CN101649303B - 一种双歧杆菌及其应用和含有双歧杆菌的食品组合物 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BBMN68，保藏号是CGMCC No.2265，它对酸和胆盐、人工模拟消化液具有良好抗性，对肠道上皮细胞具有黏附能力，具有免疫刺激及调节肠道微生物菌群的功能。本发明还提供了含有本发明双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BBMN68的食品组合物。

Description

一种双歧杆菌及其应用和含有双歧杆菌的食品组合物

技术领域

本发明涉及微生物学，更具体地涉及一种具有免疫刺激功能及调节肠道功能的双歧杆菌及其应用，以及该微生物作为益生菌的食品组合物。

背景技术

双歧杆菌是人类最早发现的生理性细菌，是能在健康人肠道内定植的益生菌。人体和动物肠道内存在着大量的微生物菌群，菌种类多，多少不一，这些微生物和宿主相互作用、相互影响，共同维持着肠道微生态的动态平衡。双歧杆菌是定居在肠道中的有益细菌，通过抑制病原菌和腐败菌的生长来维持人体微生态和肠管的平衡状态。近年来迅速发展的以乳酸菌为主的益生菌和活菌制剂，代替抗生素的使用，通过活菌制剂达到调整肠道平衡，从而防治腹泻、便秘等消化疾病。

免疫功能是双歧杆菌发挥其它益生功能的基础。许多研究证实双歧杆菌的活菌、死菌、裂解成分、可溶性提取物等均有免疫刺激作用。双歧杆菌菌体抗原及代谢物通过刺激肠粘膜淋巴结，刺激免疫活性细胞，产生特异性抗体和致敏淋巴细胞，调节机体免疫应答。双歧杆菌具有激活巨噬细胞的β半乳糖苷酸活性，加强和促进其吞噬作用，还可促进淋巴细胞增殖，使NK细胞活性增强，单核巨噬细胞系统的吞噬作用增强，抗体产生细胞活化，各种细胞因子增多，提高机体局部和全身的免疫功能。

有效的益生菌应符合以下几条标准：必须来自于宿主；对宿主健康发挥有益作用；非致病菌且没有毒性作用；在生物学上应当具有活性，即包含大量活菌；可以在宿主肠道内存活及代谢；在储存和使用过程中保持活性。筛选具有优良性能的双歧杆菌菌株，开发益生菌产品将具有广阔的应用前景。本发明涉及的双歧杆菌菌株来源我国健康人群肠道，并通过动物实验证实具有免疫刺激功能及调节肠道功能。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种来自健康人群肠道，对酸和胆盐、人工模拟消化液具有良好抗性，对肠道上皮细胞具有黏附能力，具有免疫刺激及调节肠道微生物菌群功能的长双歧杆菌Bifidobacterium longum。

本发明的另一个目的是提供含有本发明长双歧杆菌Bifidobacterium longum的食品组合物。

本发明的还一个目的是提供将本发明的长双歧杆菌Bifidobacterium longum含有本发明长双歧杆菌的食品组合物用于调节动物胃肠功能的用途。

根据本发明的第一方面，提供了一种双歧杆菌，它是长双歧杆菌Bifidobacterium longum，保藏号：CGMCC No.2265，保藏日期2007年11月26日，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心。保藏地点：中国，北京，朝阳区大屯路，中国科学院微生物研究所。

所述的长双歧杆菌对酸和胆盐、人工模拟消化液具有良好抗性。

所述的长双歧杆菌对肠道上皮细胞具有黏附能力。

根据本发明的第二方面，提供了本发明所述的长双歧杆菌的用途，它被用于制备组合物，所述的组合物对实验动物具有免疫刺激功能。

所述的组合物是食品组合物，在另一优选例中，所述组合物是酸奶。

根据本发明的第三方面，提供了本发明所述的长双歧杆菌的用途，它被用于制备组合物，所述的组合物对实验动物具有调节肠道菌群的功能。

根据本发明的第四方面，提供一种食品组合物，它的有效成分是本发明所述的长双歧杆菌和食品上可接受的载体。所述组合物中含有的所述的长双歧杆菌的绝对数量为1.0×10³-1.0×10¹¹CFU/mL。

附图说明

图1所示为采用本领域的常规方法制备含长双歧杆菌BBMN68的食品组合物的流程。

具体实施方式

经多次筛选和培育，从长寿之乡巴马瑶族自治县的长寿老人粪便中分离得到一株长双歧杆菌菌株Bifidobacterium longum，该菌株对酸和胆盐 具有耐受性能，对肠道上皮细胞具有黏附能力，经动物实验证明，对试验小鼠具有免疫刺激作用、调节肠道微生物菌群和润肠通便功能。

长双歧杆菌BBMN68已于2007年11月26日交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号：CGMCC No.2265。

如文中所用，“本发明双歧杆菌”“本发明长双歧杆菌”或“本发明微生物”是指长双歧杆菌BBMN68菌株CGMCC No.2265。应理解，这些术语还包括衍生自长双歧杆菌BBMN68菌株，尤其是具有耐酸、耐胆盐，且对肠上皮细胞具有黏附性能，对试验动物具有免疫刺激功能、调节肠道菌群和润肠通便功能等特性的衍生菌株。

长双歧杆菌BBMN68的基本生物学特性与已知的该种属的典型微生物基本相同，不同点在于本方明微生物对酸性环境及一定浓度的胆盐溶液具有耐受性能，且对肠上皮细胞具有黏附性能，对试验动物具有免疫刺激功能、调节肠道菌群及润肠通便功能。

具体而言，耐酸性能试验证明，本发明的长双歧杆菌BBMN68在pH2.0-3.0的酸性溶液中培养2小时，仍存在大量的活菌数。

耐胆盐性能试验证明，本发明的长双歧杆菌BBMN68在含0.05-0.1％胆盐浓度的培养液中生长性能良好。能耐受0.3-1.5％胆盐浓度。

体外黏附性能试验证明，本发明的长双歧杆菌BBMN68对人结肠癌细胞株caco-2具有黏附能力，平均黏附数为21±4.5黏附菌数/细胞。

动物试验证明，本发明的双歧杆菌能显著提高动物体淋巴细胞的转化能力、巨噬细胞的吞噬活性以及自然杀伤细胞(NK细胞)的活性，能提高动物血清对免疫刺激产生抗体的能力。表明本发明的长双歧杆菌BBMN68对动物体具有显著的免疫刺激功能，发挥功能的活菌浓度为10⁵～10⁹cfu/mL。

动物试验证明，实验动物连续14日给予本发明的长双歧杆菌BBMN68菌悬液，试验动物粪便内双歧杆菌数量显著性增加，中剂量(10⁷cfu/mL)、高剂量(10⁹cfu/mL)组小鼠粪便中乳杆菌数量增加。各试验组小鼠肠道肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌数量无明显变化。根据评判标准可知，长双歧杆菌BBMN68活菌菌悬液对实验小鼠具有调节肠道菌群作用。

动物试验证明，实验动物连续7日给予本发明的长双歧杆菌BBMN68菌液，不同剂量BBMN68菌液均缩短了便秘小鼠的首次排便时间，增加小鼠排便颗粒和粪便重量，对受试小鼠具有润肠通便功能。

本发明的长双歧杆菌经过菌株毒力试验检验，证明本发明双歧杆菌培养物原液和5倍浓缩液对小鼠体重增长的影响无统计学意义，同时未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。

本发明的长双歧杆菌可作为有效成分，用于提高人体的免疫力和调节肠道功能。

本发明还提供了一种含有本发明的长双歧杆菌BBMN68作为有效成分的食品组合物。食品组合物可以为固态(如冻干粉、胶囊、颗粒剂、片剂、含片)或液体(如口服液、饮料)或其他合适的形状。本发明的微生物含量通常为组合物重量的1-99％，绝对数量为1.0×10³-1.0×10¹¹CFU/mL。

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。

实施例1 从健康长寿老人粪便分离获得长双歧杆菌BBMN68

中国广西巴马瑶族自治县是闻名于世的长寿之乡，1991年11月1日，在日本东京召开的国际自然医学会第13次会议上，正式确认为世界第五长寿之乡。巴马瑶族自治县甲篆乡是该县的长寿带，2005年人口普查甲篆乡全乡人口25115人，其中百岁老人21人。本发明人于2007年4月，以巴马县甲篆乡90岁以上的老人为对象，针对老人的身体健康状况、生活习惯、饮食卫生情况等进行问询，采集身体健康，1年以上不服用药物的健康长寿老人的粪便样品，用灭菌蛋白胨水保存新鲜粪便，4℃冷藏，在4小时之内运送至实验室，完成样品处理和培养。以无菌玻棒将粪便样品捣碎，震荡均匀，按十倍稀释法将样品稀释，取10^-4～10^-8稀释度溶液1mL于无菌培养皿中，倒入NPNL双歧杆菌选择性琼脂培养基，充分混匀后冷却凝固，放入厌氧袋中，37℃厌氧培养48-72小时。经多次筛选和培育，得到长双歧杆菌BBMN68的纯培养物。

NPNL双歧杆菌选择培琼脂培养基配方(1L)

牛肉浸汁粉3g；蛋白胨10g；胰蛋白胨5g；植胨3g；酵母浸出汁5g；肝浸出汁150mL；葡萄糖10g；可溶性淀粉0.5g；溶液A 10mL；溶液B 5mL；吐温801g；盐酸半胱氨酸盐0.5；琼脂15g；蒸馏水815mL。pH6.8-7.0，121℃，灭菌15分钟，灭菌后冷却到60℃以下添加C液40mL。

溶液A：K₂HPO₄ 25g  KH₂PO₄ 25g，蒸馏水250mL

溶液B：MgSO₄.7H₂O 0.5g，FeSO₄.7H₂O 0.5g，NaCl 0.5g，MnSO₄ 0.337g，蒸馏水250mL

选择性C液：硫酸巴龙霉素100mg，硫酸新霉素40mg，丙酸钠15g，氯化锂3g，蒸馏水40mL

分离得到的长双歧杆菌BBMN68菌株，并且于2007年11月26日，交由中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，菌种保藏号CGMCCNo.2265。

长双歧杆菌BBMN68的生理生化特性：

1、形态特征：革兰氏阳性，杆状、多形态，不形成芽孢。

2、生理生化特性：接触酶阴性，氧化酶阴性，严格厌氧生长，果糖-6-磷酸盐磷酸酮酶阳性，发酵葡萄糖产生乳酸。碳水化合物产酸：

葡萄糖	+	葡萄糖酸钠	-	纤维二糖	-
						木糖	+	果糖	+	核糖	+
淀粉	-	菊糖	-	棉子糖	+
						乳糖	+	松三糖	+	水杨素	-
甘露糖	-	甘露醇	-	麦芽糖	+
						山梨醇	-	蜜二糖	+	半乳糖	+
阿拉伯糖	+	蔗糖	+	海藻糖	-

3、16S rDNA序列分析，鉴定结果为长双歧杆菌Bifidobacterium longum。

实施例2长双歧杆菌BBMN68对酸的耐受性

长双歧杆菌BBMN68用无菌改良MRS培养液在37℃厌氧培养18小时。以pH 7.4的PBS缓冲液为基础，用37％的盐酸调节pH至2.0和3.0，121℃、15min灭菌。按1％的接种量接入已活化的液体菌种，37℃厌氧培养，分别于0、30min、90min时间点取样测定活菌数。

MRS培养液配方：蛋白胨10g，酵母浸粉5g，葡萄糖20g，吐温801g，磷酸氢二钾2.6g，水合乙酸钠5g，柠檬酸二氢铵2g，MgSO₄.7H₂O 0.2g，MnSO₄.H₂O0.05g，琼脂13g，蒸馏水1000mL，pH6.4。

表1 长双歧杆菌BBMN68在不同酸性PBS溶液中的活菌数(CFU/mL)

长双歧杆菌在不同酸性溶液中活菌数见表1，长双歧杆菌经酸处理后仍存在大量的活菌数，表明该菌株对酸有良好的耐受性。

实施例3 长双歧杆菌BBMN68对胆盐的耐受性

长双歧杆菌BBMN68用灭菌改良MRS培养液在37℃厌氧培养18小时。将活化菌株培养物按2％接种量接入含不同胆盐浓度的无菌MRS液体培养基中(胆盐浓度0.05％、0.1％、0.3％、0.5％、1％)，同时以不含胆盐的MRS培养基作为对照。在37℃厌氧培养3、6、24h后取样测定活菌数。

表2 长双歧杆菌在不同胆盐浓度中的活菌数(CFU/mL)

0.05-0.1％浓度的胆盐对BBMN68菌株的生长没有抑制作用，24小时后菌株在0.05％胆盐培养液中活菌数与对照组在同一数量级，菌株在大于0.3％胆盐浓度中生长性能不佳，但均具有一定的耐受性能。小肠正常胆盐浓度在0.03-0.3％，食物通过小肠时间短，可以说，菌株具有较强的抗胆汁酸能力，可以通过小肠达到大肠。

实施例4 长双歧杆菌BBMN68对人结肠癌细胞的黏附作用

(a)试验材料

细菌：双歧杆菌菌株BBMN68、对照菌株

细胞：人结肠癌细胞系Caco-2细胞购至协和医科大学细胞保藏库。

细胞培养液：DEME培养液，含10％小牛血清，1％非必需氨基酸，0.2％青霉素和链霉素双抗溶液。

PBS溶液：NaCl 8g，KCl 0.2g，NaHPO₄。7H₂O 1.14g，KH₂PO₄ 0.24g，加水定容至1000mL，pH7.2。

(b)试验方法

长双歧杆菌用改良MRS培养基在37℃厌氧培养18h，将培养液离心4000r/min，10min，PBS重悬细菌调整菌悬液浓度为1×10⁸cfu/mL。Caco-2细胞按常规传代培养于DEME培养基，5％CO₂、37℃恒温培养。隔3日换液，细胞在培养瓶底部形成单细胞层后，用0.25％胰蛋白酶消化，悬浮成单个细胞后于6孔板培养，孔中加入灭菌的盖玻片，于5％CO₂、37℃恒温培养培养3天，细胞黏附于盖玻片并形成单层细胞，各孔用PBS清洗两次后，分别加入配制好的各组菌悬液，37℃温育3h。取出后用PBS洗3次，除去未黏附细菌，盖玻片自然干燥，乙醇固定，革兰染色，镜下(×1000)随机计数50个细胞粘附的细菌数，计算平均数及标准差。以双歧杆菌BBMN01(CGMCC No.1904)为对照。

表3 菌株对人结肠癌细胞Caco-2的黏附

双歧杆菌均有一定的黏附能力，从长寿老人粪便中分离得到的菌株BBMN68对细胞的黏附能力更强。

实施例5 长双歧杆菌BBMN68对实验小鼠的免疫刺激作用

(a)实验材料

实验动物：Balb/c雌性小鼠，6～8周龄，体重18～22g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

主要试剂：RPMI1640培养基干粉 购自Gibco公司；青霉素(Penicillin GSodiun Salt)、链霉素(Streptomycin Sulfate)、Hepes、丙酮酸钠(Pyruvic Acid)、PMS、硝基氯化四氮唑(INT)等购自Amresco公司；MTT：购自Promega公司；刀豆球蛋白A(ConA)、DL-乳酸锂购自Sigma公司；氧化型辅酶I(NAD)购自Roche公司；胎牛血清(FBS)购自PAA公司；绵羊红细胞(SRBC)购自北京大学医学部动物中心；鸡红细胞(CRBC)购自中国农业大学动物医学院；K562 细胞购自中国协和医科大学；补体、都氏试剂、Giemsa染料购自中国医学科学院药用植物研究所；培菲康(国药准字S10950032；产品批号20071104，每粒(210mg)含活菌数不低于1.0×10⁷CFU)购自上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂；其余试剂均为分析纯。

主要设备：生物培养箱；CO₂细胞培养箱(NAPCO)；倒置显微镜(CK2，日本产)；YJ-875型超净工作台(苏州净化设备厂)；μQuant连续波长酶标仪(Bio-tec)；CS-15R低温离心机(Bechman公司)；96孔细胞培养板(Costar公司)；微量振荡器(W Z-2A)；细胞计数板。

(b)实验方法

实验动物分组及处理：

Bal/C小鼠随机分组，空白组每只灌服脱脂乳0.2mL/d；阳性对照组每只灌服培菲康胶囊药液(28mg/mL)0.2mL/d；低剂量、中剂量、高剂量组每天分别灌服1×10⁶、1×10⁸、1×10¹⁰CFU/mL的受试菌0.2mL/d。灌胃4周，25℃饲养，自由饮水采食，每周换两次垫料，每周称一次体重。在处死前5d腹腔注射0.5mL2％的绵羊红细胞(SRBC)致敏。

检测指标及方法：

绵羊红细胞(SRBC)诱导的迟发型变态反应(DTH)：实验动物处死前一天用游标卡尺测量左后足趾部厚度，在测量部位皮下注射20％的SRBC每只20μl，24h后再次测量左后足趾部厚度，同一部位多次测量取平均值。以攻击前后的足趾厚度差值来表示DTH的厚度。

滴片法测定巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率：常规分离小鼠腹腔细胞液，细胞液与1％鸡红细胞等体积混和，加入胎牛血清使其终浓度为10％。混合细胞液滴加到用3％琼脂封闭边缘的玻片封闭圈内，37℃培养20min，结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1min，Giemsa液染色15min，蒸馏水冲洗干净，晾干。用40×显微镜计数吞噬率(每100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分比)。

乳酸脱氢酶(LDH)法测定自然杀伤细胞(NK细胞)活性：靶细胞(K562)传代培养，使用前洗涤、调整细胞浓度为4×10⁵个/mL。制备小鼠脾细胞，用无菌水轻晃20s以裂解红细胞，立即加入2×hank’s液恢复原液压，再次洗涤后调整细胞浓度为2×10⁷个/mL。反应孔取靶细胞(K562)和效应细胞(脾细胞)各100μl加入96孔板中；靶细胞自然释放孔加入靶细胞和培养基各100μl；靶细胞 最大释放孔加入靶细胞和2.5％Triton各100μl。上述各项均设3个平行孔，于37℃培养4h后吸取上清100μl于新的培养板中，加入LDH基质液(DL-乳酸锂5×10^-2mol/L，硝基氯化四氮唑(INT)6.6×10^-4mol/L，PMS 2.8×10^-4mol/L，氧化型辅酶I(NAD)1.3×10^-3mol/L，溶于Tris-HCL(0.2mol/L，pH8.2)，需现用现配)100μl/孔，室温反应10min后每孔加入1mol/l HCL30μl，在酶标仪490nm处测OD值。

血清半数溶血值(HC₅₀)：小鼠摘除眼球取血收集血清，血清临用前用生理盐水稀释500倍，补体稀释10倍。将稀释后的血清0.5mL至于试管内，依次加入10％SRBC 0.25mL，补体0.5mL，空白对照管用生理盐水0.5mL代替血清。置37℃恒温水浴中保温30min，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清0.5mL，加入都氏试剂1.5mL；同时取10％SRBC 0.125mL，加都氏试剂至2mL作为半数溶血对照，充分混匀。放置10min后，以空白对照管作为空白，于540nm处测定各管光密度值。

T淋巴细胞转化增殖：无菌取出脾，置于盛有适量无菌Hank’s液(含5％胎牛血清，1％双抗)的小平皿中，用眼科手术剪轻轻将脾剪碎，用注射器内芯将脾磨碎，制成单细胞悬液，经200目筛网过滤，用无菌吸管将细胞悬液吸入10mL离心管。用Hank’s液洗3次，每次离心10min(1800r/min)。用添加了10％胎牛血清，1％双抗的完全RPMI-1640培养液调整小鼠脾细胞密度为2×10⁶个/mL。于96孔细胞培养板中加入脾细胞悬浮液，每孔0.1mL，再加入含有或不含有ConA的完全RPMI-1640培养液，每孔0.1mL。每只小鼠设空白对照孔和试验孔各设5个重复孔，空白对照孔不含ConA，试验孔ConA终浓度为1.5μg/mL。将96孔细胞培养板放入37℃，5％CO₂饱和湿度培养箱中培养。72h后，每孔吸弃上清70μl，加入20μl MTT显色液(5mg/mL)，37℃显色4h，加入细胞裂解液0.1mL，37℃过夜。用酶标仪于570nm下测定OD值。刺激率＝(试验孔OD值-对照孔OD值)/对照孔OD值

体重变化：每周测定各组小鼠的体重一次，记录小鼠生长状况。

(c)实验数据统计

实验数据结果采用X±SD表示，SPSS 13.0统计软件做方差分析和t-检验。

表4 BBMN68不同剂量对小鼠各项免疫指标的影响

^**：p＜0.01

将不同浓度长双歧杆菌BBMN68的活菌灌胃给正常Bal/C小鼠，四周后测定了小鼠迟发型变态反应(DTH)，巨噬细胞对鸡红细胞的吞噬能力，自然杀伤细胞的杀伤能力，血清产溶血素(抗体)的能力以及T淋巴细胞转化增殖能力来验证长双歧杆菌BBMN68的体内免疫调节功能。结果表明长双歧杆菌BBMN68活菌株能够显著促进小鼠淋巴细胞增殖能力，提高腹腔巨噬细胞的吞噬能力，增强自然杀伤细胞的杀伤活性，增强血清中溶血素抗体的产生能力；在受试过程中，对小鼠体重变化影响不显著，不影响小鼠的正常生长状况。

实施例6 长双歧杆菌BBMN68对实验小鼠肠道微生物的调节作用

(a)试验材料

实验动物：BALB/C小鼠，雄性，18-22g，购自中科院遗传所实验动物中心。

培养基：Lbs培养基，BBL基础培养基，叠氮钠-结晶紫-七叶苷琼脂，伊红美蓝琼脂，胰际-亚硫酸盐-环丝氨酸琼脂基础等购自海博生物技术有限公司

(b)试验方法

受试物的准备：

长双歧杆菌BBMN68用改良MRS液体培养基37℃厌氧培养18h，4000r/min离心10min，菌体沉淀重悬于10％脱脂乳中，配制不同浓度菌悬液。

实验动物分组及处理：

Bal/C小鼠随机分组，空白组每只灌服脱脂乳0.2mL/d；低剂量、中剂量、高剂量组小鼠每天分别灌服1×10⁶、1×10⁸、1×10¹⁰cfu/mL的受试菌0.2mL/d。受试样品给予时间14天。

粪便样品处理方法：

无菌采集小鼠粪便约0.1g，低温厌氧条件运送，4小时内完成样品稀释处理，样品呈10倍系列稀释，取合适的稀释度，分别倾注于各培养基中培养，测定肠道主要菌群(培养条件见表5)。经菌落特征、革兰氏染色、生化反应等鉴定计 数菌落，并计算出每克湿粪便中的菌数。

表5 肠道主要菌群的培养计数方法

(c)实验数据统计与评判标准

实验数据结果采用x±s表示，SPSS 13.0统计软件做T-检验。受试样品是否具有调节肠道菌群作用的判断，标准1：双歧杆菌或乳杆菌增加，产气荚膜梭菌减少或不增加，拟杆菌、肠杆菌或肠球菌增加，但增加幅度小于双岐和/或乳杆菌；标准2：双歧杆菌或乳杆菌增加，产气荚膜梭菌减少或不增加，拟杆菌、肠杆菌或肠球菌减少或无明显变化。符合以上两项标准之一的，经统计学处理有差异显著性，可判定受试物具有调节肠道菌群平衡的作用。

表6 长双歧杆菌BBMN68对正常小鼠肠道微生物的影响

^*：p＜0.05

试验动物灌胃长双歧杆菌BBMN68菌株14日，与试验前数据(第0日)相比较，双歧杆菌不同剂量组小鼠粪便内双歧杆菌数量显著性增加，中、高剂量组小鼠粪便中乳杆菌数量增加。双歧杆菌不同剂量组小鼠肠道肠球菌、肠杆菌、产气荚膜梭菌数量无明显变化。根据评判标准可知，长双歧杆菌BBMN68 活菌菌悬液对实验小鼠具有调节肠道菌群作用。

实施例7 长双歧杆菌BBMN68润肠通便功能

(a)实验材料

实验动物：Balb/c雌性小鼠，6～8周龄，体重18～22g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。

药品：阿拉伯树胶，活性炭，复方地芬诺酯

(b)试验方法

受试物的准备：

长双歧杆菌BBMN68用改良MRS液体培养基在37℃厌氧培养18h，4000r/min离心10min，菌体沉淀重悬于10％脱脂乳中，配制不同浓度菌悬液。以双歧杆菌BB12菌株(科汉森公司)为对照，菌株活化及制备方法同长双歧杆菌BBMN68。

墨汁的配制：

准确称取阿拉伯树胶100g，加水800mL，煮沸至溶液透明，称取活性碳(粉状)50g加至上述溶液中煮沸三次，待溶液凉后加水定容到1000mL，于冰箱中4℃保存，用前摇匀。

0.05％复方地芬诺酯混悬液的配制：

复方地芬诺酯片，每片含复方地芬诺酯2.5mg，取复方地芬诺酯片25mg(20片)，用研钵研碎呈粉末后加水至100mL，临用前配制。

实验动物分组及处理：

实验设三个剂量组，一个空白对照组和一个模型对照组。空白组和模型组小鼠每日灌胃脱脂乳0.2mL；低剂量、中剂量、高剂量组小鼠每日灌胃1×10⁷、1×10⁸、1×10⁹cfu/mL的BBMN68菌悬液0.2mL，阳性对照组小鼠每日灌胃1×10⁸cfu/mLBB12菌悬液0.2mL。

检测方法：

给受试样品7日后，各组小鼠禁食不禁水16小时。模型对照组，阳性对照组和三个剂量组小鼠灌胃给予复方地芬诺酯(10mg/kgBW)，空白对照组给蒸馏水。给复方地芬诺酯0.5小时后，空白对照组和模型对照组小鼠用墨汁灌胃，低、中、高剂量组给予含受试样品的墨汁(含5％的活性炭粉、10％阿拉伯树胶)，动物均单笼饲养，正常饮水进食。从灌墨汁开始，记录每只动物首粒排黑便时 间、5小时内排黑便粒数及重量及粪便含水率。

表7 长双歧杆菌BBMN68对便秘老鼠首次排便时间、颗粒、重量及粪便含水量的影响

与模型组对比，^*p＜0.05；

与空白对照组比较，模型组动物首次排黑便时间、排便颗粒和排便重量显著性差异，说明便秘小鼠模型成立。不同剂量长双歧杆菌BBMN68菌液均缩短了便秘小鼠的首次排便时间，增加小鼠排便颗粒和粪便重量，尤其是中剂量组样品，对便秘小鼠的润肠通便功能最强，作用效果优于阳性对照菌株。各组实验小鼠粪便水分含量无显著差异。

实施例8 长双歧杆菌BBMN68菌株毒力试验

(a)实验材料

菌株：长双歧杆菌BBMN68菌株

稀释液：微生态检测用稀释液；固体培养基：BBL琼脂；液体培养基：BBL液体培养基

实验动物：选用中国医学科学院实验动物研究所繁殖的健康成年清洁级昆明小鼠(许可证编号为SCXK(京)2004-0001)80只，雌雄各半，雄性小鼠体重范围18.4-21.6g，20.3±0.8g；雌性小鼠体重范围18.6-21.6g，20.2±0.8g。在中国疾病控制中心营养与食品安全所动物房(许可证编号为SYXK(京)2003-0006)饲养。

(b)试验方法

培养物制备

将送检的长双歧杆菌BBMN68转种BBL琼脂培养基，经菌种鉴定后，挑取单个菌落转种BBL液体培养基中，置36±1℃厌氧培养48±2h后，作为培养物原液备用，取部分培养物原液常温下浓缩5倍，作为培养物5倍浓缩液备用。

活菌计数

无菌吸取上述培养物原液1.0mL，加入9.0mL无菌稀释液中混匀，并进行10倍递增稀释，选取合适的2-3个稀释度，吸取0.1mL稀释液分别涂布于BBL琼脂平板上，每个稀释度2块平板，置36±1℃厌氧培养48±2h，计数。

小鼠毒力试验

小鼠80只，雌、雄各半。分别随机分为4组计量组设置为：培养物原液组、培养基原液空白对照组、培养物5倍浓缩物组、培养基5倍浓缩液空白对照组。将受试物以20mL/Kg BW的剂量给小鼠灌胃，连续灌胃3d，观察7d，记录实验过程中小鼠的体重变化、中毒表现及死亡情况。

(c)实验数据统计

用SPASS11.5软件对各实验原始数据进行方差齐性检验，满足“方差齐”要求的数据资料用两样本均数比较的t检验进行统计处理；对方差不齐的数据资料用t’检验进行统计处理。

表8 长双歧杆菌BBMN68培养物原液中活菌计数

由表8可见，培养物原液中含长双歧杆菌BBMN68活菌数为1.8×10⁸cfu/mL。

表9 长双歧杆菌BBMN68培养物对雄性小鼠体重的影响(X±SD)

由表9可见，雄性小鼠的初始体重和终体重在培养组与其相应的对照组间比较，均无统计学意义(p＞0.05)；即在试验期间，长双歧杆菌BBMN68培养物对雄性小鼠的体重无影响。

表10 长双歧杆菌BBMN68培养物对雌性小鼠体重的影响(X±SD)

由表10可见，雌性小鼠的初始体重和终体重在培养组与其相应的对照组间比较，均无统计学意义(p＞0.05)；即在试验期间，长双歧杆菌BBMN68培养物对雌性小鼠的体重无影响。

表11 长双歧杆菌BBMN68活菌对小鼠毒性作用情

由表11可见，以20.0mL/kg BW长双歧杆菌BBMN68菌种培养物(原液和5倍浓缩液)，对小鼠连续灌胃3d，观察7d，未见受试小鼠有毒性反应或死亡。

长双歧杆菌BBMN68于BBL液体培养基中，36±1℃置36±1℃厌氧培养48±2h，计数培养基中活菌数为1.8×10⁸cfu/mL，将培养物的原液和5倍浓缩液，经口以20.0mL/kg BW给受试小鼠连续灌胃3d，观察7d。试验设培养基原液和5倍浓缩液对照组。试验结果表明：长双歧杆菌BBMN68的BBL培养物原液和5倍浓缩液组与各自对照组相比，对小鼠体重增长的无统计学意义(p＞0.05)，同时未观察到受试小鼠有毒性反应或死亡。

实施例9 含长双歧杆菌BBMN68的食品组合物

该食品组合物的配方如下：

原料	原料要求	添加量
			白砂糖		50-100克
稳定剂YO825	来自丹尼斯克	3-8克
			长双歧杆菌BBMN68	冻干菌粉和培养液	105-1010CFU/mL
鲜牛奶	符合国家《生鲜牛乳收购标准》	定容至1000克

1.工艺流程

采用本领域的常规方法制备含长双歧杆菌BBMN68的食品组合物。简要地，所述方法包括如图1所示流程。

2.工艺要点说明

2.1配料

2.1.1在配料罐中调入适量牛奶，牛奶的量淹没搅拌叶，调奶过程搅拌不可开启，调奶结束后开启搅拌，原奶温度小于10℃。

2.1.2牛奶不用升温，将白砂糖、稳定剂、胶原蛋白和抗氧化物的原料混合均匀后，加入循环的牛奶中，配料时搅拌开启。

2.1.3配料完成后，停止循环，直接进行顶管操作.

2.2定容

2.2.1按配方进行定容，定容结束后搅拌1min，取样检测。

2.2.2水合20min，检测合格后进行下一步工序。定容后料液酸度小于180T，巴杀过程中开启定容罐的搅拌。

2.3预热温度：60℃-65℃。

2.4脱气温度：60℃-65℃；压力：-90-80KPa。

2.5均质压力：150-170bar。

2.6杀菌温度：95±3℃；时间：300秒。

2.7冷却冷却至42±1℃。

2.8接种、发酵：当料液进入发酵罐1/3时，启动搅拌，待进料结束后继续搅拌10-15分钟；停止搅拌，开始计时发酵。要求：(1)对操作工的要求，剪短指甲，戴口罩；(2)接种时先将手，菌种袋以及菌种添加系统口周围用75％的酒精喷雾消毒，再用明火消毒；

2.9发酵酸度测定：发酵4.0小时后，开始测酸，到达终点后及时破乳、打冷。

2.10打冷、检测：将发酵奶全部打入贮罐冷却至20±2℃，搅拌15-100的秒后，及时灌装。

2.11灌装：酸奶贮罐中的料液12小时内(自冷却完毕开始计时)灌完。

2.12入库：产品在2小时内入库，并在2-6℃的冷库中放置12小时以上。

2.13出库：检测合格后出库。

2.14在运输和销售过程中必须确保冷链配置(2-6℃)

其中，所有的温度指料液温度而非设定温度。

实施例10 含长双歧杆菌BBMN68的食品组合物

该食品组合物的配方如下：

原料	原料要求	添加量
			白砂糖		50-100克
稳定剂YO825	来自丹尼斯克	3-8克
			长双歧杆菌BBMN68	冻干菌粉和培养液	105-1010CFU/mL
果粒及其他原料	符合相应国家标准	20-200克
			鲜牛奶	符合国家《生鲜牛乳收购标准》	定容至1000克

1.工艺流程

采用本领域的常规方法制备含长双歧杆菌BBMN68的食品组合物。简要地，所述方法包括如图1所示流程。

2.工艺要点说明

2.1配料

2.1.1在配料罐中调入适量牛奶，牛奶的量淹没搅拌叶，调奶过程搅拌不可开启，调奶结束后开启搅拌，原奶温度小于10℃。

2.1.2牛奶不用升温，将白砂糖、稳定剂、胶原蛋白和抗氧化物的原料混合均匀后，加入循环的牛奶中，配料时搅拌开启。

2.1.3配料完成后，停止循环，直接进行顶管操作.

2.2定容

2.2.1按配方进行定容，定容结束后搅拌1min，取样检测。

2.2.2水合20min，检测合格后进行下一步工序。定容后料液酸度小于180T，巴杀过程中开启定容罐的搅拌。

2.3预热温度：60℃-65℃。

2.4脱气温度：60℃-65℃；压力：-90-80KPa。

2.5均质压力：150-170bar。

2.6杀菌温度：95±3℃；时间：300秒。

2.7冷却冷却至42±1℃。

2.8接种、发酵：当料液进入发酵罐1/3时，启动搅拌，待进料结束后继续搅拌10-15分钟；停止搅拌，开始计时发酵。要求：(1)对操作工的要求，剪短指甲，戴口罩；(2)接种时先将手，菌种袋以及菌种添加系统口周围用75％的酒精喷雾消毒，再用明火消毒；

2.9发酵酸度测定：发酵4.0小时后，开始测酸，到达终点后及时破乳、打 冷。

2.10打冷、检测：将发酵奶全部打入贮罐冷却至20±2℃，搅拌15-100的秒后，及时灌装。

2.11灌装：酸奶与果粒及其他添加原料混合，要求贮罐中的料液12小时内(自冷却完毕开始计时)灌完。

2.12入库：产品在2小时内入库，并在2-6℃的冷库中放置12小时以上。

2.13出库：检测合格后出库。

2.14在运输和销售过程中必须确保冷链配置(2-6℃)

其中，所有的温度指料液温度而非设定温度。

上文所列出的一系列的详细说明仅仅是针对本发明的可行性实施例的具体说明，它们并非用以限制本发明的保护范围，凡未脱离本发明技艺精神所作的等效实施例或变更均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (5)

1.一种长双歧杆菌，其特征在于，它是长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)BBMN68，菌种保藏号是CGMCC No.2265。

2.一种食品组合物，其特征在于，它含有作为有效成分的如权利要求1所述的长双歧杆菌和食品学上可接受的载体。

3.如权利要求2所述的食品组合物，其特征在于，它含有作为有效成分的如权利要求1所述的长双歧杆菌的绝对数量为10³～10¹¹CFU/mL。

4.如权利要求2所述的食品组合物，其特征在于，所述食品组合物为冻干粉、胶囊、颗粒剂、片剂、含片、口服液、饮料或其他合适的形状。

5.如权利要求2所述的食品组合物，其特征在于，所述组合物是酸奶。

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