益生菌对饲料加工中的制粒工艺的高温、运输及胃肠液和胆汁的耐受性较差，进入肠道的活乳酸菌的种类和数量不多，因此筛选获得耐高温、耐胃肠液和胆汁的益生菌是解决这一系列的问题的关键。

发明内容

本发明提供一种可调节肠道微生物菌群结构和平衡，对动物生长和健康起到有益作用的益生菌。

本发明所述的益生菌是一株屎肠球菌DT1-1(Enterococcus faecium DT1-1)，于2018年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.16603。

本发明所述的屎肠球菌DT1-1可在草食动物饲养中的应用，也可在在制备草食动物的饲料添加剂中的应用，还可在制备草食动物的饲料中的应用。

屎肠球菌(Enterococcus faecium)，是人和动物肠道中的优势菌群，是一种无芽孢、无鞭毛的革兰氏阳性菌，形状多为圆形或椭圆形，主要以成对或链状排列，直径约为0.5～1.0μm。其菌落呈圆形、乳白色，表面凸起，边缘整齐，湿润光泽。其生长繁殖迅速，不含过氧化氢酶，兼性厌氧或需氧型。

屎肠球菌具有较好的抗逆性，对高温、高盐、酸碱有较好的耐受性，能够促进各类营养物质如氨基酸、维生素、促生长因子等的吸收和代谢，对部分抗生素也有良好耐受性。屎肠球菌能定植于宿主肠道并生长繁殖，诱导宿主分泌产生免疫活性物质，如干扰素和白细胞介素等，增强宿主应对不良环境的免疫应答能力，降低宿主炎症水平；还能产生乳酸、过氧化氢、细菌素等抗菌物质，能够抑制肠道中致病菌及腐败菌的生长繁殖，减少肠道内内毒素的含量，降低腹泻率和死亡率，同时还可促进动物的消化吸收，改善肠道内微生态平衡，提高采食量及饲料转化率，提高免疫力并保障宿主健康。1984年FDA将屎肠球菌列为饲料用安全菌种；2013年我国农业部发布的《饲料添加剂品种目录(2013)》中，屎肠球菌也位列其中。

屎肠球菌是一种兼性厌氧乳酸菌，相对于严格厌氧、培养保存条件苛刻的双歧杆菌、乳杆菌来说，屎肠球菌更便于生产和使用。大量研究表明，直接饲喂含有屎肠球菌的微生态制剂可提高畜禽的体增重，增加空肠和盲肠中乳杆菌数量，降低肠道pH，增强免疫力，改善抗氧化功能，提高饲料利用率，降低腹泻率及死亡率。因此，屎肠球菌在畜牧生产中有广泛的应用前景。

本发明的这一株屎肠球菌DT1-1具有黏附性强及抑菌性好，有很好的耐酸、耐胃肠道及耐胆盐能力。

附图说明

图1 DT1-1的菌落形态图。

图2 DT1-1的革兰氏染色图。

图3 DT1-1的PCR扩增片段图谱。

图4 DT1-1的生长曲线图。

图5 DT1-1药敏图。

图6 DT1-1对产气荚膜梭菌的抑菌图。

具体实施方式

以下对本发明作详细解说。

1.菌株的分离

本发明的屎肠球菌DT1-1(Enterococcus faecium DT1-1)是从青海健康牦牛粪便中分离获得的。本发明的菌株分离纯化方法是：称取牦牛粪便10g，用100mL TS Broth稀释混匀过滤后，取1mL混匀液分别稀释10^-4，10^-5，10^-6次方，各取0.1mL涂布于含钙的MRS平板上，待稀释液被平板吸收后，37℃厌氧培养24h。挑选出具有溶钙圈疑似乳酸菌的单菌落32个，分别在MRS固体平板上划线纯化培养3次，经16S分子鉴定确定12株为屎肠球菌(Enterococcus faecium)，各挑一单菌落于MRS液体培养基中37℃静置培养24h，取发酵菌液进行抗逆性以及体外益生特性试验，最终挑选出1株黏附性强及抑菌性好，有很好的耐酸、耐胃肠道及耐胆盐能力的菌株保存并命名为DT1-1。于2018年10月22日提交并保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为CGMCC NO:16603。

本发明前述使用的培养基的配方如下：

(1)MRS培养基(1L)：蛋白胨10.0g；牛肉浸粉10.0g；酵母浸粉5.0g；葡萄糖20.0g；吐温80 1.0mL；K2HPO4·3H2O 2.0g；无水乙酸钠5.0g；柠檬酸三铵2.0g；MgSO4·7H2O0.29g；MnSO4·H2O 0.058g。(将以上成分加入蒸馏水中，定容到1000mL，加热溶解，调节pH为6.3，分装后121℃高压灭菌20min。(注：固体培养基在此基础上加1.5％琼脂粉)

(2)营养肉汤培养基(1L)：蛋白胨10.0g，牛肉膏3.0g，氯化钠5.0g。将以上成分加入蒸馏水中，定容到1000mL，加热溶解，调节pH为7.3±0.2，分装后121℃高压灭菌20min。(注：固体培养基在此基础上加1.5％琼脂粉)

(3)LB培养基(1L)：胰蛋白胨10.0g，氯化钠10.0g，酵母浸粉5.0g，琼脂20.0g，pH调节为7.5±0.2。

(4)TS培养基(1L)：胰蛋白胨1.0g；NaCl 8.5g。将以上成分加入蒸馏水中，定容到1000mL，分装后121℃高压灭菌20min。

2.菌种的鉴定

2.1菌种的形态观察

对本发明的屎肠球菌DT1-1进行菌落形态观察(图1)，革兰氏染色，其电子显微镜观察菌体形态参见(图2)。在MRS平板上，菌DT1-1的菌落呈圆形、乳白色，表面光滑湿润、凸起，边缘整齐。革兰氏染色显示阳性，显微镜下菌体细胞呈球状，单个、成对、四联或不规则堆团，大小为0.6～2.0μm×0.6～2.5μm，无鞭毛、运动性和内生孢子。

2.2生理生化特征的鉴定

本发明的屎肠球菌DT1-1生理生化特征见表1，具体为：明胶实验和吲哚实验显示阴性，奈试产氨实验为阳性，VP、MR、淀粉水解、过氧化氢实验显示阴性，说明该菌能分解利用大分子含氮物质，不能将葡萄糖分解产生丙酮酸，不能产生淀粉酶将淀粉水解为糖类物质，不能利用明胶。同时本发明的屎肠球菌DT1-1能发酵利用α-乳糖、D-果糖、麦芽糖、葡萄糖、蔗糖产酸，不产气。

表1菌DT1-1的生理生化特征

表示阳性；“-”表示阴性)；糖类发酵实验结果记录表：(“+，+”表示产酸，产气；“-，-”表示不产酸，不产气。)

2.2本发明的屎肠球菌DT1-1的分子生物学鉴定

①细菌基因组DNA的提取采用Takara公司的细菌基因组DNA提取试剂盒提取，提取后将DNA分装于EP管中，-20℃冻存，备用。②16S r DNA序列的PCR扩增利用细菌通用引物27F和1492R进行目的基因扩增。PCR反应程序如下：95℃预变性5min，95℃变性45s，55℃退火45s，72℃延伸1min，进行35个循环；最后72℃延伸8min。将扩增产物用1％的琼脂糖凝胶电泳检测得到目的片段长约为1500bp(图3)，回收、纯化后委托南京金斯瑞生物科技有限公司完成测序，得到的实际有效核苷酸序列为1427bp，在NCBI数据中对各16S r DNA序列进行Blast比对分析，得到序列与Enterococcus faecium的序列同源性大于99％。因此，通过菌种的细胞形态、生理生化特征和16S r DNA序列等实验数据综合确定该菌株属于肠球菌属，最终确定为屎肠球菌(Enterococcus faecium)。将DT1-1基因序列提交NCBI数据库中，进行细菌登入号的申请，申请得到的登录号为MK208491。

3.屎肠球菌DT1-1的微生物学特性研究

3.1屎肠球菌DT1-1母液的制备

从液氮罐中取出30％甘油保存的屎肠球菌DT1-1冻存管，放置于37℃温水中迅速融化，取菌液划线接种于MRS平板上，37℃厌氧培养24h，挑取单菌落接种于10mL的MRS培养基中，37℃，恒温培养18h，连续传代两次，即制成菌种母液备用。

3.2屎肠球菌DT1-1生长曲线以及pH的测定

取3.1中本发明的屎肠球菌DT1-1母液(下同)分别接种于三瓶装有100mL MRS的瓶中，37℃恒温培养，以未接菌的液体培养基为对照，分别在发酵后0-24(h)的不同时间段内取样测定菌体OD(600nm)值以及pH，结果表明(图4)，本发明的屎肠球菌DT1-1发酵到2h时进入对数生长期，2-10h内OD值几乎呈现直线增长，培养12h以后细菌进入稳定期，此时菌体OD(600nm)值为3.528±0.07。生长曲线的测定，24h后菌株的OD值未有较大的下降，说明该菌稳定性强。而产酸曲线的测定，从图4可知，在2h内pH值变化较小，产酸较少；2-12h内pH值下降较快，产酸较多；培养12h之后，pH值下降速度减缓最终稳定在4.3左右。生长曲线和产酸曲线有较好的吻合性，共同指出在对数生长期菌株活跃程度高、产酸能力强；同时该菌株具有延滞期短、稳定期长的特点。

3.3菌DT1-1最适发酵温度的测定

取本发明的屎肠球菌DT1-1母液各100μL分别接种于装有10mL MRS培养基的试管中，25、30、35、40、45、50(℃)恒温培养18h，采用平板计数法测定发酵液菌落数，结果表明(表2)，本发明的屎肠球菌DT1-1的最适生长温度为35℃，菌落数达到1.20±0.16×10⁹CFU/mL；在25℃时，也到达8.80±0.29×10⁸CFU/mL，由此，菌DT1-1可以室温发酵，在生产中有利于节约成本；在45℃发酵时，菌落数降了一个数量级，但菌落数仍旧达到1.40±0.22×10⁸CFU/mL，而在50℃时，菌DT1-1基本处于不生长状态，说明该菌适合的发酵温度范围在25-45℃，最适发酵温度为35℃。

表2本发明的屎肠球菌DT1-1发酵温度测定[(X±s)×10^y CFU/mL]

4.本发明的屎肠球菌DT1-1的益生特性研究

4.1菌DT1-1对胃肠道耐受性研究

收集过夜培养的菌体，用无菌的PBS重悬，将其浓度调整为1x10⁹CFU/mL，并将其放入模拟胃液(pH3.0)中37℃培养1，2，3h，分别取样。3h后，再放入到模拟肠液中，1mL培养物加9mL模拟肠液(pH8.0)，37℃培养2，4，8h后，分别取样并采用平板计数法测定活菌总数，结果见表3，经过模拟胃液处理3h以及模拟肠液处理8h过后，菌DT1-1的活率仍在90％以上，可知该菌能很好地耐受胃肠道环境。

表3菌DT1-1胃肠道耐受性检测[

×10^y CFU/mL]

4.2菌DT1-1菌株的耐胆盐试验

取本发明的屎肠球菌DT1-1菌液以10％接种量接种于含有不同胆盐(含量梯度为0、0.1％、0.2％、0.3％、0.6％、1％)的MRS培养基(pH7.3)，置于37℃下分别培养0、2、4h，每个处理3个重复。各取1mL培养物于9mL PBS(pH 7.2)中混匀，制备适宜稀释度溶液，取0.1mL稀释液涂布于MRS平板上，于37℃二氧化碳培养箱中厌氧培养24h(每个稀释度做3个平行)计算平板上的菌落数。结果见表4，在胆盐浓度为0.3％处理4h后菌DT1-1的生长量依然达到2.28±0.29×10⁷(CFU/mL)，可知屎肠球菌DT1-1有很好的耐胆碱能力。

表4屎肠球菌DT1-1耐胆盐能力检测[

×10⁷CFU/mL]

4.3菌DT1-1的耐酸碱试验

取本发明的屎肠球菌DT1-1母液以10％接种量接种于不同pH值(pH梯度为2.0、3.0、9.0、10.0、11.0)的MRS培养基，置于37℃下分别培养0、2、4h，每一处理3个重复。制备适宜稀释度溶液，取0.1mL稀释液于MRS平板上涂布，于37℃温箱中厌氧培养24h(每个稀释度做3个平行)记录计算平板上的菌落数。试验结果见表5，菌DT1-1在pH值为2.0时基本不耐受，但在2.0及以上时，培养2h及4h耐受性良好，在pH为3，培养4h后，菌落可达到1.37±0.45×10⁷(CFU/mL)，生长良好，说明该菌具有很强的耐酸能力，另外，培养4h的菌落均少于2h，说明随着处理时间的延长，菌的生长会受到抑制。

表5屎肠球菌DT1-1耐酸能力检测[

×10⁷CFU/mL]

4.4屎肠球菌DT1-1的表面性质测定

过夜培养屎肠球菌DT1-1(MRS培养基)、金黄色葡萄球菌ATCC 6538(LB液体培养基)得到菌液，置于8000r/min、4℃下离心10min，收集菌体，分别用pH 7.2的无菌磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤2次(即在菌体中加入PBS，吹打混合均匀后，置8000r/min、4℃下离心10min，收集菌体)。自凝集率(％)：用无菌的PBS将菌DT1-1制成在波长600nm处的吸光值为0.5±0.02(A0)的菌悬液，静置24h后测定吸光值A24，自凝集率(％)公式为(A0-A24)/A0×100％；他凝集率(％)：用无菌的PBS将菌DT1-1和金黄色葡萄球菌ATCC 6538的悬菌液调节成在波长600nm处的吸光值为0.5±0.02(A0)的混合悬浮菌液。静置24h后测定吸光值A24，他凝集率(％)公式为(A0-A24)/A0×100％；疏水性(％)：用无菌的PBS将菌DT1-1制成在波长600nm处的吸光值为0.5±0.02(A0)的菌悬液，将二甲苯加入到菌悬液中，在室温条件下预培养10min后将该两相体系涡旋振荡120s，37℃静置共培养1h，然后小心去除二甲苯相，于600nm处测定水相的吸光值A1。疏水性(％)：公式为(A0-A1)/A0×100％。测定结果见表6，可知DT1-1的自凝集率为83.83％，他凝集率为68.33％，疏水性为48.03％，说明本发明的屎肠球菌DT1-1可与致病菌(金黄色葡萄球菌)聚集，且疏水性能良好。

表6屎肠球菌DT1-1表面性质表

凝集试验	A<sub>0</sub>±s	A<sub>24</sub>±s	凝集率(％)
				自凝试验	0.507±0.017	0.082±0.024	83.83％
他凝试验	0.502±0.023	0.159±0.015	68.33％
				疏水性试验	A<sub>0</sub>±s	A<sub>1</sub>±s	疏水性(％)
	0.508±0.021	0.264±0.019	48.03％

5菌DT1-1的抑菌性试验

本发明的屎肠球菌DT1-1的抑菌试验：(1)无细胞发酵上清液的制备已活化的屎肠球菌DT1-14℃，6000r/min，离心10min，取其上清液经0.22μm微孔滤膜过滤，所得液体即为屎肠球菌的无细胞发酵液，4℃保存，备用。(2)双层平板的制备倾倒下层琼脂，室温晾干，将活化后的致病菌用无菌的磷酸缓冲液(pH 7.4)配制成含活菌数约为10⁸cell/mL的菌体悬液，加入到已灭菌的半固体营养培养基中(需氧菌用NA平板，厌氧菌用MRS平板)，混匀后倾倒于素琼脂平板中，室温条件下水平放置。待双层平板凝固后，用自制打孔器(孔径±7mm)进行打孔，向孔洞中加入无细胞发酵上清液，室温水平放置3h后，37℃培养18h后，用游标卡尺测量抑菌圏直径大小，重复3次试验求平均值(表7)。

抑菌试验结果(表7)表明菌DT1-1对14株致病菌菌株中的不同抑制作用，其中对小肠结肠炎耶尔森菌和溶血性葡萄球菌有较强的抑菌作用，对大肠埃希氏菌、单增李斯特氏菌、鼠伤寒沙门氏菌等均有作用。说明屎肠球菌DT1-1具有较好的抗菌谱，抑菌范围更广。

表7抑菌试验结果

6菌DT1-1的药敏试验

把已活化后的本发明的屎肠球菌DT1-1接种于MRS液体培养基中，37℃静置培养，18h后用无菌的磷酸缓冲液(pH 7.4)配制成含活菌数约为10⁶cell/mL的菌体悬液，用灭菌棉棒蘸取菌液，使其均匀涂布于MRS固体平板上。采用纸片琼脂扩散法(K-B法)，用无菌的镊子将药敏片均匀放置在其上，37℃厌氧培养24h后，记录各药敏纸片的抑菌圈直径大小，重复3次试验求平均值。用标准敏感菌株大肠埃希氏菌ATCC 25922(Escherichia coli ATCC25922)以及金黄色葡萄球菌ATCC 25923(Staphylococcus aureus ATCC 25923)作为质控菌，参照美国CLSI(临床和实验室标准协会)国际标准中对抗菌药物敏感性的最小抑菌圈直径大小来判定菌株的药敏性。

表8菌DT1-1对常用7大类13种抗生素的药敏性试验结果

注:①R为耐药，I为中敏，S为敏感。下同。

6屎肠球菌DT1-1在牛羊腹泻病的应用研究

将本发明的屎肠球菌DT1-1与实验室自分离的另2株益生菌株按一定比例混合，制成微生态制剂。对甘肃苏南县和青海海北州不同程度腹泻病例共计40只羊80头牛进行饲喂试验。结果表明，饲喂第二天观察病畜，发现腹泻症状有明显好转，连续饲喂三天后，一般病畜基本痊愈。对于严重病例和病程较长的病例，也有较好的防治效果。

2018年7月1日至2018年8月31日，对新疆博乐某养殖场犊牛(10日龄内)腹泻病例进行益生菌制剂治疗(产房一和产房三)，其益生菌主要有效成分之一为屎肠球菌DT1-1。产房一和产房三采用发病后益生菌制剂治疗，其治愈率分别为94.52％和95.16％；而产房二(对照组，勃林格殷格翰疗法)采用提前抗生素等联合给药预防，死亡率为0.9％(表9)。

表9新疆博乐天莱集团养殖场犊牛腹泻治疗记录表

牛舍	产犊数	治疗数	恢复数	死亡数	死亡率	备注
							产房一	104	73	69	4	5.48％	发病后益生菌治疗
产房二	108	107	106	1	0.9％	勃林格殷格翰疗法
							产房三	116	62	59	3	4.84％	发病后益生菌治疗

Claims (3)

1.一株屎肠球菌(Enterococcus faecium)DT1-1，于2018年10月22日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，其保藏编号为CGMCC No.16603。

2.权利要求1所述的屎肠球菌DT1-1在制备草食动物的饲料添加剂中的应用。

3.权利要求1所述的屎肠球菌DT1-1在制备草食动物的饲料中的应用。

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