CN103320351B - 一种格氏乳球菌及其由该菌制备的生物饲料添加剂 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，涉及一株格氏乳球菌及由该菌制造的饲料添加剂。该饲料添加剂是由格氏乳球菌（Lactococcusgarvieae）SYP-B-301经发酵罐发酵培养获得的液态菌剂，再添加适当营养物质而制成的固态菌剂。该发明适用范围广泛：如养猪，养鸡，养牛等畜牧家禽养殖。具有诸多功能，动物食用后可提高免疫力，降低动物腹泻率和死亡率，可减少抗生素类药物的使用，消除药物残留，明显提高生产效率，缩短饲养周期，有效的节省饲料，从而提高养殖户的收入。
Description
技术领域:
本发明涉及微生物技术领域，涉及一株格氏乳球菌及其由该菌制备的饲料添加剂。
背景技术:
国外益生菌制剂最早见于日本，美国从20世纪70年代开始使用饲用微生物，我国益生菌的研究起始于20世纪80年代，相对起步较晚，但发展较快，目前主要以研究乳酸菌、芽胞杆菌为主。近年来，益生菌制剂应用于家禽养殖中作用显著，逐步受到广大养殖者的肯定。
近些年来，使用抗生素作为饲料添加剂所带来的弊端越来越明显，它已不能有效防治动物疾病，且造成的药物残留给动物和人类均带来了很大的影响。随着抗生素陆续被许多国家明令禁止使用，益生菌作为抗生素的替代品得到了迅速的发展，无论是菌种开发还是产品研发方面都取得了长足的进步，并且在实际应用中表现出了良好的效果，其诸多对动物有益的生物学功能也越来越被人们所认可。
目前生态菌剂分为单一菌剂和复合菌剂，单一菌剂是只由某一种微生物构成的制剂，复合菌剂是由二种或二种以上微生物构成的制剂。复合菌剂明显的不足之处就是价格较高，成分过于复杂，添加量也较高，虽有效果但不能给养户带来丰富的经济收入。因此开发单一菌剂成分简单，且可降低成本，从而提高养户的利益。
发明内容：
本发明的目的是提供一种活菌及其由该菌制备成的菌剂，并将其应用于家禽家畜的饲料添加剂。菌剂所采用的菌种合理，菌种活力强，采用现代化发酵罐生产，降低生产成本和使用成本，应用广泛，效果显著。
本发明的菌剂（益生灵）属于单一菌剂，与抗生素相比效果相同，有时甚至更好，无任何毒副作用，不在体内残留，不产生耐药性，不但可显著的降低料重比，提高动物生产性能，还能增强动物免疫力，降低动物死淘率，减少腹泻率，还可以净化畜舍环境，本发明具有很高的社会效益，经济效益和生态效益。本发明的益生灵菌剂所表现出来的优良效果远超过其它单一菌剂和复合菌剂，可以进行广泛的推广使用。
本发明为实现上述目的所采用的技术方案是：由格氏乳球菌SYP-B-301(保藏编号为CGMCC No.7188）为出发菌种，进行种子液的制备、发酵液的制备、固体饲料添加剂的制备。所述含有格氏乳球菌SYP-B-301的固体饲料添加剂中每克含活菌的菌数为1.4×l010个-9.5×010个/克。
本发明发酵液的制法，具体工艺：
格氏乳球菌SYP-B-301的培养基：3-5%葡萄糖、0.01-0.12%酵母浸粉、0.02-0.04%蛋白胨、琼脂18g，蒸馏水1L，pH3.0-4.5。
在上述斜面培养基上接菌，于25-34℃培养20h，得到斜面培养物；将培养好新鲜斜面培养物接到上述液体培养基中，25-34℃培养20h，得到种子液,；然后将培养20h的种子液按1-10%浓度接种到发酵罐中。
在发酵罐内放入纯净水，加入3-5%葡萄糖、0.01-0.12%酵母浸粉以及0.02-0.04%蛋白胨，高温加热后维持100-120℃，保温15-30分钟，然后降温至室温，按1-10%浓度接种，20-40℃搅拌培养10-36小时，pH降至3.0-4.5之间，每毫升含活格式乳球菌菌数2×108-4×108个。室温下出罐。
向发酵菌体中按照适当比例混合一定的附形物，制备固体饲料添加剂。具体制备方法：所得发酵液用高速离心机离心，离心条件：4000-10000rpm，4℃,15min，离心后弃上清液，得菌泥。用6%-10%的脱脂奶粉，1.0%-1.2%海藻糖和1%-5%的乳糖，搅拌菌泥混匀，先置于-80℃超低温冰箱冷冻，再置于真空冷冻干燥机干燥20h，取出粉碎，过60目筛。本发明固态格氏乳球菌菌剂中活菌总数为1.4×l010-9.5×010个/克。
用此种方法制备的饲料添加剂具有诸多功能：既能促进禽畜肠道中乳酸菌的增值，以便形成乳酸菌优势菌群，维持肠道的微生态平衡，有效抑制病原菌的繁殖，又能促进畜禽的生长，降低饲料的消耗；稳定性好，无毒副作用，无残留，安全无污染。本发明适用范围广泛，适用于鸡，猪，牛等家禽家畜的饲养。
本发明的格氏乳球菌命名为SYP-B-301，菌株已送至中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏。保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。保藏日期：2013年1月21日，保藏编号为CGMCC No.7188。此菌落表面光滑，透明，呈规则圆形，革兰染色为红色，经形态鉴定、保守基因鉴定为格氏乳球菌（Lactococcus garvieae）。
附图说明：
附图1为依据16s r DNA序列构建的菌株SYP-B-301系统进化。
具体实施方式:
下面结合具体实施例对本发明作进一步详细说明，但本发明并不局限于具体实施例。
实施例1：本发明所述菌株SYP-B-301的各项培养特征
格氏乳球菌SYP-B-301菌株在所述培养基上于25-34℃培养24h后，观察菌落形态，平板上呈透明圆菌落，表面光滑，菌落直径1-2mm。该菌株经革兰氏染色后为红色，在显微镜下镜检发现该菌呈规则球形，直径0.5-0.8um，无芽胞、鞭毛、荚膜，不运动，单个、成对或短链。
提取菌株SPY-B-301菌株的基因组DNA，以Primer(S)：5’AGA GTT TGA TCCTGG CTC AG3’；和Primer(A)：5’AAG GAG GTG ATC CAG CCG CA3’为引物进行PCR，扩增菌株的16s rDNA基因。纯化后进行基因测序，并将所测序列与Genbank中的rDNA同源序列比对，选取15株较高同源性的菌株，利用软件Mega5构建菌种进化树。菌株SYP-B-301与Lactococcus garvieaeATCC49156T同源性最高（100%）。再结合形态学鉴定结果，该菌株被鉴定为格式乳球菌Lactococcus garvieae。参见图1。该菌株的各项生理生化指标与已发表同种类的菌种（Lactococcus garvieaeATCC49156T）生理生化指标相比，结果见表1。可见，与已知的Lactococcus garvieae相比，SYP-B-301在生理生化方面有多个指标是不同的，为Lactococcus garvieae的一个变种。
表1SYP-B-301与Lactococcus garvieaeATCC49156T的生理生化实验结果
实施例2:以小鼠作为模型动物,研究SYP-B-301饲料添加剂对小鼠生长性能的影响
实验动物：选18-22g的昆明雄性小鼠（大约是四周龄）20只，试验周期为15d。分对照组和实验组，每组均10只实验小鼠，重复两次实验。
从试验开始每天称重，以每个重复为单位，计算各组平均日增重，并准确记录采食量和剩料量，观察各组小鼠的精神状态，试验周期为15d，计算平均日增重,并准确记录采食量和剩料量，计算各组平均日采食量和饲料转化率，记录死亡率和腹泻率。实验结果见表2。
动物实验方案：
对照组：基础日粮
实验组：基础日粮+1.0%SYP-B-301饲料添加剂
平均日增重(ADG,averag daily gain)=总增重(g)/(试验天数×鼠只数)
平均日采食量(ADFI,average daily feed intake)=总采食量(g)/(试验天数×鼠只数)
饲料转化率(FCR,feed conversion ratio)=平均日采食量(g)/平均日增重(g)
死亡率(%)=死亡鼠只数/试验鼠只数×100%
腹泻率(%)=试验期腹泻鼠只数/(试验鼠只数×试验天数)×100%
表2SYP-B-301饲料添加剂对小鼠生长性能得的影响
注：同行不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，同行相同小写字母表示差异不显著(p＞0.05)。
由表2可知，试验全期，试验组小鼠平均日增重显著高于对照组小鼠(p<0.05)。
由表2可知，试验全期，试验组小鼠与对照组小鼠料重比差异显著(p<0.05)。
由表2可知，实验组小鼠腹泻率和死亡率均比对照组低。
实施例3:以断奶仔猪作为模型动物,研究SYP-B-301饲料添加剂对断奶仔猪生长性能的影响
选择28日龄断奶仔猪，根据窝源、体重、性别随机分为2个处理,每个处理6个重复,每个重复6-8头猪，公母比例均衡，试验从仔猪断奶时即28日龄左右时开始，一共进行28天，56日龄时结束。
分别于仔猪28日龄、42日龄及56日龄，早8:00以重复为单位空腹称量体重，于称重当天结算该阶段耗料量。分别计算各阶段仔猪的平均日采食量、平均日增重、料重比、死亡率和腹泻率。
试验开始、结束时称量仔猪体重，早晨空腹进行，试验结束前12小时将仔猪饲槽清理干净，仔猪饥饿12小时后进行称重。实验结果见表3。
对照组：基础日粮
实验组：基础日粮+1.0% SYP-B-301饲料添加剂
平均日增重(ADG,averag daily gain)=(试验结束窝重一试验开始窝重)/试验猪头数/试验天数
平均日采食量(ADFI,average daily feed intake)=消耗饲料/试验猪头数/试验天数
饲料转化率(FCR,feed conversion ratio)=平均日采食量(g)/平均日增重(g)
死亡率(%)=死亡猪头数/试验猪头数又×100%
腹泻率(%)=试验期腹泻仔猪头次/(试验仔猪头数×试验天数)×100%
表3SYP-B-301饲料添加剂对断奶仔猪生长性能的影响
注:同行不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，同行相同小写字母表示差异不显著(p＞0.05)，同行不同大写字母表示差异极显著(p＜0.01)
由表3可知，28～42d，试验组仔猪与对照组仔猪平均日增重差异不显著(p>0.05)，42～56d，试验组仔猪与对照组仔猪平均日增重差异极显著(p<0.01)，试验全期，试验组仔猪平均日增重均显著高于对照组仔猪(p<0.05)。
由表3可知，28～42d，试验组仔猪与对照组仔猪料重比无显著差异(p>0.05),42～56d，试验组仔猪料重比显著低于对照组仔猪(p<0.05)。试验全期，试验组仔猪与对照组仔猪料重比差异显著(p<0.05)。
由表3可知，实验组仔猪腹泻率和死亡率均比对照组低。
实施例4:以肉仔鸡作为模型动物,研究SYP-B-301饲料添加剂对肉仔鸡生长性能的影响
选取一日龄健康AA肉仔公雏96只,平均体重37.1±0.47g,随机分成2组，每组4个重复，每个重复12只，试验期为28天。
分别于试验开始第1、15、29d早晨空腹称重，以每个重复为单位，计算各组平均日增重，并准确记录采食量和剩料量，计算各组平均日采食量和饲料转化率，记录死亡率和腹泻率。实验结果见表4。
对照组：基础日粮
实验组：基础日粮+1.0%SYP-B-301饲料添加剂
平均日增重(ADG,averag daily gain)=总增重(g)/(试验天数×鸡羽数)
平均日采食量(ADFI,average daily feed intake)=总采食量(g)/(试验天数×鸡羽数)
饲料转化率(FCR,feed conversion ratio)=平均日采食量(g)/平均日增重(g)
死亡率(%)=死亡鸡羽数/试验鸡羽数×100%
腹泻率(%)=试验期腹泻鸡羽数/(试验鸡羽数×试验天数)×100%
表4SYP-B-301饲料添加剂对肉仔鸡生长性能的影响
注：同行不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，同行无标记或有相同小写字母表示差异不显著(p＞0.05)
由表4可知，1～14d和15～28d，试验组肉仔鸡平均日增重显著高于对照组(p<0.05)，试验全期，试验组肉鸡平均日增重均显著高于对照组(p<0.05)。
由表4可知，1～14d，试验组与对照组间料重比无显著差异(p>0.05)，15～28d，试验组料重比显著低于对照组(p<0.05)。试验全期，试验组料重比均显著低于对照组(p<0.05)。
由表4可知，实验组肉仔鸡腹泻率和死亡率均比对照组低。
实施例5:以肉仔鸡作为模型动物,考察SYP-B-301，不同单一菌剂，复合微生态菌剂和抗生素对肉仔鸡生长性能的影响
选取一日龄健康AA肉仔公雏240只，平均体重37.1±0.47g，随机分成5组，每组4个重复，每个重复12只，试验期为28天。
分别于试验开始第1、15、29d早晨空腹称重，以每个重复为单位，计算各组平均日增重，并准确记录采食量和剩料量，计算各组平均日采食量和饲料转化率，记录死亡率和腹泻率。实验结果见表5。
平均日增重(ADG,averag daily gain)=总增重(g)/(试验天数×鸡羽数)
平均日采食量(ADFI,average daily feed intake)=总采食量(g)/(试验天数×鸡羽数)
饲料转化率(FCR,feed conversion ratio)=平均日采食量(g)/平均日增重(g)
死亡率(%)=死亡鸡羽数/试验鸡羽数×100%
腹泻率(%)=试验期腹泻鸡羽数/(试验鸡羽数×试验天数)×100%
对照组：基础日粮
实验Ⅰ组：基础日粮+1.0%SYP-B-301
实验Ⅱ组：基础日粮+1.0%嗜酸乳杆菌
实验Ⅲ组：基础日粮+1.0%地衣芽孢杆菌
实验Ⅳ组：基础日粮+0.2%复合益生菌剂
实验Ⅴ组：基础日粮+0.01%黄霉素制剂
表5不同菌剂和抗生素对肉仔鸡生长性能的影响
注：同行不同小写字母表示差异显著(p＜0.05)，同行无标记或有相同小写字母表示差异不显著(p＞0.05)
单一菌剂：嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌，有效活菌数为5～6×108cfu/g。
复合益生菌剂：为EM生态益生菌原液，由日本引进的比嘉照夫教授研制。主要成分：乳酸菌，酵母菌，光合细菌等有益微生物，有效微生物含量2×109cfu/ml。
由表5可知，1～14d和15～28d，1.0%SYP-B-301和0.2%复合益生菌剂组肉仔鸡平均日增重显著高于对照组(p<0.05)，1.0%嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌制剂组平均日增重稍高于对照组，但差异不显著(p>0.05)，1.0%嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌制剂组平均日增重显著低于1.0%SYP-B-301和0.2%复合益生菌剂制剂组(p<0.05)；1～14d，抗生素组与1.0%SYP-B-301和0.2%复合益生菌剂制剂组间平均日增重无显著差异(p>0.05)，但显著高于1.0%嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌制剂组间平均日增重(p<0.05)。15～28d，抗生素组平均日增重显著高于对照组(p<0.05)。试验全期，1.0%SYP-B-301和0.2%复合益生菌剂制剂组平均日增重均显著高于对照组(p<0.05)，1.0%嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌制剂组平均日增重稍高于对照组，差异不显著(p>0.05)；抗生素组平均日增重显著高于对照组(p<0.05)。1.0%嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌制剂组之间差异不显著(p<0.05)，与其它添加菌剂和抗生素处理组之间差异显著(p<0.05)。
由表5可知，1～14d，各处理间料重比无显著差异(p>0.05)，15～28d，1.0%SYP-B-301和0.2%复合益生菌剂制剂组料重比均显著低于对照组(p<0.05)，但两组之间差异不显著(p>0.05)，抗生素组和1.0%SYP-B-301和0.2%复合益生菌剂制剂组间也无显著差异(p>0.05)；抗生素组、1.0%SYP-B-301和0.2%复合益生菌剂制剂组间料重比显著低于1.0%嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌制剂组(p<0.05);1.0%嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌制剂组间料重比显著高于对照组(p<0.05)。试验全期，添加菌剂各组料重比均显著低于对照组(p<0.05)，抗生素组、1.0%SYP-B-301和0.2%复合益生菌剂制剂组间料重比显著低于对照组、1.0%嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌制剂组(p<0.05)；1.0%嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌制剂组显著低于对照组，差异显著(p<0.05)，1.0%嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌制剂组间无显著差异(p>0.05)。
由表5可知，SYP-B-301制剂组和抗生素组的死亡率和腹泻率显著低于对照组和其它实验组。且SYP-B-301制剂组腹泻率低于抗生素组。
总体而言，1.0%SYP-B-301、0.2%复合益生菌剂和抗生素均能改善肉仔鸡的生长性能，效果明显高于1.0%嗜酸乳杆菌和地衣芽孢杆菌制剂。同时，与0.2%复合益生菌剂相比，虽然料重比相当，但1.0%SYP-B-301平均日增重高于0.2%复合益生菌剂。由此可见SYP-B-301明显提高肉仔鸡的生长性能的作用。
以上结果充分说明本发明提供的格氏乳球菌SYP-B-301饲料添加剂能够有效防治畜禽疾病，显著提高生产性能，显著降低腹泻率和死亡率，并且纯绿色无污染。说明其具有良好的经济效益和生态效益。
Claims (9)
1.一种格氏乳球菌（Lactococcus garvieae），其特征是，其保藏编号为CGMCC No. 7188，且能显著降低料重比，提高动物生产性能，增强动物免疫力，降低动物死亡率，减少腹泻率。
2.权利要求1所述的格氏乳球菌在发酵制备饲料添加剂中的应用。
3.一种饲料添加剂，其特征是，含有权利要求1所述的格氏乳球菌。
4.根据权利要求3所述的饲料添加剂，其特征是：所述饲料添加剂中，每克含活菌数为1.4×l010-9.5×1010个/克。
5.根据权利要求3所述的饲料添加剂，其特征是，所述饲料添加剂的添加量为基础日粮的0.1~10.0%。
6.根据权利要求5所述的饲料添加剂，其特征是，所述饲料添加剂的添加量为基础日粮的0.1~2.0%。
7.一种如权利要求3所述的饲料添加剂的制备方法，其特征是：包括如下步骤：原始菌种的活化、种子液的制备、发酵液的制备、固体添加剂的制备，其具体制备方法为：
将冻干管形式保存的格氏乳球菌转接在格氏乳球菌的培养基上，培养，得到菌种斜面培养物；将斜面培养物接到上述液体培养基中，培养得到种子液菌,然后将种液按1~10%浓度接种到发酵罐中；所述培养基为：3-5%葡萄糖、0.01-0.12%酵母浸粉、0.02-0.04%蛋白胨、琼脂18g，蒸馏水1L， pH 3.0-4.5；
在发酵罐内放入纯净水，加入上述培养基成分，高温灭菌后，按1~10%浓度接种，20-40℃搅拌培养10-36小时，每毫升含活格氏乳球菌菌数2×108-4×108个，室温下放罐获得菌液；
该格氏乳球菌固体饲料添加剂的制备：其特征在于，所得发酵液用离心机离心，弃上清液，得菌泥，用6%-10%的脱脂奶粉，1.0%-1.2%海藻糖和1%-5%的乳糖，搅拌菌泥混匀，先置于低温冷冻，再置于真空冷冻干燥机干燥，取出粉碎，过筛。
8.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：灭菌中，加热后维持100-120℃，保温15-30分钟。
9.根据权利要求7所述的制备方法，其特征在于：发酵液离心条件为：4000-10000rpm，15min。
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