CN106387314A - 脆弱拟杆菌在动物养殖中的应用 - Google Patents

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Abstract

脆弱拟杆菌在动物养殖中的应用，具体涉及脆弱拟杆菌在预防和/或治疗动物胃肠道疾病的应用及其在药物组合物和饲料添加剂中的应用，其中，脆弱拟杆菌为ZY‑312，保藏号为CGMCC No.10685。本发明的脆弱拟杆菌ZY‑312不含肠毒素基因bft，相比于现有的脆弱拟杆菌，具有显著更高的耐受胆盐、胃酸能力，能够有效的预防和/或治疗动物胃肠道疾病，提高动物免疫力、抗病力，降低动物患病率，提高动物饲料转化率，增加动物体重，促进其生长发育及生产性能，可减少抗生素使用，不产生耐药性，且安全无毒，可提高肉、蛋、奶等产品品质，也可以消除抗生素药物残留，净化厩舍环境，保护生态环境。

Description

脆弱拟杆菌在动物养殖中的应用
技术领域
本发明涉及微生物、药品、保健品、食品及日化产品技术领域，特别是涉及脆弱拟杆菌在动物养殖中的应用。
背景技术
我国是畜牧业大国，据有关部门统计，我国的猪、禽、肉、蛋类产量都居世界首位，然而，如此发达的畜牧业也存在很多问题，如优质的禽类和畜类供不应求、动物的抗病能力差等。据近期全国畜牧疫病普查显示，我国共有各类畜禽疫病上百种，70年代以来，新增畜禽疫病就达37种，畜禽疫病已经成为影响我国畜牧业发展的一大障碍。因此在养育过程中，养殖户会非法使用促生长药物、安眠药、避孕药等饲料添加剂，滥用抗生素等来增加其产量及抗病能力，从而造成了病原微生物的耐药性增加及药物在体内残留增多，产品质量严重受损，此类产品对人体健康有极大损害，使得我国在畜牧业产品出口问题上面临诸多壁垒。研发和应用能替代传统抗生素药物及饲料添加剂的绿色环保型药物及饲料添加剂已成为畜牧业亟待解决的问题。而目前，微生态制剂也已成为研发的焦点。
从20世纪40年代开始，国外便有人研究将微生物制剂用于饲料，1947年Miollgaard首先发现用乳酸菌喂养的仔猪较传统喂养的仔猪发育更加良好。1967年，Letchnikoff用酸牛奶来治疗幼畜腹泻，效果显著。70年代美国开始大规模用于益生菌饲料来替代抗生素，既可减少畜肉抗生素残留，又可促进生长，提高饲料利用率。
目前，广泛应用于饲料中的益生菌制剂主要可分为乳酸杆菌类活菌制剂、芽孢杆菌类活菌制剂、酵母菌类活菌制剂。诸多研究证实微生物制剂具有改善动物肠道微生态环境，提高机体免疫力，增强动物抗病能力，促进动物生长发育。范国歌等人的研究显示复合益生菌制剂能够抑制大肠杆菌的生长，并且能够治疗仔猪腹泻，同时能提高肠道中脂肪酶活性。白云飞等学者的研究显示复 配益生菌组合制剂能提高青脚麻鸡的脏器指数，增加肠道有益菌数量，促进其生长。Giangh也取得了类似的研究结果，其研究表明，在饲粮中添加益生菌可以减少断奶仔猪腹泻的发生，增加肠道中乳酸菌数量和有机酸的含量，减少大肠杆菌的定植。Bontempo V等在断奶仔猪饲粮中添加酵母菌，分析显示肠道黏膜的巨噬细胞明显增多，增强了对细菌感染的抵抗力。申请号为“US5951977”的美国专利申请公开了一种能够抑制猪体内沙门氏菌定植的多种益生菌组合制剂。
目前，微生态制剂是公认的无毒无污染的替代抗生素饲料的环保产品，其越来越多地被应用于畜牧业及水产养殖业中。有学者指出，抗生素之后的时代，将是微生态制剂的时代。然而，市场上优良菌种种类匮乏，尚需开发新的菌种。
脆弱拟杆菌是一种革兰氏染色阴性、杆状、两端钝圆而浓染，有荚膜、无芽胞、无动力的专性厌氧细菌，其分为产肠毒素型和非产肠毒素型。脆弱拟杆菌作为人及动物肠道正常菌群的一部分，主要存于结肠中，此外，呼吸道胃肠道及泌尿生殖道也可定植生长。目前，研究较多的是脆弱拟杆菌作为一种条件致病菌，当宿主粘膜受损时，可侵犯粘膜下层，引起感染，也可经血液流动，引起身体其器官如肠道、腹腔、肝、肺、脑组织化脓性感染并伴发脓肿和引起急慢性腹泻等症状；此外，脆弱拟杆菌对结肠、直肠癌的发生也有促进作用。
本领域已经对脆弱拟杆菌进行了大量研究。例如，从发育良好的婴儿或低龄动物肠道中分离出一种拟杆菌菌株BF839，将其制成活菌制剂后能够增加儿童生长发育，对防治急慢性肠炎、菌群失调、上呼吸道感染和神经官能症等具有较好疗效(参见申请号为“90102847.9”，名称为“一株有益菌株及其应用”的中国发明专利申请；张季阶，等.脆弱拟杆菌(BF839)菌液的临床应用研究.中国生物制品学杂志，1995年，第8卷，第2期，第63-65页)。
再如，申请号为“201310095126.7”，名称为“具有益生菌特性的脆弱拟杆菌”；申请号为“201310085744.3”，名称为“脆弱拟杆菌在制备治疗急性放射性肠炎组合物中的应用”；申请号为“201310085716.1”，名称为“脆弱拟杆菌在制备治疗炎症性肠病组合物中的应用”的中国发明专利申请所公开的脆弱拟杆菌，为在2012年从婴儿粪便中分离出一种具有益生菌特性的脆弱拟杆菌菌株(保藏编号为CGMCC NO.7280)，可用于治疗炎症性肠病、腹泻等。此外，通过对该菌株的进一步鉴定，发现该菌株(Bd312)在细菌形态、培养 特性、生理生化反应结果与脆弱拟杆菌相似，经BLASTN序列比对，所分离菌株与脆弱拟杆菌标准株ATCC25285同源性达99％，药敏实验提示，菌株Bd312对头孢拉定、阿莫西林、庆大霉素、磺胺甲嗯唑、甲氧苄啶不敏感，急慢性毒性试验提示无毒性(刘洋洋，等.健康婴儿体内的无毒脆弱拟杆菌的分离及鉴定.中华医学杂志，2014年，第94卷，第30期，第2372-2374页)。
目前，市场上尚缺乏包含脆弱拟杆菌的微生态制剂，而且，该菌的应用领域也有待扩展。
发明内容
本发明所要解决的技术问题是提供一种脆弱拟杆菌ZY-312在动物养殖中的应用，特别是用于预防和/或治疗动物胃肠道疾病的药物组合物和饲料添加剂。
为了实现上述目的，本发明提供了脆弱拟杆菌在动物养殖中的应用。
上述的脆弱拟杆菌应用，其中，所述脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌ZY-312，保藏号为CGMCC No.10685。
为了更好地实现上述目的，本发明还提供了脆弱拟杆菌在预防和/或治疗动物胃肠道疾病中的应用，所述脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌ZY-312，保藏号为CGMCC No.10685。
为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗动物胃肠道疾病的药物组合物，其中，所述药物组合物包括药学有效剂量的脆弱拟杆菌ZY-312。
为了更好地实现上述目的，本发明还提供了一种用于预防和/或治疗动物胃肠道疾病的饲料添加剂，其中，所述饲料添加剂包括有效量的脆弱拟杆菌ZY-312。
上述的饲料添加剂，其中，所述有效量为能有效维持健康的肠微生物菌群的剂量，所述脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的添加量≥1×106CFU/g。
上述的饲料添加剂，其中，所述有效量为能有效减少动物中病原性细菌及病毒的生长的剂量，所述脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的添加量≥1×106CFU/g。
上述的饲料添加剂，其中，所述有效量为能有效提高动物饲料利用效率或动物存活率的剂量，所述脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的添加量≥1×106CFU/g。
上述的饲料添加剂，其中，所述有效量为能有效增加动物重量的剂量，所述脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的添加量≥1×106CFU/g。
上述的饲料添加剂，其中，所述动物为猪或家禽。
上述的饲料添加剂，其中，所述猪为仔猪或母猪，所述家禽为鸡。
本发明的技术效果在于：
本发明是从发育良好的婴儿粪便中分离纯化得到的，从大量脆弱拟杆菌菌株中筛选出的该脆弱拟杆菌ZY-312，经证实不含肠毒素基因bft，是一株无毒株，具有益生菌特性，经过发酵培养、染色镜检及生理生化特性分析及动物实验发现：与现有的其他脆弱拟杆菌菌株相比，脆弱拟杆菌ZY-312具有突出的耐胆盐、耐胃酸等益生特性，可以有效克服现有脆弱拟杆菌在消化道中容易失活等缺点，是新一代微生态制剂的优选菌株，具有广阔的应用前景。本发明的脆弱拟杆菌ZY-312在预防和/或治疗动物胃肠道疾病中的应用，既可用于防治动物肠道疾病。该菌安全可靠，在畜牧业领域有很好的发展前景。
以下结合附图和具体实施例对本发明进行详细描述，但不作为对本发明的限定。
附图说明
图1为本发明的脆弱拟杆菌ZY-312厌氧培养后菌落形态；
图2为本发明的脆弱拟杆菌ZY-312革兰氏染色镜检图(1000×)；
图3为本发明的脆弱拟杆菌ZY-312扫描电镜观察图(30000×)；
图4为本发明的PCR产物凝胶电泳结果对比图；
图5为本发明的PCR产物凝胶电泳结果对比图；
图6为根据全基因组序列比较建立的系统发育树；
图7A-7D为本发明的仔猪剖检生理情况图。
本发明的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)ZY-312于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
具体实施方式
下面结合附图对本发明的结构原理和工作原理作具体的描述：
本发明的实施方式包括：本发明通过对大量来自健康婴儿的粪便进行筛选，筛选出大量脆弱拟杆菌菌株，通过理化实验鉴定，发现了一种新的脆弱拟杆菌(Bacteroides fragilis)，命名为ZY-312，与现有的脆弱拟杆菌菌株相比，其具有耐胆盐、耐胃酸等益生特性，可以弥补原有益生菌的一些缺陷，在消化道的含胆盐、酸性条件下仍然保持较高生物活性，是益生菌制品的优选菌株。该脆弱拟杆菌ZY-312于2015年4月2日保藏于中国普通微生物菌种保藏管理中心(CGMCC)，其保藏编号为CGMCC No.10685，保藏地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
利用脆弱拟杆菌ZY-312可以应用于动物养殖中，或用于预防和/或治疗动物胃肠道疾病中，也可制备成药物组合物。该药物组合物含有药学有效剂量的脆弱拟杆菌ZY-312。此外，所述药物组合物还可以含有合适的药学上可接受的药物载体及动物养殖上可接受的载体。本发明的脆弱拟杆菌ZY-312还可以制成用于预防和/或治疗动物胃肠道疾病的饲料添加剂。所述饲料添加剂含有有效量的脆弱拟杆菌ZY-312。其中，所述动物例如为猪，可包括仔猪和母猪，也可以为家禽，例如鸡、鸭或鹅。该有效量的脆弱拟杆菌ZY-312的剂量可有效维持健康的肠微生物菌群、有效减少动物中病原性细菌及病毒的生长、有效提高动物的饲料利用效率、有效提高动物的存活率及有效提高动物的重量增加。
下面将结合具体实施例对本发明作进一步说明。需要指出的是，由本发明中的用于预防和/或治疗动物胃肠道疾病的脆弱拟杆菌或含有本发明的脆弱拟杆菌的药物组合物、饲料添加剂在施用于受试者后，都可以应用于上文所述的适应症并展现出上文所述的功能，在本发明范围内的所有剂型均已测试，下文中，仅仅是为说明，只在实施例中描述了其中一少部分，然而不应将其理解为对本发明的限制。
除非特殊说明，否则本发明中所使用的试剂都是市售可购买的。
实施例1
脆弱拟杆菌ZY-312分离、纯化
试剂和仪器
(1)培养基A：类杆菌-胆汁-七叶苷(BBE)琼脂(青岛海博生物科技有 限公司，货号：HB7028)基础上加入改良配方，具体成分如下表一：
表一
(2)培养基B：类杆菌-胆汁-七叶苷(BBE)琼脂(青岛海博生物科技有限公司，货号：HB7028)基础上加入改良配方，具体成分如下表二：
表二
(3)培养基C：布氏肉汤(青岛海博生物科技有限公司，货号：HB0241)中加入胎牛血清，加入量为5％(v/v)(浙江天杭生物科技股份有限公司，品牌：四季青，货号：HB0205)。
(4)实验仪器
2.5L密封培养罐(三菱瓦斯化学株式会社，C-31)
恒温培养箱(上海一恒科学仪器有限公司，型号：DHP-9082)
显微镜(尼康仪器(上海)有限公司，型号：E100)
PCR仪(美国应用生物系统公司，型号：AppliedPCR系统9700)
电泳仪(北京市六一仪器厂，型号：DYCP-32B)
(5)试剂
厌氧产气袋(三菱瓦斯化学株式会社，货号：C-1)
细菌DNA提取试剂盒(Bacterial DNA Kit(细菌DNA提取试剂盒)美国OMEGA公司，货号：D3350-01)
Taq酶(宝生物工程(大连)有限公司，货号：DR100A)
琼脂糖(品牌：Biowest，货号：91622)
磺胺甲恶唑(西格玛奥德里奇公司(sigma)，货号：S7507-10G)
甲氧苄啶(西格玛奥德里奇公司(sigma)，货号：T7883-5G)
维生素K1(青岛日水生物科技有限公司，货号：21005)
DL1000 DNA Marker(宝生物工程(大连)有限公司，货号：D526A)
脆弱拟杆菌产肠毒素株(南方医院消化科孙勇老师提供，分离自临床腹泻患者)
脆弱拟杆菌标准株ATCC25285(购自广东省微生物研究所)
脆弱拟杆菌菌株Bd312(保藏号为CGMCC No.7280，由广州知光生物科技有限公司提供)
BF839菌株(分离自图腾益生液)。
(6)培养基配置
培养基A配置：称取BBE培养基61.5克，加热溶解于1000mL蒸馏水中， 121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃左右时，加入过滤除菌的磺胺甲噁唑1g、甲氧苄啶4g和无菌脱纤维羊血50mL，混匀，倾入无菌平皿，备用。
培养基B配置：称取BBE培养基61.5克，加热溶解于1000mL蒸馏水中，121℃高压灭菌15分钟，冷却至50℃左右时，加入过滤除菌的磺胺甲噁唑1g、甲氧苄啶4g，混匀，倾入无菌平皿，备用。
培养基C配置：称取布氏肉汤培养基28.1g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15分钟，备用。使用前，加入5％的胎牛血清。
布氏肉汤配置：称取布氏肉汤培养基28.1g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装三角瓶，121℃高压灭菌15分钟，备用。
方法：
1、分离纯化
取新鲜的婴儿粪便0.5g，置于盛有4.5mL布氏肉汤的三角瓶中，振荡1分钟。取0.1mL滴于培养基上，划线后，置于厌氧罐中，37℃、培养48小时。挑取典型菌落于布氏肉汤培养基24h，进行革兰氏染色。显微镜下观察形态，选取革兰氏阴性菌的菌液，划线接种于血平皿，厌氧培养48h。根据平板上菌落形态特征及镜下观察菌体的染色特性、大小、球杆状和分布情况，判断是否纯化。如细菌不纯，则继续以上步骤，反复多次分离传代，直至得到纯化的菌株。
2、菌落特征
脆弱拟杆菌ZY-312在血平皿上培养48h后，呈现圆形微凸、半透明、白色、表面光滑、不溶血，菌落直径在1-3mm，参见图1。
3、显微镜下形态
脆弱拟杆菌ZY-312进行革兰氏染色镜检，为革兰阴性细菌，呈现典型的杆状，两端钝圆而浓染，菌体中间不着色部分形如空泡，参见图2。
4、电镜下形态
固定液固定，扫描电镜观察。镜下可见，脆弱拟杆菌ZY-312大小在0.5～0.8×1～4.5μm，无鞭毛，无芽孢，参见图3。
5、生化鉴定
表三为生化鉴定结果(表中，+表示阳性，-表示阴性)
表三
测定反应底物 结果
色氨酸 -
脲素 -
葡萄糖 +
甘露醇 -
乳糖 +
蔗糖 +
麦芽糖 +
柳醇 -
木糖 +
阿拉伯糖 -
明胶 -
七叶灵 +
甘油 -
纤维二糖 -/+
甘露糖 +
松叁糖 -
棉子糖 +
山梨醇 -
鼠李糖 -
海藻糖 -
API20A(生化反应鉴定板，法国生物梅里埃股份有限公司)生理生化反应结果显示：脆弱拟杆菌ZY-312可发酵葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖、木糖、七叶灵、甘露糖、棉子糖，符合脆弱拟杆菌的特征。
实施例2
脆弱拟杆菌ZY-312鉴定
聚合酶链式反应(PCR)引物(由英潍捷基(上海)贸易有限公司合成)序列如下：
引物对1：
正向引物：5’-ACGCTTGCACCCTCCGTATTA-3’
反向引物：5’-GCTTAGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’
引物对2：
正向引物：5’-TGGGTGGTTGCTGCCTGGACACA-3’
反向引物：5’-CATCCGGGTATGGATATGAA-3’
引物对3：
正向引物：5’-GATGCTCCAGTTACAGCTTCCATTG-3’
反向引物：5’-CGCCCAGTATATGACCTAGTTCGTG-3’
bft基因引物对：
正向引物：5’-GACGGTGTATGTGATTTGTCTGAGAGA-3’
反向引物：5’-ATCCCTAAGATTTATTATCCCAAGTA-3’
1、PCR鉴定(PCR即聚合酶链式反应，是常用的快速扩增基因的方法)
(1)16S rRNA序列测定
取上述菌株接种于培养基A上，37℃、厌氧培养48h。取单一菌接种于液体培养基中，37℃、厌氧培养48h。DNA提取试剂盒提取细菌DNA(天根生化科技(北京)有限公司，货号：DP302-02)，作为PCR模板DNA。
16S rRNA基因序列的扩增：引物对1扩增片段大小约为531bp；引物对2扩增片段大小为518bp；引物对3扩增片段大小约为970bp。
采用20μL PCR反应体系：Taq酶10μL、模板DNA 2μL、正向反向引物各1μL、无菌去离子水6μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性30s、55℃退火30s、72℃延伸45s、30个循环、72℃延伸10min。
PCR产物在2％的琼脂糖凝胶进行电泳，电泳条件为100V、15min。
PCR产物凝胶电泳结果如图4所示，其中1、2泳道分别为引物对1、引物对2扩增产物；4、5泳道分别为引物对1、引物对2扩增产物(重复PCR的结果)；3、6泳道为引物对3扩增产物；7泳道为DNA分子量标准物(DL1000 DNA marker)。分离菌株DNA采用引物对1进行PCR扩增后产物大小为531bp，采用引物对2进行PCR扩增后产物大小为518bp，采用引物对3进行PCR扩增后产物大小为970bp，符合预期，所分离菌株为脆弱拟杆菌。
将PCR产物进行核苷酸序列测定(由深圳华大基因科技有限公司进行测定)，测序结果在Genbank(美国国家生物技术信息中心建立的DNA序列数据库)上进行BLAST比对(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)，见表三。
结果表明分离到为一株脆弱拟杆菌。
表四为16S rRNA序列BLAST比对结果(部分)
表四
(2)PCR检测bft基因
将测序筛选到的菌株接种于培养基C中，37℃、厌氧培养48小时。取培养菌液2mL，用细菌DNA提取试剂盒提取DNA，作为PCR模板DNA。bft基因的扩增采用bft基因引物，扩增片段大小应为294bp。
采用20μL PCR反应体系：Taq酶10μL、模板DNA 2μL、上下引物各1μL、无菌去离子水6μL。
PCR反应条件为：95℃预变性5min、95℃变性30s，55℃退火30s、72℃延伸45s，共30个循环，72℃延伸10min。PCR产物进行2％的琼脂糖凝胶电泳，电泳条件为100V、15min。
结果参见图5，其中1、2、3、4泳道为分离菌株ZY-312电泳结果；5、6、7为产肠毒素株脆弱拟杆菌电泳结果；8泳道为DL1000 DNA marker。4、5泳道为bft基因引物对扩增产物；1、7泳道为引物对2扩增产物；2、6为引物对1扩增产物；3泳道为引物对3扩增产物。
结果表明，ZY-312为一株脆弱拟杆菌，且不含有肠毒素bft基因，为一株新的无毒株。
2、全基因组测序分析鉴定
对脆弱拟杆菌ZY-312进行全基因组测序(深圳华大基因科技有限公司)，测序结果与已发表的菌株序列相互比对，利用treebest软件(该软件可在sourceforge网站上免费下载，下载链接为：http：//treesoft.svn.sourceforge.net/viewrc/treesoft/)采用邻接法构建NJ-tree或利用软件PhyML采用最大似然法构建最大似然树。系统发育树显示(参见图6)，脆弱拟杆菌ZY-312与脆弱拟杆菌标准株ATCC25285(即NCTC9343)在同一分支上，表明检脆弱拟杆菌ZY-312为一株新的脆弱拟杆菌，与ATCC25285同源。
对全基因组测序结果进行毒力基因分析，以验证其是否含产毒素bft基因。结果显示，脆弱拟杆菌ZY-312全基因组中不含bft基因，为一株不产肠毒素的新的脆弱拟杆菌。
实施例3
脆弱拟杆菌ZY-312对胃酸的耐受性
1、人工胃液配制(根据2010年《中国药典》人工胃液配制方法)
23.4mL浓HCl溶解于100mL纯化水中，即得稀盐酸。取8.2mL稀盐酸，加入400mL纯化水与5g胃蛋白酶(猪源，1∶15000)，定容到500mL。于37℃、磁力搅拌过夜，即得人工胃液。
2、菌体准备
收集菌液，离心，弃上清，生理盐水重悬后，再次离心，弃上清，菌体备用。
3、加入人工胃液测定活菌数
向菌体加入人工胃液，重悬，分别测定0、1、2、3h活菌数。
活菌计数采用10倍系列稀释法：取100μL菌液加入900μL布氏肉汤培养基中，逐步梯度稀释至合适浓度。每个平板点4个浓度梯度，每个梯度重复点样3次，每次点样20μL。37℃、厌氧培养48h，数菌落数(取菌落数为3-30的浓度梯度计数)。
活菌数(CFU/mL)＝三个点样菌落总和/3×50×稀释度，其中，CFU(Colony-Forming Units)，菌落形成单位，指单位体积中的活菌个数。
表五为不同菌株胃酸耐受实验结果(数据为活菌浓度log值，h为小时)
表五
益生菌必须进入人体的胃肠道并达到一定浓度才能发挥其功能。从口腔到肠道过程中，益生菌首先必须以活菌状态通过胃才有可能进入肠道。食物(尤其是流体)通过胃的时间一般为1-2h。根据饮食结构的不同，人体胃液的pH值波动很大，通常在pH3.0左右，空腹或食用酸性食品时可达pH1.5，食用碱性食品时可达pH 4-5，胃液的这种酸性环境可以激活胃蛋白酶原，从而杀死随食物进入胃内的细菌。益生菌如果要在人体内发挥益生作用，就必须具有一定的耐酸能力和耐胃蛋白酶的能力。
结果表明，与脆弱拟杆菌其他菌株相比，脆弱拟杆菌ZY-312在3h后活菌浓度仍然较高，而其他菌株的活菌浓度随时间降低很快，说明ZY-312对胃酸耐受性较好，具有很好的益生潜力和应用前景。
实施例4
脆弱拟杆菌ZY-312对胆盐耐受实验
1、实验材料
胰蛋白胨大豆肉汤(简称TSB，品牌：OXOID，货号：CM0129B)
胰蛋白胨大豆琼脂(简称TSA，品牌：OXOID，货号：CM0131B)
牛胆粉(生物工程上海(股份)有限公司，货号：ON1210)
胎牛血清(美国MP Biomedicals公司，货号：2916754)
2、菌株和试剂的准备
胆粉溶液：在TSB中加入牛胆粉，设置三个终浓度，分别为10g/L(1％牛胆粉)、20g/L(2％牛胆粉)和40g/L(4％牛胆粉)。灭菌后加入血清(终浓度50mL/L)待用。同时，以不加胆粉的TSB作为对照。
菌株培养与收集：菌株(ZY-312、Bd312、BF839、ATCC25285)于37℃、厌氧液体静态培养至对数生长后期(约14-16小时)，分装至离心管中，每管分装3ml菌液，室温、4000rpm离心5分钟。再用0.01M PBS洗菌1次(室温、4000rpm离心5分钟)，弃上清，沉淀待用。
3、人工胆粉培养基中培养
用上述胆粉溶液将洗涤后的细菌重悬，用含胆粉溶液调整初始菌液浓度为1×108CFU/mL。并在37℃、厌氧培养1、2、4小时，涂板计数活菌数目的变化，0小时细菌数目作为对照。实验平行做3次。
4、计算细菌耐受胆粉情况
将上述三个时间点涂板结果，与对应的0小时结果进行比较，即可得到菌株在人工胆粉溶液中作用不同时间后其耐受胆粉的结果，以均数±标准差及统计结果说明。
表六为SK08菌株耐胆粉实验结果(n＝3)
表六
结果如表四所示，0-4h观察，ZY-312在1％、2％、4％浓度胆粉中均可正常生长，随着胆粉浓度升高其活菌数越高，ZY-312活菌数显著高于其他菌株组。结果表明ZY-312耐受胆盐，并显著优于其他菌株。
胆盐是肝细胞分泌的胆汁酸与甘氨酸或牛磺酸结合形成的钠盐或钾盐，它是胆汁参与消化和吸收的主要成分。胆盐排到小肠后，大部分由小肠黏膜吸收入血，再入肝脏组成胆汁。人体小肠中胆盐的质量浓度在0.03～0.3g/100mL的范围波动。
对于活细胞来说，胆盐能破坏细胞膜，因此对胆盐的耐受性是评价益生菌的重要指标之一。益生菌可产生胆盐水解酶，此酶可将甘氨酸和牛磺酸结合的胆盐催化水解为氨基酸残基和游离胆盐。具有胆汁盐解离能力的菌株可以降低高胆固醇人群的血清胆固醇水平和防止正常人高胆固醇血症的发生。消化道中胆盐的浓度不是固定不变的，在进食消化的开始1h，其质量浓度为15～20g/L，之后其质量浓度降为3g/L左右。益生菌必须在通过胃肠过程中，可以在正常的胆盐浓度下存活，如要在小肠中定殖，必须耐受胆盐的抑制作用。因此，相对于脆弱拟杆菌的其他菌株，ZY-312具有更好的应用前景。
实施例5
脆弱拟杆菌ZY-312抗仔猪流行性腹泻的作用
主要试剂
DMEM(Dulbecco’s modified eagle medium)购自上海英潍捷基生物有限公司；RNA提取试剂盒购自OMEGA Bio-Tek公司；
dNTPs、rTaq酶、反转录酶、Marker DL2000等均购自宝生物工程(大连)有限公司。
主要仪器
Thermo 3111型CO2培养箱，美国热电公司(Thermo Electron Corporation)公司生产；
XWJ3-1型倒置显微镜，重庆光学仪器厂生产；
96孔细胞培养板，品牌：Nunclon，赛默飞世尔科技有限公司德国生产；
2720型PCR扩增仪，美国应用生物系统公司生产；
Tanon 4120型凝胶成像系统，购自广东誉为生物有限公司。
2日龄20头仔猪随机分成4组，每组5头。第一组为先发病后给药组，仔猪2日龄时人工进行猪流行性腹泻攻毒，于攻毒后第二天开始口服试验菌，2mL/次/天，连续给药7天；第二组为先给药后发病组，于仔猪出生后第二天开始口服试验菌，2mL/次，2次/天(早晚各1次)，连续给菌3天后人工进行流行性腹泻攻毒；第三组为发病对照组，仔猪2日龄时人工进行猪流行性腹泻攻毒，作为发病阳性对照；第四组为空白对照组，不做任何处理，每天人工喂乳，作为正常组对照。
试验开始后每天观察记录仔猪发病及死亡情况，收集仔猪粪便和呕吐物进行猪流行性腹泻病毒的PCR检测，对死亡仔猪进行解剖，观察肠管病变情况，收集小肠肠管用组织固定液进行固定；试验结束后对存活仔猪进行剖杀，观察肠管病变情况，并收集小肠肠管用组织固定液进行固定。
表七为脆弱拟杆菌ZY-312抗猪流行性腹泻的作用
表七
如表七所示，发病情况：第一组和第二组死亡率为0，分别有2、1头出现呕吐和腹泻，观察期结束均正常恢复，病毒检测为阴性。第三组死亡率为60％，有5头出现呕吐和腹泻，病毒检测为阳性。第四组，均正常。
剖检组织变化情况：第一组和第二组仔猪胃壁和小肠壁均正常，未见充血，肠系膜毛细血管正常；第三组肠系膜充血，肠系膜淋巴结充血肿大，肠壁变薄，有胃壁出血等症；第四组胃壁、肠系膜淋巴结及肠壁均正常，参见图7A-7D，图7A为第一组，胃壁和小肠壁均正常，未见有充血，肠系膜毛细血管正常；图7B为第二组，肠系膜未见有充血，胃壁正常，小肠壁薄；图7C为第三组，肠系膜充血，肠系膜淋巴结充血肿大，肠壁变薄，胃壁出血等症；图7D为第四组，胃壁、肠系膜淋巴结及肠壁均正常。
实验结果证实脆弱拟杆菌ZY-312可抵抗猪流行性腹泻病毒，预防和/或治疗仔猪流行性腹泻，修复仔猪肠壁、提高仔猪存活率。
实施例6
脆弱拟杆菌ZY-312在仔猪养殖中的应用
脆弱拟杆菌ZY-312发酵培养：将活化的ZY-312接种于胰酪蛋白胨大豆肉汤培养基中，在37℃下厌氧培养12h。脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的使用方法：将发酵菌体冻干、粉碎后的菌粉与基础日粮充分搅拌均匀待用，脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的添加量≥1×106CFU/g。
24日龄左右的断奶仔猪50头，根据体重、窝别、性别进行分组，共分5个组，分别为对照组、抗生素对照组、低剂量组、中剂量组、高剂量组，每组10头。抗生素对照组为基础日粮添加硫酸粘杆菌素，其他3个处理组为基础日粮添加脆弱拟杆菌ZY-312益生菌粉，分别为低剂量组(脆弱拟杆菌ZY-312为1×107CFU/g)，中剂量组(脆弱拟杆菌ZY-312为1×108CFU/g)，高剂量组(脆弱拟杆菌ZY-312为1×109CFU/g)。
试验期间，按组分别饲喂仔猪，观察其进食、饮水、活动等情况，记录腹泻等情况，详细记录每组的进食量。在试验开始0、30天早上对每窝猪进行空腹称重。
计算方法：日增重＝(试验末平均体重-起始平均体重)/试验天数；平均日采食量＝总耗料量/总饲养日；料肉比＝总耗料/总增重；腹泻率＝腹泻头数/ 总饲养日×100％。
表八为脆弱拟杆菌ZY-312对仔猪生长的影响
表八
表九为脆弱拟杆菌ZY-312对仔猪腹泻率的影响
表九
以上结果表明(参见表八及表九)，脆弱拟杆菌ZY-312可提高仔猪生长速度，降低料肉比，减少仔猪腹泻率。
实施例7
脆弱拟杆菌ZY-312在母猪养殖中的应用
脆弱拟杆菌ZY-312发酵培养：将活化的ZY-312接种于胰酪蛋白胨大豆肉汤培养基中，在37℃下厌氧培养12h。脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的使用方法：将发酵菌体冻干、粉碎后的菌粉与基础日粮充分搅拌均匀待用，脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的添加量≥1×106CFU/g。
选择年龄、体重、体况和胎次一致的妊娠55-60天的大约克夏母猪20头，随机分成2组，对照组和试验组，每组10头，对照组饲喂基础日粮，试验组饲喂基础日粮+脆弱拟杆菌ZY-312菌粉，饲料中脆弱拟杆菌ZY-312≥ 1×106CFU/g。指标测定：统计每头母猪的产仔数，产活仔数，初生重和初生窝重；用清底料槽的剩余料来统计饲料的实际用量。
试验动物管理：两组饲养管理条件相同，按日常管理的常规操作进行，一圈一头母猪，全部猪在同一栋猪舍，由同一人员管理，日喂3次，自由饮水，所有母猪以平均2.5Kg/日的饲喂量进行限制饲养。
(1)脆弱拟杆菌ZY-312对母猪产仔性能的影响
表十为母猪生产繁殖情况
表十
由试验结果可知，试验组窝平均活仔数比对照组提高7.6％，平均初生重比对照组提高了4.7％，平均初生窝重提高了5.5％，窝平均死仔数和窝平均弱仔数分别降低了67％和91％，均具有显著性差异。
(2)脆弱拟杆菌ZY-312对母猪饲料利用率的改善
试验时间60天，试验期间母猪对饲料消耗情况如下表。
表十一为试验期间母猪对饲料消耗情况
表十一
试验结果表明(参见表十及表十一)，整个试验期间，试验组头均耗料150Kg，对照组头均耗料158kg，试验组较对照组头均耗料量降低5％，饲养成本降低。
实施例8
脆弱拟杆菌ZY-312在鸡养殖中的应用
脆弱拟杆菌ZY-312发酵培养：将活化的ZY-312接种于胰酪蛋白胨大豆肉汤培养基中，在37℃下厌氧培养12h。脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的使用方法：将发酵菌体冻干、粉碎后的菌粉与基础日粮充分搅拌均匀待用。
将500只雏鸡，随机分为4个组，每组125只，1组为对照组，2组、3组、4组为试验组。2、3、4分别为低剂量组(脆弱拟杆菌ZY-312为1×107CFU/g)、中剂量组(脆弱拟杆菌ZY-312为1×108CFU/g)、高剂量组(脆弱拟杆菌ZY-312为1×109CFU/g)。试验组日粮和对照组日粮的基本组份相同，唯一不同的是试验组日粮中加有脆弱拟杆菌ZY-312菌粉。从试验开始到结束，试验组和对照组之间要严格隔开。对照组的管理按照正常的管理方式，日常所有药物及抗生素按照标准进行执行，所用消毒试剂也和以往相同；而试验组不使用一切抗生素药物。饲料方面要求育雏前1周(1-7日龄)采用原育雏料，即和对照组饲料一致，第2周开始饲料中开始添加脆弱拟杆菌ZY-312菌粉。
鸡舍内温、湿度控制温度每周上下浮动不超过5℃，每天上下浮动不超过2℃。脆弱拟杆菌ZY-312菌粉对雏鸡成活率、出栏重、料肉比及出栏数等的影响见表十二。
表十二为脆弱拟杆菌ZY-312在养鸡中的应用
表十二
表十二结果表明，与对照组相比，试验组成活率、出栏重、料肉比差异显著，其中成活率极显著高于对照组。
本发明的脆弱拟杆菌ZY-312在预防和/或治疗动物胃肠道疾病中的应用，既可用于防治动物肠道疾病，提高动物免疫力、抗病力，降低动物患病率，提 高动物饲料转化率，增加动物体重，促进其生长发育及生产性能，提高肉、蛋、奶等产品品质，也可以消除抗生素药物残留，净化厩舍环境，保护生态环境。该菌安全可靠，在畜牧业领域有很好的发展前景。
当然，本发明还可有其它多种实施例，在不背离本发明精神及其实质的情况下，熟悉本领域的技术人员当可根据本发明作出各种相应的改变和变形，但这些相应的改变和变形都应属于本发明所附的权利要求的保护范围。

Claims (11)

1.脆弱拟杆菌在动物养殖中的应用。
2.如权利要求1所述的脆弱拟杆菌应用，其特征在于，所述脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌ZY-312，保藏号为CGMCC No.10685。
3.脆弱拟杆菌在预防和/或治疗动物胃肠道疾病中的应用，所述脆弱拟杆菌为脆弱拟杆菌ZY-312，保藏号为CGMCC No.10685。
4.一种用于预防和/或治疗动物胃肠道疾病的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物包括药学有效剂量的脆弱拟杆菌ZY-312。
5.一种用于预防和/或治疗动物胃肠道疾病的饲料添加剂，其特征在于，所述饲料添加剂包括有效量的脆弱拟杆菌ZY-312。
6.如权利要求4所述的饲料添加剂，其特征在于，所述有效量为能有效维持健康的肠微生物菌群的剂量，所述脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的添加量≥1×106CFU/g。
7.如权利要求4所述的饲料添加剂，其特征在于，所述有效量为能有效减少动物中病原性细菌及病毒的生长的剂量，所述脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的添加量≥1×106CFU/g。
8.如权利要求4所述的饲料添加剂，其特征在于，所述有效量为能有效提高动物饲料利用效率或动物存活率的剂量，所述脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的添加量≥1×106CFU/g。
9.如权利要求4所述的饲料添加剂，其特征在于，所述有效量为能有效增加动物重量的剂量，所述脆弱拟杆菌ZY-312在饲料中的添加量≥1×106CFU/g。
10.如权利要求4-9中任意一项所述的饲料添加剂，其特征在于，所述动物为猪或家禽。
11.如权利要求10所述的饲料添加剂，其特征在于，所述猪为仔猪或母猪，所述家禽为鸡。
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