CN102206590B - 一种草分枝杆菌Sq-1及复合微生态制剂的制备方法 - Google Patents

一种草分枝杆菌Sq-1及复合微生态制剂的制备方法 Download PDF

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本发明公开了一种草分枝杆菌Sq-1及复合微生态制剂的制备方法，步骤是：A、培养基配制；B、将Sq-1种子无菌接入茄子瓶斜面下培养；C、将接种瓶的种子接入种子罐；D、将种子罐的种子转入发酵罐；E、发酵液离心干燥，收集菌体，得到草分枝杆菌Sq-1。制备一种复合微生态制剂的方法，步骤是：A、配制枯草芽孢杆菌的培养基：B、将AS1.892种子接种到茄子瓶斜面培养；c、种子罐培养；d、发酵罐培养；e、将发酵液离心干燥，得到枯草芽孢杆菌菌体。F、将Sq-1干菌体与AS1.892干菌体按比例混均，制成胶囊。方法易行，操作简便，成本低，无污染。该制剂很好地调节肠胃的微生态平衡，提高机体免疫力，具有较强的抗氧化、抗辐射的功能。用于人和动物的长期保健和慢性病治疗。

Description

一种草分枝杆菌Sq-1及复合微生态制剂的制备方法
技术领域
本发明涉及医学生物工程和发酵工程及微生物分子生态领域，更具体涉及一种灭活的草分枝杆菌Sq-1，还涉及一种枯草芽孢杆菌AS-1.892活菌培养物，同时还涉及一种灭活的草分枝杆菌Sq-1与活的枯草芽孢杆菌AS1.892复合制剂的制备方法。通过不同的菌株多种活性因子的协同作用调节肠道微生态平衡，强化机体的免疫调节和抗氧化、抗辐射能力，用于人和动物长期保健和一些慢性疾病的治疗。
背景技术
草分枝杆菌是一类非致病的杆菌，其制剂是一种免疫增强剂，20世纪末期，人们发现了分枝杆菌多糖(MPS)，胞壁酰二肽(MDP)，具有很强的免疫调节作用，同时促进造血系统、抑制病毒复制、修复受损细胞等等。近年来人们对它的去甲基化胞嘧啶，以及鸟嘌呤为核心的寡聚脱氧核苷酸序列(CPG)强佐剂作用引起了广泛的关注，以生物调节剂治疗由生理性病变引起的多种疑难杂症，取得了很好的效果。成为21世纪初免疫治疗极为关注的热点。国内外代表产品是德国sanum-kahlbeck公司在中国成都生产的乌体林斯，对它的临床应用作了大量的报导。它是以灭活的菌体作为非特异性免疫制剂(针剂)。中国专利“草分枝杆菌免疫液，ZL03118887.7”以菌体及其培养物包括了MPS、MDP、CPG等组分，优以含胡萝卜素、黄酮和多种维生素酶多种微量元素，更经济、更有效地发挥了免疫调节、抗氧化、抗辐射等功能。
枯草芽孢杆菌作为活菌微生态制剂，早在上世纪晚期以口服液形式进入市场，在免疫调节、消化道感染和气管炎的治疗上发挥了重要作用。地衣芽孢杆菌也以胶囊形式(商品名整肠生)用于调节微生态平衡。这类芽孢杆菌通常产生蛋白酶淀粉酶和纤维素酶帮助消化。增加机体对食物吸收利用率。近年来，kunio suetsuna发现经蛋白酶消化的对虾多肽和寡肽，具有很强的清除自由基的活性。任伟等人对于卵蛋白肽、骨原肽、大豆肽、玉米肽等食源性低聚肽，进行了抗氧化研究，结果表明，在清除DPPH自由基中大豆肽、卵蛋白肽活性最高，在抑制亚油酸自氧化体系中，大豆肽和海洋胶原肽，对于亚油酸自氧化抑制率分别为75％和58.69％。因此生物活性肽(bioactive peptide)是一类具有分子量小，生理活性强的特殊营养物质，成为营养学界和医学界研究的热点领域，2008年李勇等人对海洋生物蛋白肽与灵芝多糖配伍作了防辐射的研究，结果表明，不仅增强了经Cor照射的小鼠的存活时间，还大大的促进了外周血白细胞和DNA的修复，提高了SOD酶活性，大大提高了小鼠细胞和体液的免疫功能。
发明内容
本发明的目的是在于提供了一种灭活的草分枝杆菌Sq-1，该菌在蔗糖无机盐培养液内首先产生MDP、MPS、CGP等构形物；其次是黄酮、胡萝卜素、维生素酶多种微量元素。后者以微量和超微量形式存在大大加强了各自生理活性，而且无任何毒副作用。
本发明的另一个目的是在于提供了一种复合微生态制剂，活着的枯草芽孢杆菌AS1.892在肠道中迅速繁殖，造成厌氧环境，抑制了处于劣势的肠道其它好氧细菌的增殖，同时有利于肠壁厌氧的乳酸菌双歧杆菌的生长，调节了肠道微生态平衡。枯草菌所产生的淀粉酶、蛋白酶，帮助消化，提高食物利用率，同时也提高了机体免疫水平，而两株复合制剂强强联合，强化了各自的生理活性功能。
本发明的再一个目的是在于提供了一种复合微生态制剂的制备方法，方法易行，操作简便，成本低，无污染。尤其提供了一种新型的植物油和泡敌乳化的消泡剂，效果好。
为了达到上述目的，本发明采用以下技术措施：
一种草分枝杆菌Sq-1复合微生态制剂的制备方法，其步骤是：
首先是对草分枝杆菌Sq-1(Mycobacterium plei Sq-1)保藏号：CGMCCNO0916和枯草芽孢杆菌AS1.892(bacillus subtilis AS1.892)，此株菌在中国高等学校菌种目录中编号为CCTCC AB93177，分级培养，制作复合微生态制剂。生物材料样品的保藏信息为：分类命名：草分枝杆菌Mycobacterium phlei，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址：中国市海淀区中关村北一条13号中国科学院微生物研究所，保藏日期：2003年4月1日，保藏编号：CGMCC NO.0916。
一种灭活的草分枝杆菌Sq-1的制备方法，其步骤是：
A、培养基配制：由下述原料按重量份制做培养基(重量份)：g/L
Figure GDA0000079397230000031
PH7.2-7.5，115℃灭菌35-45分钟。
B、将Sq-1种子无菌接入茄子瓶斜面在28-32℃条件下培养2-4天，无菌操作转入接种瓶；
C、将接种瓶的种子接入种子罐，培养温度为28-32℃，通气量1∶0.8，自动流加消泡剂(任何一种食用植物油∶泡敌∶水按6-8∶2-3∶30-50混合乳化)。培养36-40小时种子抽样镜检；菌体生长均匀，停止发酵；所述的消泡剂为食用植物油(任何一种)、泡敌、水。食用植物油、泡敌、水的比例为6-8∶2-3∶30-50。
D、将种子罐的种子转入发酵罐，温度为28-32℃，通气量1∶0.8，自动流加消泡剂，培养50-60小时，抽样镜检，菌体老化成球杆状，停止培养；
E、发酵液离心收集菌体，在108-112℃烘干，收干菌体。得到了一种草分枝杆菌Sq-1的菌体。
一种复合微生态制剂的制备方法，其步骤是：
A、一种AS1.892枯草芽孢杆菌菌剂优化的培养基(重量份)：
Figure GDA0000079397230000032
PH7.2-7.4，121℃灭菌35-45分钟。
B、将AS1.892种子接种到茄子瓶斜面，在33-37℃条件下培养34-38小时，用无菌水将菌体洗下，转入接种瓶；
C、种子罐接入种子后，通气量1∶1，自动流加消泡剂，35-37℃培养18-22小时后镜检菌体，生长健壮均匀，停止发酵；
发酵罐接入种子罐种子，35-37℃通气量1∶1自动流加消泡剂，培养38-42小时，镜检时，菌体变短，菌数达到109个/ml时停止发酵；所述的消泡剂为食用植物油(任何一种)、泡敌、水。食用植物油、泡敌、水的比例为为6-8∶2-3∶30-50。
D、将发酵液离心，收集菌体，真空减压63-67℃烘干，收集干菌体。得到了一种AS1.892枯草芽孢杆菌菌体。
E、将Sq-1干菌体与AS1.892干菌体按1∶3比例混均匀，得到了一种复合微生态制剂(胶囊)。
综上所述，为了保持菌株的优良遗传特性，在生产过程中，对原种大量增殖后用甘油-70℃和牛奶冻干保藏，开启后其子代选典型生长快的菌落，并在生产中传代不超过三次。
该制剂很好地调节肠胃的微生态平衡，提高机体免疫力，具有较强的抗氧化、抗辐射的功能。可以用于人和动物的长期保健和一些慢性病的治疗。
发明的优点和效果：
一、本发明是由灭活的草分枝杆菌的菌体和活着的枯草芽孢杆菌组配的新型微生态制品，二者混合后，灭活的菌体及代谢产物作为益生元增加肠道中有益菌的生长繁殖以及定植能力，活的菌体增加了新的益生菌群，大大增强了肠道益生菌的种群和数量。维持肠道良好的微生态平衡。
二、两种菌作为免疫增强剂，混合使用的多因子协同作用效应远远大于单独使用的效果。
例如；枯草芽孢杆菌利用大豆蛋白作为氮源经过它自身产生的蛋白酶消化以后，产生多种2-4个氨基酸组成的短肽，具有很强的抗氧化活性，而弥补了草分枝杆菌蛋白酶活性不高的缺点。
三、这种微生态制剂的使用将大大减少环境污染和抗生素的大量使用对人和动物造成的严重危害，是营养学向预防医学转变的重要里程碑。
四、微生态制剂经过配伍，延长了制剂的活菌保质期。
五、本发明采用消泡剂是泡敌植物油和水乳化成的，效果好，发酵成本大大减小。
六、此制剂工艺简单，操作方便，成本低。
总之该菌剂具有明显的抗氧化抗辐射和提高机体免疫力等功能。
附图表说明使用效果。
表1三种不同制剂体外抗氧化比较
  草分枝杆菌   枯草芽孢杆菌   混合(1∶3)
  1、C50/mg.ml-1   8.356   8.068   9.315
  2、抑制率   80.61   75.96   85.33
1、对DPPH(二苯代苦味酰基)消除效果
2、对亚油酸自氧化的抑制效果。
表2三种不同制剂免疫功能的比较
Figure GDA0000079397230000051
Figure GDA0000079397230000061
表3三种制剂抗辐射功能比较
用Cor一次性全身均匀辐射30天，照射剂量：7.31-8.16GY，照射剂量率：0.9-1.0GY/min
1、小鼠受射后存活率影响
Figure GDA0000079397230000062
#P＜0.01  *P＜0.05
2、小鼠受照后白细胞计数的影响
Figure GDA0000079397230000063
#P＜0.01 *P＜0.05
具体实施方式
实施例1：
一种灭活的草分枝杆菌Sq-1的制备方法，其步骤是：
A、培养基配制：由下述原料按重量份制做培养基(重量份)：g/L
Figure GDA0000079397230000072
PH7.2-7.5，115℃灭菌35-45分钟。
B、将Sq-1种子无菌接入茄子瓶斜面在28-32℃条件下培养2-4天，无菌操作转入接种瓶；
C、将接种瓶的种子接入种子罐，培养温度为28-32℃，通气量1∶0.8，自动流加消泡剂，培养36-40小时种子抽样镜检；菌体生长均匀，停止发酵；所述的消泡剂为食用植物油(任何一种)、泡敌、水。食用植物油、泡敌、水的比例为为6-8∶2-3∶30-50。
D、将种子罐的种子转入发酵罐，温度为28-32℃，通气量1∶0.8自动流加消泡剂，培养50-60小时，抽样镜检，菌体老化成球杆状，停止培养；
E、发酵液离心收集菌体，在108-112℃烘干，收干菌体。得到了一种草分枝杆菌Sq-1菌体。
一种复合微生态制剂的制备方法，其步骤是：
A、一种AS1.892枯草芽孢杆菌菌剂优化的培养基(重量份)：
Figure GDA0000079397230000081
PH7.2-7.4，121℃灭菌35-45分钟。
B、将AS1.892种子接种到茄子瓶斜面，在35-37℃条件下培养36小时，用无菌水将菌体洗下，转入接种瓶；
F、种子罐接入种子后，通气量1∶1，自动流加消泡剂，35-37℃培养18-22小时后镜检菌体，生长健壮均匀，停止发酵；
发酵罐接入种子罐种，通气量1∶1，自动流加消泡剂，35-37℃培养38-42小时，镜检时，菌体变短，菌数达到109个/ml时停止发酵；所述的消泡剂为食用植物油(任何一种)、泡敌、水。食用植物油、泡敌、水的比例为6-8∶2-3∶30-50。
G、将发酵液离心，收集菌体，真空减压63-67℃烘干，收集干菌体。得到了一种AS1.892枯草芽孢杆菌菌体。
H、将Sq-1干菌体与AS1.892干菌体按1∶3比例混均匀，得到了一种复合微生态制剂(胶囊)。
实施例2：
一种灭活的草分枝杆菌Sq-1制备方法，其步骤是：
一、上游技术的制作工艺：
制作Sq-1菌株发酵程序如下：
1、斜面种子的制做：用Sq-1优化的种子培养基(蔗糖15g/L，葡萄糖5g/L，K2HPO4 0.5g/L MgSO4 0.1g/L，NH4Cl 0.5g/L蛋白胨1.0g/L补水量1L)，加入20g的琼脂粉，灭菌后制成茄子瓶斜面，接种的是种子批启用第一子代菌种，30℃培养3天。
2、摇瓶种子的制做：将种子液体培养基250ml装入1L的三角瓶中，接种斜面种子，30℃，200rpm，振培50h，镜检菌体生长均匀无杂菌。
3、种子罐种子的制备，300L的种子罐装180L的种子培养基，封好，115℃灭菌45分钟，冷却至35-38℃时，可以将摇瓶的种子，转入接种瓶后，无菌移入种子罐，通气量1∶0.8，罐压0.3Mpa，培养温度30-32℃，自动控制消泡剂的流量，培养40-50h，镜检菌体生长均匀无杂菌。所述的消泡剂为食用植物油(任何一种)、泡敌、水为6-8∶2-3∶30-50。
4、发酵罐发酵液的制备，制作发酵培养基(g/L)：蔗糖20，葡萄糖10，K2HPO4 1.5，MgSO4·7H2O 0.2，NH4Cl 2.0蛋白胨1.0，补水量1L，PH7.0，在3吨的发酵罐内装入1.8吨发酵培养液，115℃灭菌1小时，冷却至35-38℃时把种子罐种子移入发酵罐。通气量1∶1，罐压0.3Mpa，30-32℃，自动控制消泡剂的加入。培养50-60h，抽样镜检菌体老化，菌数达到1-3×109个/ml。
枯草芽孢杆菌，AS1.892菌剂上游制作程序：
1、茄子瓶斜面种子制作：按种子培养基牛肉膏3g/L，蛋白胨5g/L，NaCl 5g/L，琼脂20g/L，水余量，PH7.2，121℃灭菌30分钟。待培养基冷却至40℃时摆好斜面，冷却至室温斜面固定好，接入AS1.892的种子批第一代种子，35-37℃培养2天将茄子瓶的种子用无菌水洗下来装入接种瓶待用，镜检菌体生长健壮均匀无杂菌。
2、种子罐种子的制作：
按种子罐优化培养基，大豆粕10.0g/L，玉米粉20.0g/L，玉米浆粉0.5g/L，K2HPO4 1.5g/L，KH2PO40.7g/L，水余量，PH7.2-7.6，共配180L种子液打入300L种子罐，121℃灭菌45分钟，冷却至38℃时接入接种瓶里的种子，通气量1∶1，罐压0.3Mpa，温度在35-37℃培养，自动控制消泡剂的流量，培养24小时，镜检计数1-3×108个/ml菌数，停止发酵。
3、发酵罐培养基原料按每吨的公斤数配：
大豆粕15.0Kg，玉米粉20.0Kg，玉米浆粉1.5Kg，K2HPO4 1.5Kg，KH2PO40.70Kg，水余量，PH7.2。
将1.8吨的发酵用的培养基配好后打入3吨发酵罐，121℃灭菌45分-1小时，冷却至38℃把种子罐种子打进后1∶1通气量，自动控制消泡剂流量，罐压0.3Mpa，35-37℃培养38-42小时。镜检菌数达到1-2×109个/ml。所述的消泡剂为食用植物油(任何一种)、泡敌、水为6-8∶2-3∶30-50。
发酵液进入下游程序：
二、下游技术的制做：
1、Sq-1发酵液离心，收集菌体，108-112℃烘干。得干菌体。
2、将AS1.892发酵液，经离心，63-67℃，减压真空干燥(保持菌体的活性)收集菌体。
三、复合微生态制剂的制做：将一种草分枝杆菌Sq-1制作的干菌和一种AS1.892枯草芽孢杆菌菌体按1∶3比例混合后制成胶囊。

Claims (2)

1.一种复合微生态制剂的制备方法，其步骤是：
1）制备灭活的草分枝杆菌Sq-1，保藏号：CGMCC NO.0916，其步骤是：
A、培养基配制：
Figure FDA00001682103400011
pH7.2-7.5，115℃灭菌35-45分钟；
B、将Sq-1种子无菌接入茄子瓶斜面在28-32℃条件下培养2-4天，无菌操作转入接种瓶，镜检种子无杂菌生长均匀；
C、将接种瓶的种子接入种子罐，培养温度为28-32℃，通气量1：0.8，自动流加消泡剂，培养36-40小时种子抽样镜检；菌体生长均匀，停止发酵；
D、将种子罐的种子转入发酵罐，温度为28-32℃，通气量1∶0.8，自动流加消泡剂，培养50-60小时，抽样镜检，菌体老化成球杆状，菌数达109个/ml，停止培养；
E、发酵液离心收集菌体，在108-112℃烘干，收干菌体，得到了一种草分枝杆菌Sq-1的菌体；
2）制备枯草芽孢杆菌AS1.892，保藏号：CCTCC AB93177，其步骤是：
A、一种AS1.892枯草芽孢杆菌菌剂优化的培养基：
Figure FDA00001682103400012
Figure FDA00001682103400021
pH7.2-7.4，121℃灭菌35-45分钟；
B、将AS1.892种子接种到茄子瓶斜面，在35-37℃条件下培养34-38小时，用无菌水将菌体洗下，转入接种瓶；
C、种子罐接入种子后，通气量1∶1，自动流加消泡剂，35-37℃培养18-22小时后镜检菌体，生长健壮均匀，停止发酵；
D、发酵罐接入种子罐种子，35-37℃通气量1∶1自动流加消泡剂，培养38-42小时，镜检时，菌体变短，菌数达到109个/ml时停止发酵；
E、将发酵液离心，收集菌体，真空减压63-67℃烘干，收集干菌体，得到了一种AS1.892枯草芽孢杆菌菌体；
3）将Sq-1干菌体与AS1.892干菌体按1∶3比例混均匀，得到了一种复合微生态制剂。
2.根据权利要求1所述的一种复合微生态制剂的制备方法，其特征在于：所述的消泡剂为任何一种食用植物油、泡敌、水，食用植物油、泡敌、水的比例为6-8∶2-3∶30-50。
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