CN108048352A

CN108048352A - 一种产抑菌物质的屎肠球菌xc2及其筛选方法与应用

Info

Publication number: CN108048352A
Application number: CN201711406181.8A
Authority: CN
Inventors: 王喜亮; 贺宇成; 李越; 李晓飞; 金秀娥; 周祖涛; 肖运才; 毕丁仁
Original assignee: Huazhong Agricultural University
Current assignee: Huazhong Agricultural University
Priority date: 2017-12-22
Filing date: 2017-12-22
Publication date: 2018-05-18
Anticipated expiration: 2037-12-22
Also published as: CN108048352B

Abstract

本发明公开了一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2及其筛选方法与应用，该菌株分类命名是Enterococcus faecium XC2，该菌株于2016年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2016297。该菌株筛选自猪粪便样品，在KF链球菌琼脂培养基呈红色、光滑凸起、周边整齐的菌落，在MRS琼脂培养基上呈乳白色、边缘光滑、直径1mm的菌落，镜检呈卵圆形，单个、成双或短链排列，革兰氏染色呈蓝色。本发明菌株对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌均有明显抑制作用，其产生肠球菌素B，解决了抗生素造成畜禽肠道菌群紊乱、动物抗病力下降以及不合理遵守休药期导致的畜产品药物残留的问题。

Description

一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2及其筛选方法与应用

技术领域

本发明属于抗生素替代技术领域，涉及一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2及其筛选方法与应用。

背景技术

抗生素作为生长促进剂(3.Dibner,J.and J.Richards.Antibiotic growthpromoters in agriculture:history and mode of action.Poultry science,2005,84(4):634-643)以亚剂量水平添加到畜禽日粮中，极大的推动了畜牧业和饲料工业的发展。然而临床上对抗生素大规模且不合理的使用给畜禽养殖业带来了严重问题，如耐药菌株不断增加，畜禽肠道菌群紊乱，动物抗病力下降，以及不合理遵守休药期导致的畜产品药物残留以及环境污染，同时给新型的健康生态养殖模式带来了巨大挑战。WHO限制欧盟使用抗生素以后，越来越多的国家通过立法措施禁止抗生素的滥用。近年来，我国也开始逐步限制抗生素在饲料中的应用，“无抗养殖”将成为必然趋势。因此，探索具有促生长和健康调节功能的抗生素替代品十分迫切，例如有机酸、酶制剂、寡聚糖、中草药、益生菌。其中益生菌作为抗生素的替代物质(Shanahan,F.and J.McCarthy.Functional foods and probiotics:time for gastroenterologists to embrace the concept.Current gastroenterologyreports,2000,2(5):345-346；Park,Y.-S.,J.-Y.Lee,Y.-S.Kim and D.-H.Shin.Isolation and characterization of lactic acid bacteria from feces ofnewborn baby and from dongchimi.Journal of agricultural and food chemistry,2002,50(9):2531-2536)在饲料中添加，不仅具有调节宿主胃肠道平衡，提高畜禽日增重和防治腹泻的功能，而且还具有无污染、无耐药性和无药物残留的优点。屎肠球菌是人和动物体内正常菌群的一部分，具有生长速度快、粘附力高的特点，作为活菌制剂已成功应用在畜牧水产养殖业领域。尽管肠球菌在食品中的安全应用已有多年的历史，但其抑菌机制一直不明确，研究表明该菌产生肠球菌素可抑制其他致病菌生长和繁殖，具有良好的应用前景。

发明内容

有鉴于此，本发明针对抗生素造成畜禽肠道菌群紊乱、动物抗病力下降、以及不合理遵守休药期导致的畜产品药物残留以及环境污染的问题，提供了一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2及其筛选方法与应用。

本发明公开了一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2，抑菌物质为细菌素，所述菌株的分类命名是Enterococcus faecium XC2，该菌株于2016年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2016297。

本发明还公开了一种上述的产抑菌物质的屎肠球菌XC2在制备抑制致病性大肠杆菌K88的黏附药物中的应用。

本发明还公开了一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2的筛选方法，具体按照以下步骤实施：

步骤1、样品采集及培养；

步骤2：菌株抑菌能力筛选，并传代保存；

步骤3、属的鉴定，最终筛选出产肠球菌素屎肠球菌XC2。

进一步地，所述步骤1具体过程为：样品取自健康猪粪便，样品采集后，用棉拭子在KF链球菌琼脂培养基中划线培养，37℃、24h～48h培养后，选取红色，光滑凸起，周边整齐，1mm左右大小的菌落做纯培养，将纯培养物在MRS琼脂培养基上培养。

进一步地，所述步骤2具体过程为：对纯化后的菌株进行发酵培养，用牛津杯法筛选对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌有抑制作用的菌株，均传代保存。

进一步地，所述步骤3具体过程为：将上述分离的菌株进行6.5％NaCl生长试验、pH9.6肉汤生长试验、45℃生长试验、60℃，30min生长试验、胆汁-七叶苷水解试验，能耐受6.5％NaCl、在pH9.6肉汤中生长、45℃能存活、60℃作用30min能存活、胆汁-七叶苷水解阳性的菌株即定为肠球菌属细菌。

本发明还公开了一种如上所述的抑菌物质，该抑菌物质种类为肠球菌素B。

本发明还公开了一种如上所述的肠球菌素B对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌抑菌的应用。

与现有技术相比，本发明可以获得包括以下技术效果：

(1)本发明菌株对常见肠道致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)具有明显的抑菌效果，为替代抗生素添加剂提供了有力依据；

(2)本发明用毒力因子检测、抗生素敏感性检测以及急性口服毒性试验评价益生菌株，充分保证其安全性；

(3)该菌株生长繁殖速度快，适合于工业化生产；

(4)菌株可完全耐受胃酸及肠道胆盐高渗透压环境，且具有高粘附力，因此可在肠道定植发挥益生功能；

(5)该菌株虽然不产芽胞，但对高温的耐受能力相对较强，可耐受70℃高温。这为该菌株作饲料添加剂的应用于生产实际打下了良好基础。

(6)该菌株产抑菌物质，经鉴定该抑菌物质为肠球菌素B；

(7)该肠球菌素B对常见肠道致病菌(金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、沙门氏菌)具有明显的抑菌效果。

当然，实施本发明的任一产品并不一定需要同时达到以上所述的所有技术效果。

附图说明

此处所说明的附图用来提供对本发明的进一步理解，构成本发明的一部分，本发明的示意性实施例及其说明用于解释本发明，并不构成对本发明的不当限定。在附图中：

图1是本发明分离筛选的屎肠球菌株在MRS琼脂平板上的生长状态；

图2是本发明分离筛选的屎肠球菌株革兰氏染色阳性反应(×2000)；

图3是本发明肠球菌素B基因PCR扩增检测结果，其中，M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：本发明菌株；

图4是本发明屎肠球菌的种特异性基因ddlE.faecium的PCR扩增检测结果；其中，M:DL 2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照，泳道3：本发明菌株；

图5是本发明不同肠球菌素的PCR扩增检测结果；其中，M:DL2000DNA分子量标准，1：enterocin A，2：enterocin L50A，3：enterocin L50B，4：enterocin P，5：enterocin Q，6：enterocin B，7：enterocin AS-48；

图6是本发明菌株的毒力基因检测中esp、as、cylA、ace、gelE、efaAfm的PCR产物检测，其中，(a)是本发明菌株的毒力基因检测中esp的PCR产物检测，其中，M:DL 2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照，泳道3：本发明菌株；(b)是本发明菌株的毒力基因检测中as的PCR产物检测，其中，M:DL 2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照，泳道3：本发明菌株；(c)是本发明菌株的毒力基因检测中cylA的PCR产物检测，其中，M:DL 2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照，泳道3：本发明菌株；(d)是本发明菌株的毒力基因检测中ace的PCR产物检测，其中，M:DL 2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照，泳道3：本发明菌株；(e)是本发明菌株的毒力基因检测中gelE的PCR产物检测，其中，M:DL 2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照，泳道3：本发明菌株；(f)是本发明菌株的毒力基因检测中efaAfm的PCR产物检测，其中，M:DL2000DNA分子量标准，泳道1：阴性对照，泳道2：阳性对照，泳道3：本发明菌株；

图7是本发明肠球菌的β溶血试验，其中，1：阳性对照，2：本发明菌株；

图8是本发明明胶溶解试验，其中，1：阴性对照2：阳性对照3：本发明菌株；

图9是本发明中小鼠灌胃7d后各脏器解剖变化情况，其中，从左至右依次为：PBS、TC3、XC2；从上至下依次为：心、肝、脾、肾；

图10是本发明小鼠心脏组织切片，从左至右依次为PBS、TC3、XC2，HE×200；

图11是本发明小鼠肝脏组织切片，从左至右依次为PBS、TC3、XC2，HE×200；

图12是本发明小鼠脾脏组织切片，从左至右依次为PBS、TC3、XC2，HE×200；

图13是本发明小鼠肺脏组织切片，从左至右依次为PBS、TC3、XC2，HE×200；

图14是本发明小鼠肾脏组织切片，从左至右依次为PBS、TC3、XC2，HE×200；

图15是本发明小鼠盲脏组织切片，从左至右依次为PBS、TC3、XC2，HE×200；

图16(a)～图16(d)是本发明小鼠灌胃7d后各脏器指数变化情况；其中，(a)代表心脏，(b)代表肝脏，(c)代表脾脏，(d)代表肾脏；

图17是本发明屎肠球菌XC2的生长曲线。

具体实施方式

以下将配合实施例来详细说明本发明的实施方式，藉此对本发明如何应用技术手段来解决技术问题并达成技术功效的实现过程能充分理解并据以实施。

实施例1乳酸菌的分离

样品取自健康猪粪便。样品采集后，用棉拭子在KF链球菌琼脂培养基中划线培养，37℃、24h～48h培养后，选取红色，光滑凸起，周边整齐，1mm左右大小的菌落做纯培养。将纯培养物在MRS琼脂培养基上培养，经菌落形态的观察、革兰氏染色、过氧化酶试验进行初步筛选。细菌呈单个、成双或短链排列的卵圆形革兰阳性球菌及过氧化酶试验阴性的菌株，均传代保存。其在MRS琼脂培养基上的生长特性见图1，为乳白色圆形，表面凸起，湿润，有光泽，边缘整齐的菌落。其革兰氏染色特性见图2，显微镜下观察，该发明菌株菌体形态为球状或卵圆形，单生，菌体呈蓝色，革兰氏染色呈阳性，该发明的菌株命名为屎肠球菌(Enterococcus faecium)XC2。

实施例2有抑菌能力的乳酸菌筛选

(一)抑菌乳酸菌的筛选

1.细菌发酵液的制备和处理新鲜菌液按2％(v/v)接种于MRS肉汤培养基中，静置培养18～24h，离心取上清液，10000rpm、30min离心，吸取上清；再离心一次；并测定发酵液pH；4℃备用；

2.LB平板的制备每平板倒LB琼脂培养基约25mL(厚度约为4mm)，试验前使平皿干燥(指示菌均匀涂布平板后，以平板无可见水滴为准)；

3.指示菌菌液制备将金黄色葡萄球菌、猪霍乱沙门氏菌C78-1和猪致病性大肠杆菌0157划线培养，得到单菌落；挑取单菌落于LB液体培养基中，37℃摇床振荡培养12h用于本试验；

4.菌液的稀释用麦氏比浊管调整指示菌菌液浓度为10⁸cfu/mL；再将菌液稀释适当倍数。将稀释后的菌液用灭菌的棉签均匀涂布于平板上；

5.待琼脂表面水分干燥后，用镊子将无菌的牛津杯轻轻放入培养皿中，吸取发酵上清液0.25mL至牛津杯中(注意不要将菌液溢出杯外)；

6.平皿放置4℃冰箱扩散数小时，转入37℃温箱中。10～12h后观察试验结果并测定抑菌圈的大小。

试验结果表明本发明菌株的抑菌效果在所筛选的菌株中效果最好，结果见表1。

表1屎肠球菌株XC2发酵上清液体外抑菌试验

(二)抑菌乳酸菌的复筛

(1)发酵液中pH值的排除

发酵液用1mol/L NaOH或1mol/L HCL调至pH6.0后进行抑菌试验，同时分别用乳酸和醋酸调MRS液体培养基至pH4.0作为对照，检测抑菌活性。

(2)H₂O₂抑菌作用的排除

发酵液用80℃水浴加热处理10min，检测抑菌活性。

(3)蛋白酶抑菌物质的排除

发酵液分别用胰蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶K和胃蛋白酶进行酶处理。首先将发酵液调至酶最适宜的pH，然后置于37℃水浴2h，100℃加热90s，调节pH值至原发酵液pH，检测抑菌活性。

试验结果表明，本发明菌株XC2产生的抑菌物质为蛋白类的抑菌物质，具有良好的抑菌能力，具体结果见表2.

表2屎肠球菌XC2发酵液对沙门氏菌体外抑菌试验的复筛结果

实施例3产抑菌物质菌株的鉴定

(一)属的鉴定

将上述分离的菌株进行6.5％NaCl生长试验、pH9.6肉汤生长试验、45℃生长试验、60℃，30min生长试验、胆汁-七叶苷水解试验。能耐受6.5％NaCl、在pH9.6肉汤中生长、45℃能存活、60℃作用30min能存活、胆汁-七叶苷水解阳性的菌株即定为肠球菌属细菌。

(1)耐6.5％NaCl试验取幼龄菌种接种在适宜生长的含6.5％NaCl的TSB试管中，37℃培养24h，与未接种的对照管对比，目测生长情况。混浊即为阳性，否则为阴性。

(2)pH9.6肉汤生长试验将菌种接种于pH9.6TSB培养基中，37℃培养24h后，观察结果。培养基变混浊为阳性，否则为阴性。

(3)45℃生长试验用接种环吊起一环24h培养的液体培养物，接入清亮的BHI肉汤中，45℃恒温水浴培养，培养基变混浊为阳性，否则为阴性。重复该试验3次，结果相同才确认。

(4)60℃，30min生长试验挑取幼龄菌落，接种于TSA斜面，60℃培养30min后，转入37℃培养24h，有菌落生长判为阳性。

(5)胆汁七叶苷水解试验将菌种接种于胆汁七叶苷培养基中，37℃孵育18～24h后，观察结果。培养基完全变黑为阳性，不变黑为阴性。

(二)菌株进行种的初步鉴定

对筛选出的肠球菌属细菌XC2进行体外抑菌试验，对抑菌效果较明显的菌株，通过一系列的生化实验，进一步进行种鉴定。包括：葡萄糖、木糖、蔗糖、乳糖、棉子糖、山梨醇、甘露醇、阿拉伯糖、精氨酸双水解酶。将鉴定结果(见表3)与《常见细菌系统鉴定手册》(1.东秀珠，蔡妙英.常见细菌系统鉴定手册.北京：科学出版社，2001)中关于肠球菌属种间鉴别的描述相对照，初步确定XC2是屎肠球菌。

表3屎肠球菌株XC2生化鉴定结果

(三)菌株种的确证

在上述鉴定的基础上，进一步对本发明的菌株XC2进行16S rRNA基因序列检测和种特异性基因检测，对菌株所属的种进行确证鉴定。

(1)菌株基因组的提取步骤如下：

①取1mL屎肠球菌株XC2纯培养物，加入1.5mL EP管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1mL TE(pH8.0)中。

②加入6μL 50mg/mL的溶菌酶，37℃作用2h。

③再加2M NaCl 50μL，10％SDS 110μL，20mg/mL的蛋白酶K3μL，50℃作用3h或37℃过夜。

④将菌液均分到两个1.5mL EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5～10min；12000rpm离心10min；如此重复抽提两次。

⑤加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。12000rpm离心10min。

⑥用75％的乙醇洗涤沉淀。

⑦风干后，溶于50μL ddH₂O中，加入1μL 10mg/mL RNase A，37℃消化2～3h。

⑧取2～5μL电泳检测。贮存于-20℃备用。

(2)PCR扩增16S rRNA基因

16S rRNA扩增采用通用引物：

F:5'–CGTGCCTAATACATGCAAGTCGAAC-3'，如SEQ ID NO.2所示；

R:5'–ACGACTTCACCCCAATCATCTATCC-3'，如SEQ ID NO.3所示；

PCR反应体系见表4。PCR程序为：94℃5min,94℃1min,55℃1min,72℃1min，30个循环后72℃延伸10min。取PCR产物在0.8％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳检测，片段大小与预期相符，为1475个碱基对(见图3)。

表4菌株XC2 16S rRNA PCR体系

(3)16S rRNA基因PCR产物的克隆与测序

用DNA纯化试剂盒(TIANGEN)回收DNA，具体步骤参照说明书。

PCR产物纯化后连接到pDM18-T载体，转化DH5α感受态细胞，涂于含Amp的琼脂平皿上进行筛选。挑取白色菌落于含Amp(50μg/mL)的LB液体培养基中，37℃恒温摇床过夜，直接取菌液做模板进行PCR鉴定。对阳性克隆的菌液，送至金思特科技有限公司测序。将测序结果在NCBI中进行Blast比较。检索发现，XC2的16S rRNA与屎肠球菌(AB3626300.1)的序列同源性最高，相似性为99％。

(4)种特异性基因鉴定

屎肠球菌的种特异性片段为ddlE.faecium(Dutka-Malen,S.,S.Evers andP.Courvalin.Detection of glycopeptide resistance genotypes and identificationto the species level of clinically relevant enterococci by PCR.Journal ofclinical microbiology,1995,33(1):24-27)。以肠球菌的基因组为模板，设计特异性的引物，扩增种特异性片段。

扩增ddlE.faecium片段的引物序列为：

F1:5'GCA AGG CTT CTT AGA GA 3'，如SEQ ID NO.4所示；

F2:5'CAT CGT GTA AGC TAA CTT C 3'，如SEQ ID NO.5所示；

PCR程序为：94℃5min，94℃1min，60℃1min，72℃1min，30个循环后72℃延伸10min。

从本发明的菌株XC2中扩增出了屎肠球菌的特异性片段ddl_E.faecium(见图4)，故XC2确证为屎肠球菌。

实施例4：抑菌物质种类的确定

(1)PCR鉴定

参照实施例3中的方法，提取菌株基因组DNA。根据Genbank中公布肠球菌素基因设计引物，引物序列见表5。

表5肠球菌素基因扩增引物

以基因组DNA为模板，按照表6的PCR扩增条件进行检测。

表6肠球菌素PCR扩增条件

所得PCR产物按照实施例3的办法在0.8％的琼脂糖凝胶(含溴化乙锭)上进行电泳检测。只有enterocinB引物扩增出来的PCR产物大小与预期相同，结果见图5所示。

(2)肠球菌素基因测序

按照实施例3中方法对肠球菌素基因进行回收和克隆。阳性菌株送至金思特科技有限公司测序，其核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示；将测序结果在NCBI中进行Blast比较。检索发现，此序列与enterocin B(FJ161959.1)的序列同源性最高，相似性为99％。

基于以上特征，将菌株XC2鉴定为Enterococcus faecium。该菌株于2016年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2016297。

实施例5：屎肠球菌株的安全性评价

一、毒力因子的检测

(1)毒力因子的扩增主要包括cylA(Gilmore et al.,1994)、gelE(Su et al.,1991)、esp(Shankar et al.,1999)、agg(Galli et al.,1990)、ace(Mannu et al.,2003)、efaA_fm(Eaton and Gasson,2001)。扩增结果为：屎肠球菌株XC2不含cylA、gelE、esp、agg、ace等基因片段，仅含efaA_fm一个毒力基因，参见图6(a)～图6(f)。

(2)溶血试验和明胶水解试验

将菌接种在5％脱纤维兔血平板上，37℃培养18～24h，观察溶血情况，出现透明β溶血环为溶血表型阳性。金黄色葡萄球菌ATCC25923做阳性对照。

用接种针从平板上挑取已纯化分离的菌落接种于明胶生化管中，37℃培养18～24h后，然后将平板放于4℃、30min，明胶生化管在4℃呈液态判断为阳性。鸭疫里氏杆菌云梦分离株做阳性质控。

屎肠球菌株XC2在5％脱纤维兔血平板上不表现溶血反应，见图7，明胶水解试验也为阴性，见图8。

二、抗生素敏感性试验

本试验菌株XC2对大部分抗生素如氨苄西林、万古霉素、氧氟沙星、氯霉素高度敏感，对四环素、环丙沙星中度敏感，而对青霉素、红霉素耐药，见表7。

表7屎肠球菌XC2的抗生素敏感性试验结果

三、急性口服毒性试验

(1)试验小鼠一般体态特征观察

试验期间各组小鼠呼吸平稳，排便正常，其它体征如行为、精神状态、皮毛光泽等没有异常，未出现中毒和死亡现象；解剖后肉眼观察，各脏器没有明显病理变化，见图9。

(2)脏器指数测定

脏器指数(％)＝脏器重量(心、肝、脾、肾)(g)/小鼠体重(g)×100％。XC2组、WH10组、TC3对照组、PBS对照组的心脏指数分别为0.67％、0.56％、0.63％、0.67％；肝脏指数分别为7.12％、6.44％、7.10％、7.48％；脾脏指数分别为0.48％、0.40％、0.41％、0.49％；肾脏指数分别为1.86％、1.71％、1.70％、1.73％，组间没有显著性差异(p>0.05)，见图10。

(3)细菌易位试验

试验期结束后，在超净工作台里无菌眼球采血，解剖后取心、肝、脾、肾并加适量无菌PBS匀浆。分别取100μL各组织匀浆液及血液涂布于MRS固体培养基平板上，37℃倒置培养48小时后，观察无菌落长出。说明各组均未细菌易位现象。

(4)脏器组织形态学观察

试验后对各组小鼠进行心脏、肝脏、脾脏、肺脏、肾脏和盲肠的组织切片制作和HE染色镜检。镜下可见PBS对照组、TC3对照组和试验组XC2心脏未见明显异常，心肌细胞大小及排列正常，见图11；肝细胞大小正常，未见炎性细胞浸润，未见变形，坏死及纤维化，见图12；脾白髓和脾红髓结构正常，脾窦等未见异常，见图13；肺组织结构完整，支气管及肺泡均未见明显异常，见图14；肾脏结构完整，肾小管上皮细胞未见明显病变，肾小球囊腔轻微缩小，见图15；盲肠壁全层结构完整，上皮细胞完整，未见明显炎性细胞浸润，见图16(a)～图16(d)。

上述毒力因子检测、抗生素敏感性试验以及急性口服毒性试验的结果表明，屎肠球菌XC2无致病性。

实施例6：屎肠球菌株XC2的生长特性及抗逆特性：

一、生长特性的测定

将活化好的屎肠球菌XC2按1％的接种量接入MRS肉汤中，37℃培养，每隔2h取样，以OD600数值记录其生长状况；以时间为横坐标，细菌的OD值为纵坐标绘制生长曲线。

本发明的菌株迟缓期很短，很快进入对数增长期，大约8h后进入稳定期，细菌数达到最大，见如图17。结果表明，菌株XC2生长繁殖速度快，适合于工业化生产。

二、耐受性试验

(1)人工胃肠液的耐受性试验

人工胃液配方：取质量分数为0.1kg/L的盐酸16.4mL，将其pH值分别调至2.5和3.0。然后加入胃蛋白酶，比例为0.01g/mL，待其溶解均匀后，微孔滤膜除菌，备用；

人工肠液配方：取KH₂PO₄ 6.8g，加蒸馏水500mL溶解，用质量分数4g/LNaOH溶液调pH至6.8，然后加入胰蛋白酶，浓度为0.01g/mL，待其溶解均匀后，微孔滤膜除菌，备用；

将活化后的试验菌株分别以10％接种量接入到上述人工胃、肠液中，每个处理重复3次，37℃培养2h，观察并记录其生长情况；

正常猪胃酸的pH值在3.0左右，食物在胃中的停留时间为1-2h(吴惠芬等2005)。本试验检测了屎肠球菌XC2分别在pH2.5、pH3.0的人工胃液以及pH6.8的人工肠液孵育2h的存活菌数，见表8。益生菌通过胃肠道时，食糜作为一种保护剂使益生菌受到伤害的程度减小，一旦在穿越胃和十二指肠中能存活下来，随同食糜进入回肠、盲肠的细菌会急剧增加。表明屎肠球菌XC2具有较强的耐酸性，可顺利到达肠道。

表8工胃肠液下菌株的存活数

(2)胆盐耐受性试验

将活化的菌株取1mL接种于9mL含0％，0.03％，0.15％，0.30％胆盐MRS肉汤中，37℃培养12h，每个处理重复3次，稀释至合适倍数，取0.1mL涂于MRS平板，观察生长情况并计数。

正常猪肠道的胆盐浓度在0.03％-0.3％范围变化。本试验屎肠球菌XC2分别在胆盐浓度为0.03％、0.15％、0.3％的MRS肉汤中孵育12h后，活菌数如表9所示，表明对胆盐有较强的耐受性。

表9不同胆盐浓度下菌株的存活数

(3)高温耐受性试验

MRS液体中接种10％已活化的菌株，37℃条件下培养3～4h。菌液经过70℃、80℃的热处理，37℃设为对照，每个处理重复3次，0min，2min，4min后将菌液稀释合适的倍数，用MRS琼脂平板观察生长情况并计数。

与对照组37℃相比，屎肠球菌XC2经70℃分别处理2min和4min后，细菌数量级未发生变化，经80℃处理2min后细菌数下降3.5个数量级；4min后已检测不到活菌数，见表10。

表10屎肠球菌XC2对高温的耐受性

三、粘附性试验

本试验采用猪肠上皮细胞IPEC-J2体外培养模型，评价屎肠球菌XC2对IPEC-J2细胞的粘附性。屎肠球菌XC2对细胞IPEC-J2的粘附率为7.62±0.16％。

四、粘附抑制试验

屎肠球菌XC2对大肠杆菌K88粘附细胞IPEC-J2的竞争抑制率、排斥抑制率和置换率分别为91.8％、73.9％和3.0％。表明屎肠球菌XC2可以有效抑制致病性大肠杆菌K88的黏附。

上述说明示出并描述了发明的若干优选实施例，但如前所述，应当理解发明并非局限于本文所披露的形式，不应看作是对其他实施例的排除，而可用于各种其他组合、修改和环境，并能够在本文所述发明构想范围内，通过上述教导或相关领域的技术或知识进行改动。而本领域人员所进行的改动和变化不脱离发明的精神和范围，则都应在发明所附权利要求的保护范围内。

序列表

<110> 华中农业大学

<120> 一种益生屎肠球菌菌株及其筛选方法与应用

<130> 2017

<141> 2017-12-20

<160> 19

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 1586

<212> DNA

<213> 屎肠球菌XC2(Enterococcus faecium XC2)

<400> 1

acggaaattt ccggtatggt cgaggcagtg ccagcttgca tgcctgcagg tcgacgatta 60

cgacttcacc ccaatcatct atcccacctt aggcggctgg ctccaaaagg ttacctcacc 120

gacttcgggt gttacaaact ctcgtggtgt gacgggcggt gtgtacaagg cccgggaacg 180

tattcaccgc ggcgtgctga tccgcgatta ctagcgattc cggcttcatg caggcgagtt 240

gcagcctgca atccgaactg agagaagctt taagagatta gcttagcctc gcgacttcgc 300

gactcgttgt acttcccatt gtagcacgtg tgtagcccag gtcataaggg gcatgatgat 360

ttgacgtcat ccccaccttc ctccggtttg tcaccggcag tcttgctaga gtgcccaact 420

gaatgatggc aactaacaat aagggttgcg ctcgttgcgg gacttaaccc aacatctcac 480

gacacgagct gacgacaacc atgcaccacc tgtcactttg cccccgaagg ggaagctcta 540

tctctagagt ggtcaaagga tgtcaagacc tggtaaggtt cttcgcgttg cttcgaatta 600

aaccacatgc tccaccgctt gtgcgggccc ccgtcaattc ctttgagttt caaccttgcg 660

gtcgtactcc ccaggcggag tgcttaatgc gttagctgca gcactgaagg gcggaaaccc 720

tccaacactt agcactcatc gtttacggcg tggactacca gggtatctaa tcctgtttgc 780

tccccacgct ttcgagcctc agcgtcagtt acagaccaga gagccgcctt cgccactggt 840

gttcctccat atatctacgc atttcaccgc tacacatgga attccactct cctcttctgc 900

actcaagtct cccagtttcc aatgaccctc cccggttgag ccgggggctt tcacatcaga 960

cttaagaaac cgcctgcgct cgctttacgc ccaataaatc cggacaacgc ttgccaccta 1020

cgtattaccg cggctgctgg cacgtagtta gccgtggctt tctggttaga taccgtcaag 1080

ggatgaacag ttactctcat ccctgttctt ctctaacaac agagttttac gatccgaaaa 1140

ccttcttcac tcacgcggcg ttgctcggtc agactttcgt ccattgccga agattcccta 1200

ctgctgcctc ccgtaggagt ttgggccgtg tctcagtccc aatgtggccg atcaccctct 1260

caggtcggct atgcatcgtg gccttggtga gccgttacct caccaactag ctaatgcacc 1320

gcgggtccat ccatcagcga cacccgaaag cgcctttcaa atcaaaacca tgcggttttg 1380

attgttatac ggtattagca cctgtttcca agtgttatcc ccttctgatg ggcaggttac 1440

ccacgtgtta ctcacccgtt cgccactctt ctttttccgg tggagcaagc tccggtggaa 1500

aaagaagcgt tcgacttgca tgtattaggc acgaatctct agaggatccc cgggtaccga 1560

gctcgaatcg taatcattca tggtcc 1586

<210> 2

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 2

cgtgcctaat acatgcaagt cgaac 25

<210> 3

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 3

acgacttcac cccaatcatc tatcc 25

<210> 4

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 4

gcaaggcttc ttagaga 17

<210> 5

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 5

catcgtgtaa gctaacttc 19

<210> 6

<211> 18

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 6

agatttatct ccataatc 18

<210> 7

<211> 17

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 7

gtaccactca tagtgga 17

<210> 8

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 8

catatgggag caatcgcaaa atta 24

<210> 9

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 9

aagcttattg ctcccatgta ctaa 24

<210> 10

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 10

atgggagcaa tcgcaaaatt a 21

<210> 11

<211> 21

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 11

tagccatttt tcaatttgat c 21

<210> 12

<211> 24

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 12

gctacgcgtt catatggtaa tggt 24

<210> 13

<211> 25

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 13

atgtcccata cctgccaaac cagaa 25

<210> 14

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 14

aagagtagta gtggaatact gat 23

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 15

aagactgctc ttccgagcag cc 22

<210> 16

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 16

aatgtaaaag aattaagtac 20

<210> 17

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 17

agagtataca tttgctaacc 20

<210> 18

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 18

tatctagaaa tgaaatgcat ttc 23

<210> 19

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial sequence)

<400> 19

tagcatgcta tcatattgtt aaa 23

Claims

1.一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2，其特征在于，抑菌物质为细菌素，所述菌株的分类命名是Enterococcus faecium XC2，该菌株于2016年5月31日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，其保藏号为CCTCC NO：M2016297。

2.权利要求1所述的产抑菌物质的屎肠球菌XC2在制备抑制致病性大肠杆菌K88的黏附药物中的应用。

3.一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2的筛选方法，其特征在于，具体按照以下步骤实施：

步骤1、样品采集及培养；

步骤2：菌株抑菌能力筛选，并传代保存；

步骤3、属的鉴定，最终筛选出产肠球菌素屎肠球菌XC2。

4.根据权利要求3所述的一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2的筛选方法，其特征在于，所述步骤1具体过程为：样品取自健康猪粪便，样品采集后，用棉拭子在KF链球菌琼脂培养基中划线培养，37℃、24h～48h培养后，选取红色，光滑凸起，周边整齐，1mm左右大小的菌落做纯培养，将纯培养物在MRS琼脂培养基上培养。

5.根据权利要求3所述的一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2的筛选方法，其特征在于，所述步骤2具体过程为：对纯化后的菌株进行发酵培养，用牛津杯法筛选对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、大肠杆菌有抑制作用的菌株，均传代保存。

6.根据权利要求3所述的一种产抑菌物质的屎肠球菌XC2的筛选方法，其特征在于，所述步骤3具体过程为：将上述分离的菌株进行6.5％NaCl生长试验、pH9.6肉汤生长试验、45℃生长试验、60℃，30min生长试验、胆汁-七叶苷水解试验，能耐受6.5％NaCl、在pH9.6肉汤中生长、45℃能存活、60℃作用30min能存活、胆汁-七叶苷水解阳性的菌株即定为肠球菌属细菌。

7.如权利要求1所述的抑菌物质，其特征在于，该抑菌物质种类为肠球菌素B。

8.如权利要求7所述的肠球菌素B对金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和大肠杆菌抑菌的应用。