CN106389475B - 脆弱拟杆菌在预防和/或治疗脑膜炎中的应用 - Google Patents

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Abstract

脆弱拟杆菌在预防和/或治疗脑膜炎中的应用，具体涉及脆弱拟杆菌在制备用于预防和/或治疗脑膜炎的药物、药物组合物、食品、保健品及食品添加剂中的应用，其中，所述脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌ZY‑312，该脆弱拟杆菌ZY‑312于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC No.10685。本发明的脆弱拟杆菌对于预防和/或治疗脑膜炎具有很好的效果，不产生耐药性，且安全无毒，不含肠毒素基因bft，与现有菌株相比，具有耐胆盐、耐胃酸等益生特性，具有广阔的应用前景。

Description

脆弱拟杆菌在预防和/或治疗脑膜炎中的应用
技术领域
本发明涉及微生物、药品、保健品、食品及日化产品技术领域，特别是涉及脆弱拟杆菌在预防和/或治疗脑膜炎中的应用。
背景技术
细菌性脑膜炎是中枢神经系统严重的感染性疾病，常见于成人，但以新生儿患者最多。因为新生儿免疫功能低下，白细胞趋化、黏附和移动功能不完善，补体活性以及体内特异性和非特异性抗体的浓度都比较低，所以是细菌性脑膜炎的高危人群。
20世纪30年代，磺胺药的问世将球菌性脑膜炎的病死率降至5％-15％。到1944年，采用磺胺和静脉注射兔抗血清治疗了87例b型流感嗜血杆菌性脑膜炎患儿，将病死率降至22％。20世纪60年代初期，氯霉素(加磺胺嘧啶)将流感嗜血杆菌性脑膜炎的病死率进一步降至5％-10％，使用抗血清治疗从此成为了历史。但磺胺对肺炎球菌性脑膜炎的疗效较差，病死率在45％-95％之间波动。
青霉素治疗肺炎球菌性脑膜炎始于20世纪40年代中期，全身和鞘内应用青霉素的病死率为49％。1949年道林(Dowling)采用大剂量青霉素(每2小时肌肉注射100万单位)治疗了21例肺炎球菌性脑膜炎病人，将病死率降至38％，开创了青霉素未经鞘内给药而达到“脑脊膜剂量”的现代疗法新时代。
在过去15年内，细菌性脑膜炎的治疗方法为静脉注射青霉素(或氨苄青霉素)和/或第3代头孢菌素。此时，脑膜炎球菌性脑膜炎的病死率徘徊于10％左右，流感嗜血杆菌性脑膜炎的病死率已降至5％以下，肺炎球菌性脑膜炎的病死率仍保持在20％左右。贝克(Beek)等通过大量荷兰病例证实了这一结果：脑膜炎球菌性脑膜炎的病死率为7％，肺炎球菌性脑膜炎的病死率为30％。
当脑脊液(CSF)内的细菌成分可引起炎性细胞因子释放的现象被揭示后，人们开始开展地塞米松辅助治疗的研究。在20世纪90年代初期进行的4项研究证明，地塞米松并不能改变流感嗜血杆菌性脑膜炎患儿的病死率，但可降低神经系统后遗症的发生率，主要是感觉神经性耳聋。2002年，荷兰科学家证明，地塞米松辅助治疗可使成年病人的后遗症发生率从25％降至15％，其中以肺炎球菌性脑膜炎的预后最好。
近30年来，尽管在各种新型有效抗生素不断出现以及现代医疗技术飞速发展的背景下，细菌性脑膜炎急性期的病死率有所下降，但神经系统后遗症的发生率仍居高不下。
在抗生素时代，细菌性脑膜炎病原菌对抗生素耐药性的问题将长期存在。例如，20世纪60年代出现了脑膜炎奈瑟菌对磺胺的耐药，20世纪70年代出现了流感嗜血杆菌对氨苄青霉素的耐药；20世纪90年代从美国脑膜炎病人分离出的肺炎链球菌菌株对青霉素耐药(中度耐药占21％，高度耐药占14％)，因此不得不联合应用第3代头孢菌素和万古霉素进行治疗。
但是抗生素在杀死病原菌的同时，会造成机体菌群失调、抗性的出现及免疫功能的下降。而菌群失调会导致便秘、急慢性腹泻、肠胃炎、肠功能紊乱，以及外来菌感染等疾病。长期下去，还可导致其他疾病并促进衰老，甚至引起癌症。
阪崎克罗诺杆菌(EnterobacterSakazakii)是乳制品中近年新发现的一种致病菌，阪崎克罗诺杆菌能引起严重的新生儿脑膜炎、小肠结肠炎和菌血症，死亡率高达40％-80％。
克罗诺杆菌传播入血需首先穿越肠屏障，进而引起肠菌血症，而肠上皮细胞是该屏障重要组成部分，是克罗诺杆菌侵入机体的门户。克罗诺杆菌还能穿越血脑屏障到达脑部引起脑膜炎，如果通过抑制克罗诺杆菌进入机体的肠屏障，则可以阻止其进入血脑屏障，并进而防止其引发脑膜炎。
阪崎克罗诺杆菌跨越人体血脑屏障最终引发脑膜炎有几个关键性的环节：高浓度的菌血症、细菌黏附、侵袭人脑微血管内皮细胞(HBMEC)、诱导HBMEC的细胞骨架重排及相关信号通路的激活，最终成功穿越HBMEC。HBMEC是人体血脑屏障的主要组成部分，黏附于细胞表面是细菌进入HBMEC的第一步，然后通过“拉链”(Zipper)机制进入细胞，并以空泡的形式穿越HBMEC。
益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称，其具有缓解乳糖不耐症、调整肠道微生态、增强自身免疫力等多种功效，目前越来越多的研究人员聚焦于益生菌，逐渐意识到它们的巨大治疗功效。
益生菌在摄入人和动物体内后，它们能够在肠粘膜上定居，在肠道内建群并且防止有害微生物在其上粘附，能通过保持肠内自然微生物区系，促进生物个体形成健康的可生长的微生物制剂，帮助维持人和动物的健康。
脆弱拟杆菌是一种革兰氏染色阴性、杆状、两端钝圆而浓染，有荚膜、无芽胞、无动力的专性厌氧细菌，其分为产肠毒素型和非产肠毒素型。脆弱拟杆菌作为人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存于结肠中，此外，呼吸道胃肠道及泌尿生殖道也可定植生长。目前，研究较多的是脆弱拟杆菌作为一种条件致病菌，当宿主粘膜受损时，可侵犯粘膜下层，引起感染，也可经血液流动，引起身体其器官如肠道、腹腔、肝、肺、脑组织化脓性感染并伴发脓肿和引起急慢性腹泻等症状；此外，脆弱拟杆菌对结肠、直肠癌的发生也有促进作用。
本领域已经对脆弱拟杆菌进行了大量研究。例如，从发育良好的婴儿或低龄动物肠道中分离出一种拟杆菌菌株BF839，将其制成活菌制剂后能够增加儿童生长发育，对防治急慢性肠炎、菌群失调、上呼吸道感染和神经官能症等具有较好疗效(参见申请号为“90102847.9”，名称为“一株有益菌株及其应用”的中国发明专利申请；张季阶，等.脆弱拟杆菌(BF839)菌液的临床应用研究.中国生物制品学杂志，1995年，第8卷，第2期，第63-65页))。
再如，申请号为“201310095126.7”，名称为“具有益生菌特性的脆弱拟杆菌”；申请号为“201310085744.3”，名称为“脆弱拟杆菌在制备治疗急性放射性肠炎组合物中的应用”；申请号为“201310085716.1”，名称为“脆弱拟杆菌在制备治疗炎症性肠病组合物中的应用”的中国发明专利申请所公开的脆弱拟杆菌，为在2012年从婴儿粪便中分离出一种具有益生菌特性的脆弱拟杆菌菌株(保藏编号为CGMCC NO.7280)，可用于治疗炎症性肠病、腹泻等。此外，通过对该菌株的进一步鉴定，发现该菌株(Bd312)在细菌形态、培养特性、生理生化反应结果与脆弱拟杆菌相似，经BLASTN序列比对，所分离菌株与脆弱拟杆菌标准株ATCC25285同源性达99％，药敏实验提示，菌株Bd312对头孢拉定、阿莫西林、庆大霉素、磺胺甲嗯唑、甲氧苄啶不敏感，急慢性毒性试验提示无毒性(刘洋洋，等.健康婴儿体内的无毒脆弱拟杆菌的分离及鉴定.中华医学杂志，2014年，第94卷，第30期，第2372-2374页)。然而，目前还没有关于利用脆弱拟杆菌治疗脑膜炎的文献记载。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是通过在多种疾病模型中对脆弱拟杆菌的作用进行检测和鉴定，提供一种脆弱拟杆菌在预防和/或治疗脑膜炎中的应用，能对脑膜炎具有良好的治疗和/或预防效果。
为了实现上述目的，本发明提供了了一种脆弱拟杆菌在制备用于预防和/或治疗脑膜炎的药物中的应用。
上述的脆弱拟杆菌应用，其中，所述脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌ZY-312，该脆弱拟杆菌ZY-312于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCCNo.10685。
上述的脆弱拟杆菌应用，其中，所述脑膜炎为新生儿脑膜炎。
上述的脆弱拟杆菌应用，其中，所述脑膜炎为细菌性脑膜炎。
上述的脆弱拟杆菌应用，其中，所述新生儿脑膜炎为细菌性脑膜炎。
为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗脑膜炎的药物组合物，其中，所述药物组合物包括药学有效剂量的脆弱拟杆菌ZY-312，该脆弱拟杆菌ZY-312于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCCNo.10685。
上述的药物组合物，其中，所述药物组合物为胶囊、溶液、悬乳液、袋装粉剂或颗粒剂，每一单一剂量的所述脆弱拟杆菌ZY-312菌株为106-1011细胞。
为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗脑膜炎的食品，其中，所述食品含有脆弱拟杆菌ZY-312，该脆弱拟杆菌ZY-312于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC No.10685。
为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗脑膜炎的保健品，其中，所述保健品含有脆弱拟杆菌ZY-312，该脆弱拟杆菌ZY-312于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC No.10685。
为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗脑膜炎的食品添加剂，其中，所述食品添加剂含有脆弱拟杆菌ZY-312，该脆弱拟杆菌ZY-312于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心，其保藏号为CGMCC No.10685。
本发明的技术效果在于：
本发明的脆弱拟杆菌对于预防和/或治疗脑膜炎具有很好的效果，不产生耐药性，且安全无毒，为治疗和/或预防脑膜炎提供了新的选择。此外，本发明的脆弱拟杆菌ZY-312是一株新的脆弱拟杆菌，该菌株是从发育良好的婴儿粪便中分离纯化得到的，是具有益生菌特性的脆弱拟杆菌新菌株，实验表明所分离到的脆弱拟杆菌ZY-312不含肠毒素基因bft(Bacteroides fragilis toxin)，与现有菌株相比，具有耐胆盐、耐胃酸等益生特性，具有广阔的应用前景。
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。
附图说明
图1为本发明的脆弱拟杆菌ZY-312厌氧培养后菌落形态图；
图2为本发明的脆弱拟杆菌ZY-312革兰氏染色镜检图(1000×)；
图3为本发明的脆弱拟杆菌ZY-312扫描电镜观察图(30000×)；
图4为本发明的PCR产物凝胶电泳结果对比图；
图5为本发明的PCR产物凝胶电泳结果对比图；
图6为根据全基因组序列比较建立的系统发育树截图；
图7为本发明的ZY-312对阪崎克罗诺杆菌的抑制作用对比效果图。
本发明的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，命名为ZY-312，于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的结构原理和工作原理作具体的描述：
本发明的实施方式包括：本发明通过对大量来自健康婴儿的粪便进行筛选，筛选出大量脆弱拟杆菌菌株，通过理化实验鉴定，发现了一种新的脆弱拟杆菌(Bacteroidesfragilis)，命名为ZY-312，与现有的脆弱拟杆菌菌株相比，其具有耐胆盐、耐胃酸等益生特性，可以弥补原有益生菌的一些缺陷，在消化道的含胆盐、酸性条件下仍然保持较高生物活性，是益生菌制品的优选菌株。该脆弱拟杆菌ZY-312于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
利用脆弱拟杆菌ZY-312可以制备成药物组合物。该药物组合物含有药学有效剂量的脆弱拟杆菌ZY-312。此外，所述药物组合物还可以含有合适的药物载体。该药物组合物可以为胶囊、溶液或可饮用悬乳液、袋装粉剂、颗粒剂等形式，每一单一剂量优选为脆弱拟杆菌ZY-312菌株约为106-1011细胞。
本发明的脆弱拟杆菌ZY-312还可以制成食品、保健品或食品添加剂等。所述食品、保健品或食品添加剂均含有脆弱拟杆菌ZY-312。这些食品、保健品或食品添加剂均可用于预防和治疗新生儿脑膜炎。
下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。需要指出的是，由本发明中的用于预防和/或治疗脑膜炎的脆弱拟杆菌或含有本发明的脆弱拟杆菌的药物组合物、食品、保健品和食品添加剂在施用于受试者后，都可以应用于上文所述的适应症并展现出上文所述的功能，在本发明范围内的所有剂型均已测试，下文中，仅仅是为说明，只在实施例中描述了其中一少部分，然而不应将其理解为对本发明的限制。
除非特殊说明，否则本发明中所使用的试剂都是市售可购买的。
实施例1
脆弱拟杆菌ZY-312的分离、纯化
试剂和仪器
(1)培养基A：类杆菌-胆汁-七叶苷(BBE)琼脂(青岛海博生物科技有限公司，货号：HB7028)基础上加入改良配方，具体成分如下表一：
表一
(2)培养基B：类杆菌-胆汁-七叶苷(BBE)琼脂(青岛海博生物科技有限公司，货号：HB7028)基础上加入改良配方，具体成分如下表二：
表二
(3)培养基C：布氏肉汤(青岛海博生物科技有限公司，货号：HB0241)中加入胎牛血清，加入量为5％(v/v)(浙江天杭生物科技股份有限公司，品牌：四季青，货号：HB0205)。
(4)实验仪器
2.5L密封培养罐(三菱瓦斯化学株式会社，C-31)
恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHP-9082)
显微镜(尼康仪器(上海)有限公司，型号：E100)
PCR仪(赛默飞世尔科技公司，型号：AppliedPCR系统9700)
电泳仪(北京市六一仪器厂，型号：DYCP-32B)
(5)试剂
厌氧产气袋(三菱瓦斯化学株式会社，货号：C-1)
细菌DNA提取试剂盒(Bacterial DNA Kit(细菌DNA提取试剂盒)OMEGA，货号：D3350-01)
Taq酶(宝生物工程(大连)有限公司，货号：DR100A)
琼脂糖(品牌：Biowest，货号：91622)
磺胺甲恶唑(西格玛奥德里奇公司(sigma)，货号：S7507-10G)
甲氧苄啶(西格玛奥德里奇公司(sigma)，货号：T7883-5G)
维生素K1(青岛日水生物科技有限公司，货号：21005)
DL1000 DNA Marker(生物工程(大连)有限公司，货号：D526A)
脆弱拟杆菌产肠毒素株(南方医院消化科孙勇老师提供，分离自临床腹泻患者)
脆弱拟杆菌标准株ATCC25285(购自广东省微生物研究所)
脆弱拟杆菌菌株Bd312(保藏号为CGMCC No.7280，由广州知光生物科技有限公司提供)
BF839菌株(分离自图腾益生液)。
(6)培养基配置
培养基A配置：称取BBE培养基61.5克，加热溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃左右时，加入过滤除菌的磺胺甲噁唑1g、甲氧苄啶4g和无菌脱纤维羊血50mL，混匀，倾入无菌平皿，备用。
培养基B配置：称取BBE培养基61.5克，加热溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃左右时，加入过滤除菌的磺胺甲噁唑1g、甲氧苄啶4g，混匀，倾入无菌平皿，备用。
培养基C配置：称取布氏肉汤培养基28.1g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15分钟，备用。使用前，加入5％的胎牛血清。
布氏肉汤配置：称取布氏肉汤培养基28.1g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15分钟，备用。
方法：
1、分离纯化
取新鲜的婴儿粪便0.5g，置于盛有4.5mL布氏肉汤的三角瓶中，振荡1分钟。取0.1mL滴于培养基上，划线后，置于厌氧罐中，37℃、培养48小时。挑取典型菌落于布氏肉汤培养基24h，进行革兰氏染色。显微镜下观察形态，选取革兰氏阴性菌的菌液，划线接种于血平皿，厌氧培养48h。根据平板上菌落形态特征及镜下观察菌体的染色特性、大小、球杆状和分布情况，判断是否纯化。如细菌不纯，则继续以上步骤，反复多次分离传代，直至得到纯化的菌株。
2、菌落特征
脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm，参见图1。
3、显微镜下形态
脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。
4、电镜下形态
固定液固定，扫描电镜观察。镜下可见，脆弱拟杆菌ZY-312大小在0.5～0.8×1～4.5μm，无鞭毛，无芽孢，参见图3。
5、生化鉴定
生化鉴定结果如下表三(表中，+表示阳性，-表示阴性)
表三
测定反应底物 结果
色氨酸 -
脲素 -
葡萄糖 +
甘露醇 -
乳糖 +
蔗糖 +
麦芽糖 +
柳醇 -
木糖 +
阿拉伯糖 -
明胶 -
七叶灵 +
甘油 -
纤维二糖 -/+
甘露糖 +
松叁糖 -
棉子糖 +
山梨醇 -
鼠李糖 -
海藻糖 -
API20A(生化反应鉴定板，法国生物梅里埃股份有限公司)生理生化反应结果显示：脆弱拟杆菌ZY-312可发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、七叶灵、甘露糖、棉子糖，符合脆弱拟杆菌的特征。
实施例2
脆弱拟杆菌ZY-312鉴定
聚合酶链式反应(PCR)引物(由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成)序列如下：
引物对1：
正向引物：5’-ACGCTTGCACCCTCCGTATTA-3’
反向引物：5’-GCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
引物对2：
正向引物：5’-TGGGTGGTTGCTGCCTGGACACA-3’
反向引物：5’-CATCCGGGTATGGATATGAA-3’
引物对3：
正向引物：5’-GATGCTCCAGTTACAGCTTCCATTG-3’
反向引物：5’-CGCCCAGTATATGACCTAGTTCGTG-3’
bft基因引物对：
正向引物：5’-GACGGTGTATGTGATTTGTCTGAGAGA-3’
反向引物：5’-ATCCCTAAGATTTATTATCCCAAGTA-3’
1、PCR鉴定(PCR即聚合酶链式反应，是常用的快速扩增基因的方法)
(1)16S rRNA序列测定
取上述菌株接种于培养基A上，37℃、厌氧培养48h。取单一菌接种于液体培养基中，37℃、厌氧培养48h。DNA提取试剂盒提取细菌DNA(天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP302-02)，作为PCR模板DNA。
16S rRNA基因序列的扩增：引物对1扩增片段大小约为531bp；引物对2扩增片段大小为518bp；引物对3扩增片段大小约为970bp。
采用20μL PCR反应体系：Taq酶10μL、模板DNA 2μL、正向反向引物各1μL、无菌去离子水6μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、30个循环、72℃延伸10min。
PCR产物在2％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为100V、15min。
PCR产物凝胶电泳结果如图4所示，其中1、2泳道分别为引物对1、引物对2；4、5泳道分别为引物对1、引物对2(重复PCR的结果)；3、6泳道为引物对3；8泳道为DNA分子量标准物(DL1000 DNA marker)。分离菌株DNA采用引物对1进行PCR扩增后产物大小为531bp，采用引物对2进行PCR扩增后产物大小为518bp，采用引物对3进行PCR扩增后产物大小为970bp，符合预期，所分离菌株为脆弱拟杆菌。
将PCR产物进行核苷酸序列测定(由深圳华大基因科技有限公司进行测定)，测序结果在Genbank(美国国家生物技术信息中心建立的DNA序列数据库)上进行BLAST比对(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，见表四。
结果表明分离到为一株脆弱拟杆菌。
表四为16S rRNA序列的BLAST比对结果(部分)
表四
(2)PCR检测bft基因
将测序筛选到的菌株接种于培养基C中，37℃、厌氧培养48小时。取培养菌液2mL，用细菌DNA提取试剂盒提取DNA，作为PCR模板DNA。bft基因的扩增采用bft基因引物，扩增片段大小应为294bp。
采用20μL PCR反应体系：Taq酶10μL、模板DNA 2μL、上下引物各1μL、无菌去离子水6μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性30s，55℃退火30s、72℃延伸45s，共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为100V、15min。
结果参见图5，其中1、2、3、4泳道为分离菌株ZY-312电泳结果；5、6、7为产肠毒素株脆弱拟杆菌电泳结果；8泳道为DL1000 DNA marker。4、5泳道为bft基因引物对扩增产物；1、7泳道为引物对2扩增产物；2、6为引物对1扩增产物；3泳道为引物对3扩增产物。
结果表明，ZY-312为一株脆弱拟杆菌，且不含有肠毒素bft基因，为一株新的无毒株。
2、全基因组测序分析鉴定
对脆弱拟杆菌ZY-312进行全基因组测序(深圳华大基因科技有限公司)，测序结果与已发表的菌株序列相互比对，利用treebest软件(该软件可在sourceforge网站上免费下载，下载链接为：http：//treesoft.svn.sourceforge.net/viewrc/treesoft/)采用邻接法构建NJ-tree或利用软件PhyML采用最大似然法构建最大似然树。系统发育树显示(参见图6)，脆弱拟杆菌ZY-312与脆弱拟杆菌标准株ATCC25285(即NCTC9343)在同一分支上，表明检脆弱拟杆菌ZY-312为一株新的脆弱拟杆菌，与ATCC25285同源。
对全基因组测序结果进行毒力基因分析，以验证其是否含产毒素bft基因。结果显示，脆弱拟杆菌ZY-312全基因组中不含bft基因，为一株不产肠毒素的新的脆弱拟杆菌。
实施例3
脆弱拟杆菌ZY-312对胃酸的耐受性
1、人工胃液配制(根据2010年《中国药典》人工胃液配制方法)
23.4mL浓HCl溶解于100mL纯化水中，即得稀盐酸。取8.2mL稀盐酸，加入400mL纯化水与5g胃蛋白酶(猪源，1∶15000)，定容到500mL。于37℃、磁力搅拌过夜，即得人工胃液。
2、菌体准备
收集菌液，离心，弃上清，生理盐水重悬后，再次离心，弃上清，菌体备用。
3、加入人工胃液测定活菌数
向菌体加入人工胃液，重悬，分别测定0、1、2、3h活菌数。
活菌计数采用10倍系列稀释法：取100μL菌液加入900μL布氏肉汤培养基中，逐步梯度稀释至合适浓度。例如，每个平板点4个浓度梯度，每个梯度重复点样3次，每次点样20μL。37℃、厌氧培养48h，数菌落数(取菌落数为3-30的浓度梯度计数)。
活菌数(CFU/mL)＝三个点样菌落总和/3×50×稀释度
表五为不同菌株胃酸耐受实验结果(其中，数据为活菌浓度log值，h为小时)
表五
益生菌必须进入人体的胃肠道并达到一定浓度才能发挥其功能。从口腔到肠道过程中，益生菌首先必须以活菌状态通过胃才有可能进入肠道。食物(尤其是流体)通过胃的时间一般为1-2h(小时)。根据饮食结构的不同，人体胃液的pH值波动很大，通常在pH3.0左右，空腹或食用酸性食品时可达pH1.5，食用碱性食品时可达pH 4-5，胃液的这种酸性环境可以激活胃蛋白酶原，从而杀死随食物进入胃内的细菌。益生菌如果要在人体内发挥益生作用，就必须具有一定的耐酸能力和耐胃蛋白酶的能力。
结果表明，与脆弱拟杆菌其他菌株相比，脆弱拟杆菌ZY-312在3h后活菌浓度仍然较高，而其他菌株的活菌浓度随时间降低很快，说明ZY-312对胃酸耐受性较好，具有很好的益生潜力和应用前景。
实施例4
脆弱拟杆菌ZY-312对胆盐耐受实验
1、实验材料
胰蛋白胨大豆肉汤(简称TSB，品牌：OXOID，货号：CM0129B)
胰蛋白胨大豆琼脂(简称TSA，品牌：OXOID，货号：CM0131B)
牛胆粉(生物工程上海(股份)有限公司，货号：ON1210)
胎牛血清(美国MP Biomedicals公司，货号：2916754)
2、菌株和试剂的准备
胆粉溶液：在TSB中加入牛胆粉，设置三个终浓度，分别为10g/L(1％牛胆粉)、20g/L(2％牛胆粉)和40g/L(4％牛胆粉)。灭菌后加入血清(终浓度50mL/L)待用。同时，以不加牛胆粉的TSB作为对照。
菌株培养与收集：菌株(ZY-312、Bd312、BF839、ATCC25285)于37℃、厌氧液体静态培养至对数生长后期(约14-16小时)，分装至离心管中，每管分装3ml菌液，室温、4000rpm离心5分钟。再用0.01M PBS洗菌1次(室温、4000rpm离心5分钟)，弃上清，沉淀待用。
3、人工胆粉培养基中培养
用上述胆粉溶液将洗涤后的细菌重悬，用含胆粉溶液调整初始菌液浓度为1×108CFU/mL。并在37℃、厌氧培养1、2、4小时，涂板计数活菌数目的变化，0小时细菌数目作为对照。实验平行做3次。
4、计算细菌耐受胆粉情况
将上述三个时间点涂板结果，与对应的0小时结果进行比较，即可得到菌株在人工胆粉溶液中作用不同时间后其耐受胆粉的结果，以均数±标准差及统计结果说明。
表六为SK08菌株耐胆粉实验结果(n＝3)
表六
时间 菌株 胆粉浓度0％ 胆粉浓度1％ 胆粉浓度2％ 胆粉浓度4％
0h ZY-312 100.00％ 100.00％ 100.00％ 100.00％
Bd312 100.00％ 100.00％ 100.00％ 100.00％
BF839 100.00％ 100.00％ 100.00％ 100.00％
ATCC25285 100.00％ 100.00％ 100.00％ 100.00％
1h ZY-312 72.90±8.39％ 89.18±8.20％ 111.65±9.85％ 127.15±3.52％
Bd312 65.32±5.6％ 73.92±9.32％ 96.73±5.35％ 118.72±4.93％
BF839 50.32±3.09％ 65.73±7.32％ 89.33±7.39％ 94.76±6.32％
ATCC25285 51.34±3.45％ 66.97±3.54％ 90.73±2.51％ 95.72±8.43％
2h ZY-312 112.15±3.73％ 131.30±3.44％ 190.61±5.54％ 226.80±24.63％
Bd312 99.39±6.17％ 103.83±2.52％ 135.32±5.92％ 164.03±8.43％
BF839 93.39±3.51％ 98.52±4.91％ 103.21±4.81％ 105.51±6.53％
ATCC25285 95.61±4.82％ 101.47±2.57％ 112.56±2.69％ 115.49±5.72％
4h ZY-312 231.51±5.03％ 274.62±7.73％ 364.40±6.78％ 327.49±3.20％
Bd312 210.23±4.93％ 203.57±5.02％ 293.84±4.91％ 299.21±6.31％
BF639 202.52±3.91％ 211.82±6.41％ 229.57±4.91％ 253.41±4.62％
ATCC25285 204.97±5.82％ 201.93±5.93％ 246.52±6.41％ 254.38±4.93％
结果如表六所示，0-4h观察，ZY-312在1％、2％、4％浓度胆粉中均可正常生长，随着胆粉浓度升高其活菌数越高，ZY-312活菌数显著高于其他菌株组。结果表明ZY-312耐受胆盐，并显著优于其他菌株。
胆盐是肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合形成的钠盐或钾盐，它是胆汁参与消化和吸收的主要成分。胆盐排到小肠后，大部分由小肠黏膜吸收入血，再入肝脏组成胆汁。人体小肠中胆盐的质量浓度在0.03～0.3g/100mL的范围波动。
对于活细胞来说，胆盐能破坏细胞膜，因此对胆盐的耐受性是评价益生菌的重要指标之一。益生菌可产生胆盐水解酶，此酶可将甘氨酸和牛磺酸结合的胆盐催化水解为氨基酸残基和游离胆盐。具有胆汁盐解离能力的菌株可以降低高胆固醇人群的血清胆固醇水平和防止正常人高胆固醇血症的发生。消化道中胆盐的浓度不是固定不变的，在进食消化的开始1h，其质量浓度为15～20g/L，之后其质量浓度降为3g/L左右。益生菌必须在通过胃肠过程中，可以在正常的胆盐浓度下存活，如要在小肠中定殖，必须耐受胆盐的抑制作用。因此，相对于脆弱拟杆菌的其他菌株，ZY-312具有更好的应用前景。
实施例5
脆弱拟杆菌ZY-312对阪崎克罗诺杆菌的抑制作用的细胞实验
细胞和菌株：结肠腺癌细胞Caco-2由南方医科大学微生物学系保存；阪崎克罗诺杆菌ATCC29544为购自ATCC(即美国模式培养物集存库American type culturecollection)的标准株；大肠杆菌E44、DH5α由南方医科大学微生物学系保存。
培养基：乳酸细菌培养基(简称MRS)、脑心浸液肉汤培养基(简称BHI)、细菌基础培养基(简称LB)，购自广东环凯微生物科技有限公司；胎牛血清(赛默飞世尔科技公司，品牌：Gbico)，购自广州鼎国生物科技有限公司；无菌脱脂纤维绵羊血，购自南京便诊生物科技有限公司。
本实验分为四个组，分别为对照组、竞争组、置换组、排斥组。对照组：Caco-2+ATCC29544共孵育3h；竞争组：Caco-2+ATCC 29544+ZY-312共孵育3h；置换组：Caco-2+ATCC29544共孵育1h，再加ZY-312，继续孵育2h；排斥组：Caco-2+ZY-312共孵育1h，再加ATCC29544，继续孵育2h。
细胞感染倍数为100(细胞∶细菌＝1∶100)，ZY-312为108CFU(Colony-FormingUnits，菌落形成单位，指单位体积中的活菌个数)。孵育后，细胞用培养基洗3次，加入100μL0.5％Triton X-100裂解细胞(此浓度Triton X-100在半小时之内不会影响细菌活性)，孵育8min后，立即加入50μL蒸馏水。在溶解细胞之前的孵育和清洗阶段，单层细胞都要保持完整。反复吹打后吸出样品，做梯度稀释(10-1～10-4)后涂血平板计数菌落数。计算侵袭率，侵袭率＝胞内细菌数/孵育细菌数×100％。
共孵育分别采用竞争、排斥、置换方式，参见图7，结果显示：细胞中加入ZY-312后，克罗诺杆菌侵袭率明显降低(*P＝0.0184＜0.05)，竞争组、排斥组、置换组与对照组有显著性差异。实验结果表明脆弱拟杆菌ZY-312可抑制ATCC29544对Caco-2细胞的侵袭。
实施例6
脆弱拟杆菌ZY-312对阪崎克罗诺杆菌的抑制作用的大鼠实验
实验动物：SD大鼠窝鼠2-3日龄12窝，80只，精神状态良好，购自南方医科大学实验动物中心。
分别进行预防和治疗实验，检测ZY-312在动物体内对阪崎克罗诺杆菌的抑制效果，实验分组及方案具体见表七，表七为动物实验分组及处理方法，其中，PBS为磷酸盐缓冲液。
表七
通过ZY-312对乳鼠的预防和治疗实验，结果显示：血液中均无ZY-312，表明使用ZY-312，不会引起益生菌性菌血症；血液中对照组100％检测到ATCC29544，预防实验组、治疗实验组检测率分别为60％、70％；脑脊液检测结果，对照组检测率为70％(预防)和75％(治疗)，而实验组为0％(预防)和5％(治疗)。实验组检测到脑膜炎的小鼠数量明显少于对照组，说明ZY-312在体内可抑制阪崎克罗诺杆菌穿越肠屏障，从而减少进入血脑屏障的细菌数量，用ZY-312预防和/或治疗细菌性脑膜炎具有显著效果，见表八，表八为ZY-312对乳鼠阪崎克罗诺杆菌致脑膜炎的预防和治疗效果，其中，脑脊液平板上长有致病菌的即定义为脑膜炎。
表八
可见，本发明的脆弱拟杆菌对于预防和/或治疗脑膜炎具有很好的效果，不产生耐药性，且安全无毒，为治疗和/或预防脑膜炎提供了新的选择。此外，本发明的脆弱拟杆菌ZY-312是一株新的脆弱拟杆菌，该菌株是从发育良好的婴儿粪便中分离纯化得到的，是具有益生菌特性的脆弱拟杆菌新菌株，实验表明所分离到的脆弱拟杆菌ZY-312不含肠毒素基因bft，与现有菌株相比，具有耐胆盐、耐胃酸等益生特性，具有广阔的应用前景。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (9)

1.脆弱拟杆菌在制备用于预防和/或治疗脑膜炎的药物中的应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌为保藏号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312，所述脆弱拟杆菌ZY-312不含肠毒素基因bft。
2.如权利要求1所述的脆弱拟杆菌应用，其特征在于，所述脑膜炎为新生儿脑膜炎。
3.如权利要求1所述的脆弱拟杆菌应用，其特征在于，所述脑膜炎为细菌性脑膜炎。
4.如权利要求2所述的脆弱拟杆菌应用，其特征在于，所述新生儿脑膜炎为细菌性脑膜炎。
5.一种用于预防和/或治疗脑膜炎的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药学有效剂量的保藏号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312，所述脆弱拟杆菌ZY-312不含肠毒素基因bft。
6.如权利要求5所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物为胶囊、溶液、悬乳液、袋装粉剂或颗粒剂，每一单一剂量为106-1011个所述脆弱拟杆菌ZY-312菌株细胞。
7.一种用于预防和/或治疗脑膜炎的食品，其特征在于，所述食品含有保藏号为CGMCCNo.10685的脆弱拟杆菌ZY-312，所述脆弱拟杆菌ZY-312不含肠毒素基因bft。
8.一种用于预防和/或治疗脑膜炎的保健品，其特征在于，所述保健品含有保藏号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312，所述脆弱拟杆菌ZY-312不含肠毒素基因bft。
9.一种用于预防和/或治疗脑膜炎的食品添加剂，其特征在于，所述食品添加剂含有保藏号为CGMCC No.10685的脆弱拟杆菌ZY-312，所述脆弱拟杆菌ZY-312不含肠毒素基因bft。
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