CN101638627B

CN101638627B - 一株枯草芽孢杆菌及其在生物饲料添加剂中的应用

Info

Publication number: CN101638627B
Application number: CN2009100348432A
Authority: CN
Inventors: 刘小勇; 王有智; 惠飞; 王大为; 魏晶; 惠大帅; 肖淑红; 翁万山
Original assignee: 惠飞
Priority date: 2009-09-10
Filing date: 2009-09-10
Publication date: 2011-01-26
Anticipated expiration: 2029-09-10
Also published as: CN101638627A

Abstract

本发明属于饲料添加剂领域，公开了一株枯草芽孢杆菌及其在生物饲料添加剂中的应用。本发明所涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HF-A1，于2009年8月19日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3241。枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)是从采自健康乳猪的胃肠道靠近粘膜处的内容物中筛选得到的。该菌株抗消化道生理环境和抗加工能力强、抑菌除臭性能优良，安全可靠。由该菌株制备的生物饲料添加剂能抑制消化道内有害微生物，替代抗生素及化学药品，显著增强家畜或家禽的免疫力，促进动物的健康生长，降低粪便的臭味，净化养殖环境。

Description

一株枯草芽孢杆菌及其在生物饲料添加剂中的应用

技术领域

本发明属于饲料添加剂领域，涉及一株枯草芽孢杆菌及其在生物饲料添加剂中的应用。

背景技术

近年来，我国的畜牧业生产得到了飞速的发展，规模化、集约化畜禽饲养场呈急剧上升趋势，但同时也存在一些问题，如畜禽粪便中产生的恶臭味污染环境、抗生素的残留、养殖成本高等，它们严重制约了养殖业的进一步发展。为了解决养殖中存在的这些问题，急需开发出一种新型的饲料添加剂，它既能大大降低动物粪便臭味，又能提高饲料转化率，提高动物的免疫力和抗病力，促进其健康快速生长。根据微生态理论，乳酸菌等有益菌的活菌制剂进入肠道后能促进肠道有益菌生长，抑制有害菌，促进肠道微生态平衡，提高畜禽免疫力和抗病力，提高饲料转化率，降低粪便臭味。

关于微生物饲料添加剂的定义较多，可以概括为狭义和广义的两种定义。广义上认为：微生物饲料添加剂包括益生素和微生物生长促进剂。益生素又称生菌剂，是由活体微生物制成的生物活性制剂，它可通过动物消化道生物的竞争性排斥作用，抑制有害菌生长，形成优势菌群或者通过增强非特异性免疫功能来预防疾病，从而促进动物生长和提高饲料转化率。微生物生长促进剂是指摄入动物体内参与肠内微生物平衡，具有直接提高动物对饲料的利用率及促进动物生长作用的活性微生物培养物。而较为狭义的微生物饲料添加剂则仅仅将范围局限在可以直接饲喂的活菌制剂上。目前，一些饲料企业都在积极寻找和研究新的绿色环保的微生物饲料添加剂，但市场上的此类添加剂存在抗消化道生理环境能力和抗饲料加工能力差、抑菌效果不够显著、安全性不可靠等缺陷。

发明内容

本发明的目的是克服现有技术存在的上述缺陷，提供一株抗消化道生理环境和抗加工能力强、抑菌除臭性能优良，安全可靠的枯草芽胞杆菌(Bacillus subtilis)HF-A2。

本发明的另一目的是提供该枯草芽孢杆菌在制备生物饲料添加剂中的应用。

本发明的目的可以通过以下措施达到：

本发明所涉及的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HF-A2是从采自健康乳猪的胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠靠近粘膜处的内容物中经分离纯化、产酶能力筛选、抗消化道生理环境筛选、抑菌效果筛选、抗饲料加工试验筛选得到的。按《伯杰细菌鉴定手册》第八版鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，将其命名为枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)HF-A2，送交中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCCNo.3241，保藏日期为2009年8月19日。

枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)具有以下微生物学特征：

1、形态学特征

细胞呈杆状，0.9～1.0×1.7～1.8微米，着色均匀，无荚膜，鞭毛侧生，运动，革兰氏染色阳性。芽孢0.5～0.7×0.8～1.3微米，椭圆到柱状，中生到近中生，无伴胞晶体，芽孢囊不明显膨大。菌落为圆形，不透明，不闪光，随着培养时间增长，菌落变厚变干，边缘不整齐，菌落上有褶皱状凸起，污白色或微带黄色。

2、常规生理生化性质如下：

枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)的发酵工艺如下：

(1)制作摇瓶种子：从菌种保藏斜面上挑取单菌落，接种到种子培养基中，于28～37℃，200rpm培养24～30h，得到枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)摇瓶种子液。

所述的种子培养基为按下述重量体积比(单位：g/L)配制的混合液：蔗糖：20，硫酸铵：5，麸皮：50，柠檬酸三钠：2.5，K₂HPO₄3H₂O：0.3，MgSO₄·7H₂O：0.5，FeSO₄.7H₂O：0.05，pH7.2～7.4，115℃灭菌30min，备用。

(2)扩大培养：摇瓶种子液以10％的接种量接种于装有发酵培养基的发酵罐中，装液量为60％，于30～35℃，搅拌速度180～220rpm，通气量为1～3V/V.min，培养24～28h放罐；此时所获得的菌体数量约为6×10⁹cfu/ml，通过显微镜观察，有大量芽胞形成。

发酵培养基为按下述重量体积比(单位：g/L)配制的混合液：蔗糖：35，硫酸铵：6.5，麸皮：80，柠檬酸三钠：2.0，K₂HPO₄3H₂O：0.3，MgSO₄·7H₂O：0.5，MnSO₄：1.5，FeSO₄·7H₂O：0.05，CuSO₄：0.4，消泡剂：0.8，pH7.2～7.4，经121℃灭菌30～45min，冷却到30～35℃。

枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)在制备生物饲料添加剂中的应用。

所述的生物饲料添加剂可以仅含有枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)，也可以含有包括枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)在内的多种益生菌，根据需要还可以加入淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶中的任意一种或多种。

一种生物饲料添加剂，该生物饲料添加剂主要含有枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCCNo.3241)、乳酸菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

上述生物饲料添加剂的制备可采用本领域的常规制备方法，先使用适宜各菌株生长的培养基将保藏的菌种复壮，培养种子液，然后按照枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCCNo.3241)∶乳酸菌∶酿酒酵母＝4～6∶1～3∶1～2(体积比)的比例将各菌的种子液接种到固体培养基中混合发酵培养，最终60℃以下烘干、粉碎，即得粉剂型生物饲料添加剂；还可根据需要加入一定量的淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等；亦可将各菌株的种子液单独进行液体发酵后，然后按照总菌数比为枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)∶乳酸菌∶酿酒酵母＝3～5∶2～3∶2～3的比例混合得液体型生物饲料添加剂。

当单独使用枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)制备生物饲料添加剂时，可将HF-A2(CGMCC No.3241)经种子培养、液体或固体发酵后60℃以下烘干添加到饲料中即可。也可根据需要选择加入淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶等。

本发明的有益效果：

本发明所提供的枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)能够抵抗较强的酸性环境和较高浓度的胆盐，可保证有足够的活菌能顺利通过胃、十二指肠到达动物小肠发挥作用。且所选菌株对病原菌、尤其是革兰氏阴性菌有较强的抑制作用，对动物安全无毒，是一株优良的益生素菌株。

枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)及生物饲料添加剂中所涉及的菌种均属经多年应用实践证明的安全无公害的微生物种类，动物食用后无耐受性。在饲料中添加枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)及由其制备的生物饲料添加剂，可以替代抗生素及化学药品，抑制消化道内有害微生物，有效防止腹泻。并且无配伍禁忌，无停药期，肉蛋产品中无药物残留，符合绿色产品及出口的要求。

枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)及由其制备的生物饲料添加剂能显著增强家畜或家禽的免疫力，分泌消化酶，代谢生成维生素，促进饲料消化吸收，促进动物的健康生长，提高增重率和饲料转化率，提高蛋鸡的产蛋率、日产蛋量以及鸡蛋质量，降低死淘率，大幅降低料肉比和料蛋比。枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)及由其制备的生物饲料添加剂还能促进肠道微生态平衡，降低粪便的臭味，降低NH3等有害气体的排放，在净化养殖环境方面的作用突出。

涉及的生物材料样品的保藏

枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HF-A2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区大屯路中国科学院微生物研究所，保藏号为CGMCCNo.3241，保藏日期为2009年8月19日。

具体实施方式

实施例1菌种初筛及分离纯化

屠宰健康乳猪，分别取胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠靠近粘膜处内容物一定量于无菌水中，，搅拌并作10倍稀释，接种于BPY液体培养基中，在35℃恒温摇床中200rpm培养30小时。

将上述菌液在沸水中煮沸10min，再在BPY培养基平板上进行划线培养，从中挑取各个形态不同的菌落再划线培养和分离，镜检是否有芽胞，是否为单菌落。将分离到的40株单菌落且是芽胞菌分别接种BPY培养基试管斜面35℃培养30h，4℃把冰箱保存待用。

BPY培养基组成如下：牛肉膏0.5g，蛋白胨1g，氯化钠0.4g，葡萄糖0.5g，用自来水定容至100ml，固体培养基再加琼脂2g。

实施例2产酶能力筛选

采用酪素水解平板对实施例1筛出的40株芽胞菌进行高产蛋白酶优良菌株的筛选。观察40株芽孢菌蛋白酶透明圈大小，选择透明圈大(即产蛋白酶活性较高)的5株芽胞菌进入下一步筛选。

酪素平板培养基：牛肉膏8g，酵母粉2g，蛋白胨5g，氯化钠2g，干酪素4g，琼脂20g，蒸馏水1000ml，pH7.2～7.4。

实施例3抗消化道生理环境优良菌株的筛选

将实施例2筛出的5株菌种进性抗消化道生理环境优良菌株的筛选。

(1)保藏斜面菌种接种于装有10mlBPY液体培养基的试管中，35℃静置培养30h，按10％接种量分别接种于9.0ml pH值2.0、3.0、4.0的人工模拟胃液中，0h计数作对照，2h、6h取样用PBS缓冲液(PH7.0，10mmol/L)按10倍系列稀释，进行平板活菌技术，计算存活率，筛选存活率在3％以上的优良菌种。

人工模拟胃液的配制：量取浓盐酸16.4ml，加蒸馏水至1000ml，做基础人工胃液，用盐酸或氢氧化钠调pH值2.0、3.0、4.0，各取10ml(9ml)分装于试管中，100℃蒸汽灭菌15min，在无菌条件下，每10ml液体中加入0.100g胃蛋白酶。

(2)保藏斜面接种装有10ml液体培养基的试管中，35℃静置培养30h，按10％接种量分别接种于9.0ml 0.03％、0.1％、0.2％、0.3％不同浓度的猪胆酸盐溶液中，0h计数作对照，2h、6h取样用生理盐水按10倍系列稀释，进行平板活菌技术，计算存活率，筛选存活率在3％以上的优良菌种。

人工模拟肠液的配制：0.85％生理盐水各9ml，分装于试管中，121℃蒸汽灭菌30min，在无菌条件下，制成0.03％、0.1％、0.2％、0.3％不同浓度的猪胆酸盐溶液。

结果筛选出抗消化道生理环境优良菌株有三株。

实施例4抑菌效果筛选

采用双碟法测定菌株对常见病菌大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌的抑菌效果，筛选抑菌圈在1cm以上的抑菌效果良好的优良菌株，双碟法具体步骤如下：

(1)指示菌菌液的制备：分别将在装有10ml营养肉汤培养基的试管中活化三株致病菌：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、鸡白痢沙门氏菌，37℃恒温培养24h。

(2)双层平板的制备：取直径90mm的平板，注入灭菌的营养琼脂20ml，水平放置使之凝固，作为底层，另取营养琼脂(冷至50℃左右)与37℃培养24h的指示菌液适量混匀，吸取10ml浇在底层培养基上，水平放置使之凝固，作为菌层。

(3)加样品：用无菌镊子夹取已灭菌的牛津杯，打开皿盖，放在培养基上。在牛津杯中加满相同量的菌种发酵上清液(约200μl)，每个样品3个重复。将加完样的双碟小心放入37℃恒温箱内，培养18h后，取出测量抑菌圈大小。结果表明：其中2株具有较好的抑菌作用。具体结果见表1。

表1两株入选菌株对致病菌的抑制效果

实施例5耐高温试验

取实施例4中筛选出的芽胞菌HF-A2的24小时培养液5ml于试管中，分别置于60℃、70℃处理，分别于热处理前、处理40min和70min时取样测定活菌数，计算存活率。结果显示枯草芽孢杆菌HF-A2经60℃处理40min，存活率为82.78％，经60℃处理70min，存活率为60.35％；经70℃处理40min，存活率为74.06％，经70℃处理70min，存活率为61.90％。说明HF-A2具有良好的耐高温能力。

实施例6抗饲料加工性实验

将实施例4中的芽胞菌制成菌粉添加到5％预混料和全价料中进行治理处理，检测存活率，结果表明其存活率为95.78％。

实施例7安全性试验

参照《药品微生物检验手册》中对芽孢杆菌制剂的安全性检测标准(马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册[M].北京：科学出版社，2000：345-349)，选择纯系小白鼠作为试验动物，采用经口灌胃和腹腔注射途径对芽孢杆菌HF-A2进行安全性试验。分别设灌胃组、腹腔注射组和空白对照组，各组随机选。取健康昆明种小鼠20只，雌雄各半。灌胃组：每只灌胃0.5ml/次，调整菌液活菌数约4×10⁹cfu/ml，连续3d，观察7d，称重；腹腔注射组：每只腹腔注射菌液0.3ml，调整菌液活菌数约3×109cfu/ml，观察10d，称重；空白对照组：灌胃或腹腔注射等量的生理盐水。

(1)小鼠一般体征和体重：试验期间，对照组、灌胃组、腹腔注射组的动物一般体征、行为、活动、皮毛、色泽未见明显异常；饮食、粪便均未见明显异常；各组体重持续增长，与对照组比较无显著性差异。试验前各处理体重差异性不显著(P≥0.05)，分别为20.84、19.70、20.34、19.64g；试验后小白鼠健康存活；体重分别增加5.06、5.04、5.38、4.80g，与空白对照相比体重差异性不显著(P≥0.05)(表2)。

(2)菌株对小鼠脏器系数的影响称重后，处死小鼠解剖检查心、肝、脾、肺、肾、脑、胃、肠等全身各脏器，肉眼观察未发现明显异常。取肝、肾、脾等靶脏器，用滤纸吸去血液称重，求脏器系数，结果见表3。各剂量组的脏器系数与对照组比较均差异不显著(P≥0.05)。

表2灌胃和腹腔注射处理前后体重差异性比较

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平有差异。

表3不同处理小鼠脏器系数比较

注：同列数据后不同小写字母表示在0.05水平有差异。

脏器系数的差异性可反映对脏器的毒性综合情况，也是寻找毒性作用靶器官的重要线索。体重是动物试验中重要的非特异性观察指标，可综合地反映动物机体中毒效应。试验结果显示：全部小白鼠均健康存活，体重显著增加，脏器系数和病理组织学与对照组比较无显著差异，未见任何毒性反应，表明该株芽胞菌HF-A2对小鼠安全无毒，，使小鼠体重增加，，适于用作生物饲料添加剂。

筛选得到的这株芽胞菌HF-A2依照《伯杰细菌鉴定手册》第八版鉴定为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，送交中国微生物保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏号为CGMCC No.3241，保藏日期为2009年8月19日。

由实施例2～实施例7的结果可看出枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)是一株具有优良的抗消化道生理环境性、抑菌效果好、耐高温、抗加工型性能强、安全性高的菌株。

实施例8一种生物饲料添加剂的制备

1、种子液培养

1)枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)种子液培养

将保藏的枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)斜面种子采用划线接种的方法在BPY固体培养基上划线接种，于35℃培养24h，使枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)复壮，并形成单菌落。挑取单菌落，接种到种子培养基中，于35℃，200rpm培养30h，得到枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)摇瓶种子液。

所使用的种子培养基组成为：蔗糖：20，硫酸铵：5，麸皮：50，柠檬酸三钠：2.5，K₂HPO₄·3H₂O：0.3，MgSO₄·7H₂O：0.5，FeSO₄·7H₂O：0.05，pH7.2～7.4，115℃灭菌15min。

2)保加利亚乳杆菌种子液培养

将保藏的保加利亚乳杆菌斜面种子采用划线接种的方法在MRS固体培养基上划线接种，采用常规方法于33℃培养24h，使保加利亚乳杆菌复壮，并形成单菌落。挑取单菌落，接种到种子培养基中，采用常规方法于35℃，培养22h，得到保加利亚乳杆菌摇瓶种子液。

MRS固体培养基：胰蛋白胨1g，牛肉膏1g，酵母膏0.5g，柠檬酸铵0.2g，葡萄糖2g，KH₂PO₄0.2g，乙酸钠0.5g，吐温-800.1g，硫酸镁0.05g，硫酸锰0.02g，琼脂2g，水100ml，pH6～6.5，115℃高压灭菌15min。

保加利亚乳杆菌种子培养基：麦芽汁10g，大豆蛋白胨0.5g，酵母膏0.5g，牛肉膏1g，K₂HPO₄0.2g，水100ml，115℃高压灭菌15min。

3)酿酒酵母种子液培养

将保藏的酿酒酵母斜面种子采用划线接种的方法在YPDA固体培养基上划线接种，采用常规方法于28℃培养24h，使酿酒酵母复壮，并形成单菌落。挑取单菌落，接种到YPDA培养基中，采用常规方法于35℃，培养32h，得到酿酒酵母摇瓶种子液。

YPDA培养基(完全培养基)：20g蛋白胨、10g酵母抽提物、2g葡萄糖，适量双蒸水溶解。15ml 0.2％腺嘌呤溶液，定容到1L，120℃高压灭菌15min。固体培养基再加入2％的琼脂。

2、固体发酵

以麸皮为主要原料，添加10％糖蜜和10％玉米浆作为固体发酵培养基，培养基灭菌冷却后，以5∶2∶1(体积比)比的比例接入枯草芽孢杆菌HF-A2、保加利亚乳杆菌、酿酒酵母的成熟液体种子，接种量为固体培养基的10％，30℃厌氧发酵2d，发酵完成后60℃烘干，所得成品为褐色粉未，有酸香味，活菌数达7.8×10⁹cfu/g以上。

实施例9养殖试验

为检验本产品的应用效果，在徐州大鹏牧业有限公司养殖场进行养殖试验，采用的微生物饲料添加剂为按实施例8所述方法制备的微生物饲料添加剂和枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)发酵液。试验期为30天，从试验开始到猪出栏时为止。

1、分组

选择45头65Kg左右的育肥猪，分成两组，每组15头，各组猪最初体重相差最多不超过2.0Kg，两组猪的平均体重相差不过2.0Kg。

2、方法设计

三组猪第一组为对照组，第二组、第三组分别为试验组1和试验组2，分别以2％的微生物饲料添加剂和枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)发酵液替代对照组中相应的麸皮，对照组的基础日粮组成见表4。

表4.对照组的基础日粮组成

试验开始前对猪进行驱虫和疫苗注射，试验期30天。饲料干喂，自由采食，自由饮水。观察饲喂前后猪的皮毛颜色和长短的变化情况。

试验开始前后按栏群体空腹称重，试验结束后按栏结算饲料，用以分析其对日增重、料肉比等指标的影响。试验开始和结束时分别取粪便观察其颜色形状，嗅闻其气味，用pH试纸测pH，用H₂S、NH₃电极测量试验前后粪便H₂S、NH₃含量，方法为取定量新鲜粪便放入塑料袋，把电极放入袋内，扎紧袋口，15min后读数。

取定量新鲜粪便分别稀释涂布EMB平板和MRS平板，EMB平板好氧35℃培养48h，对大肠杆菌计数。

MRS平板厌氧37℃培养48h对乳酸菌计数，分析试验前后粪便菌群变化，以分析有益菌在肠道的作用情况。

3、实验结果

1)毛色及毛长度、皮色

饲喂半个月后，两试验组猪的毛变得短而亮，皮色为非常健康的白里透红，而对照组猪的毛仍为长而杂，皮色为白色，这说明本添加剂能增强猪的免疫力，促进猪的健康生长。

2)增重情况、采食量与料肉比

试验全期育肥猪的增重情况及采食量与料肉比见表5。

表5.试验全期育肥猪的增重情况及采食量与料肉比

由表5可看出，试验组1和试验组2育肥猪的日增重比对照组有较大的增加，采食量和料肉比有明显的下降，这说明本生物饲料添加剂和枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCCNo.3241)均能够较大程度提高饲料的转化率，具有显著的促生长作用，其中以生物饲料添加剂效果更好。

3)粪便颜色、气味、pH和H₂S、NH₃含量变化情况(见表6)

表6粪便颜色、气味、pH和H₂S、NH₃含量变化情况

由结果可知生物饲料添加剂和枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)均能显著降低粪便中NH₃的产生，枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)的除臭效果更好；试验组粪便的H₂S含量降低不多，主要可能是由于粪便中的H₂S含量本来就较低，很难再大幅降低。

4)粪便菌群变化(见表7)

表7粪便菌群变化情况

从上表可看出，两试验组猪服用本添加剂后，猪粪便的菌群发生了明显变化，试验量组猪大肠杆菌的数量比对照组明显降低，乳酸菌的数量有较大的增加。这说明进入肠道的生物饲料添加剂和枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)能抑制大肠杆菌和其它有害菌的生长，促进肠道微生态平衡，也能促进乳酸菌等有益菌的生长。

实施例10

1、分组

选择75头65Kg左右的育肥猪，分成五组，每组15头，各组猪最初体重相差最多不超过2.0Kg，两组猪的平均体重相差不过2.0Kg。

2、方法设计

第一组为对照组，第二组～第五组分别为试验组1～试验组4，分别以2％的南昌利丰生物技术有限公司生产的微生物饲料添加剂，山东亿安生物工程有限公司生产的亿安奇乐微生态活菌制剂，湘祁生物科技公司生产的康泰丰微生物饲料添加剂以及按实施例8方法所生产的微生物饲料添加剂替代对照组中相应的麸皮，对照组的基础日粮组成见表4。

表4.对照组的基础日粮组成

3、实验结果

1)毛色及毛长度、皮色

饲喂半个月后，四组试验组猪的毛变得短而亮，皮色为非常健康的白里透红，而对照组猪的毛仍为长而杂，皮色为白色，这说明四种添加剂均能增强猪的免疫力，促进猪的健康生长。

2)增重情况、采食量与料肉比

试验全期育肥猪的增重情况及采食量与料肉比见表5。

表5.试验全期育肥猪的增重情况及采食量与料肉比

由表5可看出，试验组1～试验组4育肥猪的日增重比对照组有较大的增加，采食量和料肉比有明显的下降，其中以试验组4即本发明提供的生物饲料添加剂效果最好。

3)粪便颜色、气味、pH和H₂S、NH₃含量变化情况(见表6)

表6粪便颜色、气味、pH和H₂S、NH₃含量变化情况

由结果可知试验组1～试验组4的生物饲料添加剂均能显著降低粪便中NH₃的产生，以试验组4除臭效果更好，并能显著减轻粪便臭味；试验组1～试验组4粪便的H₂S含量降低不多，主要可能是由于粪便中的H₂S含量本来就较低，很难再大幅降低。

实施例11

选取徐州大鹏牧业有限公司养殖场同一栏舍内150日龄健康蛋鸡270只，鸡只精神状态良好、产蛋率无显著差异，随机分成三组，每组90羽，第一组饲喂原来日粮为对照组，第二组、第三组分别为试验组1和试验组2，分别以0.2％的微生物饲料添加剂(实施例8方法所制)和枯草芽孢杆菌HF-A2(CGMCC No.3241)发酵液替代对照组中相应的麸皮。试验期为25天。

对照组的日粮配方为玉米：62.3％，麦麸：7％，鱼粉：8％，贝粉：8％；骨粉：2％；豆粉：12.2％，盐：0.3％，预混料4.0～5.0％。其达成的营养指标为：代谢能，2650kcal/kg；粗蛋白16.50％；钙，3.95％；有效磷0.34％。

表8.试验组与对照组25天产蛋情况统计

添加两试验组蛋壳质量得以改善，蛋壳颜色、硬度均好于对照组、破损率大大降低，蛋黄颜色比对照组变红，鸡蛋蛋清粘稠度加大及延长保鲜期，十分有利于长途贮运。并且试验期间，观察到两试验组鸡只粪便，鸡粪便气味明显低于对照组，苍蝇数减少约85％～98％，环境状况明显改善，减少了鸡场的清洁成本；同时，由于采食量的下降，大大降低了饲养成本，经济效益提高了25％以上。

Claims

1.一株枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HF-A2，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.3241。

2.权利要求1所述的枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HF-A2在制备生物饲料添加剂中的应用。

3.根据权利要求2所述的应用，其特征在于该生物饲料添加剂主要含有枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)HF-A2、乳酸菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

4.根据权利要求3所述的应用，其特征在于所述的乳酸菌为嗜热链球菌(Streptococcusthermephilus)或保加利亚乳杆菌(Lactobacillus bulgaricus)中的任意一种或两种。