CN101538545B - 一种唾液乳杆菌及其食品组合物 - Google Patents

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Abstract

一种唾液乳杆菌，该唾液乳杆菌对酸、胆盐和消化液具有良好的耐受性，并具有免疫刺激功能。所述唾液乳杆菌在pH 2.0-3.0的酸性溶液中培养2小时，或在0.05-1.5％胆盐浓度的培养液中培养24小时，仍有大量存活。本发明还提供了包含有所述唾液乳杆菌的组合物尤其是一种食品组合物。本发明的唾液乳杆菌具有免疫刺激功能，包含该菌的食品组合物便于食用，并具有保健功效。

Description

一种唾液乳杆菌及其食品组合物
技术领域
本发明主要涉及微生物技术领域，具体涉及一种新型益生菌和包含该益生菌的食品组合物，尤其是一种唾液乳杆菌和包含该唾液乳杆菌的食品组合物。
背景技术
口腔是人体与外界相通的重要部位，空气在这里进出，营养和病菌也从口进入。影响口腔微生物组成的三个因素是：营养、氧化还原电势和黏附力。口腔微生物的生态环境是唾液。唾液中含有丰富的营养，其中有机物(包括糖、氨基酸、维生素、氨和尿素等)占0.5％，无机盐占0.2％，水分占99％以上。唾液中的微生物大部分是链球菌，在唾液和牙龈缝中的乳杆菌不到1％，含有少量的肠球菌。口腔中发现的乳酸菌有：唾液链球菌、缓症链球菌、血液链球菌、变形链球菌、肠球菌、干酪乳杆菌、嗜酸乳杆菌、唾液乳杆菌、埃氏唾液乳杆菌、齿唾液乳杆菌等。年龄对口腔微生物的种类和数量影响较大。一般情况下婴幼儿口腔中的细菌数很少，或是过路菌，唾液乳杆菌虽然只占2％，但是它是人体口腔中的唯一的常住菌。
对于人体的消化系统，消化道又包括食道、胃、小肠、结肠、回肠、大肠、肛门，全长达10m，表面积非常大，人体生长、维持生命需要的能量和营养全部在这里获得。有益细菌在肠道内帮助人体消化食物，将食物转化成人体本身不能合成的营养。人体消化道内细菌总数达1014个，有400-500个种和亚种。从粪便的细菌中分离到的乳酸菌中有唾液乳杆菌，嗜酸乳杆菌等。因此，唾液乳杆菌从入口到肠道的整个消化系统都具有很重要的作用。
唾液乳杆菌是人体和动物体内广泛存在的乳杆菌，很少有唾液乳杆菌引发各种疾病的报道，一些研究报道了唾液乳杆菌的生理活性功能，包括抑菌功能，黏附功能和免疫调节功能等，以期将唾液乳杆菌作为人类和动物的益生菌使用。
由于环境中多环芳烃化合物的不完全燃烧和氮的氧化，硝基芳烃在自然 界中广泛存在。许多硝基芳烃化合物能够在细菌和哺乳动物细胞中诱导基因突变。4-硝基喹啉-1-氧化物(4-Nitroquinolin 1-oxide，简称4-NQO)属硝基芳烃，是一种很强的化学诱变剂和致癌物质，能直接对DNA链产生剪切作用并形成电子转移加合物。哺乳动物细胞中的酶将4-NQO代谢为4-羟氨基喹啉(4-HAQO)，4HAQO直接与DNA链形成电子转移加合物造成基因毒性，是4-NQO基因毒性的直接作用形式。4-NQO向4-HAQO的转化过程是普遍存在的，这一步反应是造成原核细胞及真核细胞基因毒性的关键物质，将4-HAQO迅速转化是脱除基因毒性的关键步骤。本发明的唾液乳杆菌菌株能够将4-HAQO迅速转化成其它物质，从而起到脱基因毒性的效果。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型益生菌，该益生菌来源于人体健康肠道，对酸、胆盐、消化液具有良好的耐受性，对肠道上皮细胞有黏附力，并具有免疫调节功能和脱除基因毒性物质4-NQO基因毒性的功能。
本发明的另一目的是提供一种包含有上述益生菌的组合物，尤其是一种包含上述益生菌的食品组合物，以供消费者方便的食用，同时具有调节免疫功能的作用。
本发明提供了一种唾液乳杆菌，该唾液乳杆菌对胃液、消化液有良好的耐受性，并对个体具有免疫刺激功能和脱除基因毒性物质4-NQO基因毒性的功能。本发明的唾液乳杆菌在pH 2.0-3.0的酸性溶液中培养2小时，或在0.05-1.5％胆盐浓度的培养液中培养24小时，仍有大量存活。优选的，该唾液乳杆菌是FDL89(Lactobacillussalivarius)菌株，该菌株于2007年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC 2263，或其衍生菌株。
本发明还提供了包含本发明的所述唾液乳杆菌的组合物。
在一具体实施方式中，所述组合物是食品组合物，该组合物还含有食品学上可接受的载体。在另一实施方式中，该食品组合物包含105-1010CFU/mL的本发明所述的唾液乳杆菌和食品学上可接受的载体。
另一方面，本发明提供了用本发明所述的唾液乳杆菌制备的纯培养物。在一具体实施方式中，制备该纯培养物所用的培养基是牛奶。在另一实施方式中，该培养基还包含糖和稳定剂，其中，糖50-100克/升，稳定剂3-8克/ 升，添加了105-1010CFU/毫升本发明所述的唾液乳杆菌的冻干菌粉或新鲜培养液，且其中该稳定剂是本领域公知的常规稳定剂。在又一实施方式中，上述纯培养物是牛奶制品或牛奶发酵制品。
又一方面，本发明提供了制备牛奶纯培养物的方法，其包括如下步骤：1)配料；2)定容；3)均质；4)杀菌；5)冷却后接种发酵；6)测酸后打冷、检测；7)灌装；其中，步骤5)中使用本发明所述的唾液乳杆菌。在一具体实施方式中，上述步骤1)中的配料方法如下：将50-10克糖，3-8克稳定剂混合后用牛奶定容到1000毫升；上述步骤5)中以冻干菌粉或新鲜培养液以105-1010CFU/mL的浓度接入到原料混合物，在40-42℃下发酵。在又一具体实施方式中，上述步骤2)和3)之间还包括步骤2.1)水合20分钟；步骤2.2)在60℃-65℃下预热；步骤2.3)在温度60℃-65℃和压力-90-80Kpa下脱气。在又一具体实施方式中，上述步骤6)为将发酵奶全部打入贮罐冷却至20士2℃，搅拌15-100秒后，及时灌装。
本发明还提供了本发明的所述唾液乳杆菌或其组合物在食品工业或制备调节免疫力的生物制剂中的应用。
附图说明
以下附图仅旨在于对本发明做示意性说明和解释，并不限定本发明的范围。其中，
图1显示的是唾液乳杆菌FDL89各剂量处理对小鼠体重的变化影响；
图2显示的是唾液乳杆菌L.salivarius FDL89与4-NQO共培养过程的HPLC图谱；
图3显示的是不同浓度唾液乳杆菌L.salivarius FDB89与4-NQO共培养液的HPLC图谱；
图4显示的是唾液乳杆菌L.salivarius FDB89与4-NQO共培养转化产物的质谱分析图。
图5显示的是制备一种含有本发明的唾液乳杆菌的食品组合物的流程图。
具体实施方式
为了对本发明的技术特征、目的和效果有更加清楚的理解，现对照附图说明本发明的具体实施方式。其中，相同的部件采用相同的标号。
本发明人经多次筛选和培育，从长寿之乡巴马瑶族自治县的长寿老人粪便中分离得到一株唾液乳杆菌FDL89(Lactobacillussalivarius)，该菌株对酸、胆盐、消化液具有良好的耐受性能，具有体外脱除4-NQO基因毒性的功能，经动物实验证明，对试验小鼠具有免疫刺激作用和调节肠道微生物菌群的功能。唾液乳杆菌FDL89于2007年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC 2263。
本发明所述的唾液乳杆菌应理解为包括唾液乳杆菌FDL89，以及衍生自该唾液乳杆菌FDL89的菌株，尤其是具有耐酸、耐胆盐及消化液，具有体外脱除4-NQO基因毒性功能，对试验动物具有免疫刺激功能的菌株。唾液乳杆菌FDL89的基本生物学特性与已知的该种属的典型微生物基本相同，不同在于本发明微生物具有耐酸、耐胆盐、体外脱除4-NQO基因毒性及调节免疫作用。
具体而言，耐酸性能试验证明，本发明的唾液乳杆菌FDL89在pH 2.0-3.0的酸性溶液中培养2小时，仍存在大量的活菌数。
耐胆盐性能试验证明，本发明的唾液乳杆菌FDL89沉在含0.05-0.3％胆盐浓度的培养液中生长性能良好。能耐受0.3-1.5％胆盐浓度，在1.5％胆盐浓度培养24小时，仍存在大量的活菌数。
通过SOS显色反应评价本发明的唾液乳杆菌FDL89菌株脱除4-NQO基因毒性的能力。实验证明，本发明的唾液乳杆菌FDL89菌株的基因毒性脱除率为92.91％。
通过高效液相色谱法和质谱法研究唾液乳杆菌FDL89对4-NQO的转化过程。实验证明，唾液乳杆菌FDL89菌株首先将4-NQO转化为直接毒性4-羟氨基喹啉(4-HAQO)，随后将4-HAQO转为为无毒的4-氨基喹啉(4-AQ)，同时产生少量的4-氨基喹啉-N-氧化物(4-AQO)。
动物试验证明，本发明的唾液乳杆菌显著提高动物体淋巴细胞的转化能力、巨噬细胞的吞噬活性以及自然杀伤细胞(NK细胞)的活性，能提高动物血清对免疫刺激产生抗体的能力。这表明本发明的唾液乳杆菌FDL89对动物体具有显著的免疫刺激功能。试验还证明，发挥免疫刺激功能的活菌浓度为105-1010CFU/mL。因此，本发明的唾液乳杆菌可作为有效成分，用于提高人体的免疫力。
本发明还提供了一种含有本发明的唾液乳杆菌FDL89作为有效成分的食 品组合物。食品组合物可以为固态(如冻干粉、胶囊、颗粒剂、片剂、含片)或液体(如口服液、饮料)或其他合适的形状。在食品组合物中，本发明的微生物含量通常为组合物的1-99％，绝对数量为105-1010CFU/mL。下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。
实施例1从健康长寿老人粪便中提取的唾液乳杆菌FDL89
中国广西巴马瑶族自治县是闻名于世的长寿之乡，1991年11月1日，在日本东京召开的国际自然医学会第13次会议上，正式确认为世界第五长寿之乡。巴马瑶族自治县甲篆乡是该县的长寿带，2005年人口普查甲篆乡全乡人口25115人，其中百岁老人21人。本发明人于2006年，以巴马县甲篆乡90岁以上的老人为对象，针对老人的身体健康状况、生活习惯、饮食卫生情况等进行问询，采集身体健康，1年以上不服用药物的健康长寿老人的粪便样品，用灭菌蛋白栋水保存新鲜粪便，4℃冷藏，在4小时之内运送至实验室，完成样品处理和培养。以无菌玻棒将粪便样品捣碎，震荡均匀，取1mL样品溶液，加入9mL灭菌稀释液，按十倍稀释法将样品稀释至108，取104-1010稀释度溶液1mL于无菌培养皿中，倒入NPNL双歧杆菌选择性琼脂培养基，充分混匀后冷却凝固，放入厌氧袋中，37℃厌氧培养48-72小时。经多次筛选和培育，得到唾液乳杆菌FDL89的纯培养物。
唾液乳杆菌FDL89(Lactobacillussalivarius)，2007年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，菌种保藏号CGMCC 2263。
实施例2唾液乳杆菌FDL89对胃液和肠液的耐受性
人工胃液：
NaCl 0.2g/100mL、胃蛋白酶(pepsin)0.32g/100mL，用浓度为1mol/L的HCl调整pH值为2.0、3.0，过滤除菌备用。
人工肠液：kH2PO4 0.68g/100mL、胰蛋白酶(Trypsin)0.1g/100mL，0.3％牛胆盐，pH 7.5
耐受性测定：
将培养液经离心(3600r/min，10min)收集菌体，用灭菌生理盐水离心洗涤2次，将其菌体悬浮于5mL灭菌生理盐水中制成菌悬液。然后菌悬液各 1mL分别接种于含9mL过滤除菌处理的pH值为2.5的人工胃液中，并在37℃培养，在开始(0h)和培养0.5、1、2h分别取样，测定其活菌数。然后取在人工胃液中消化2h后的培养液1mL，分别接种于9mL过滤除菌的pH值为7.5的人工肠液中，继续置37℃下厌氧培养，并分别在0、3、6h测定活菌数：
Figure G2009101315830D00061
实施例3唾液乳杆菌FDL89的免疫调节功能
受试菌：
唾液乳杆菌FDL89：分离自广西巴马长寿老人粪便，经鉴定为Lactobacillussalivariussubsp.salivarius，2007年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(菌种保藏号CGMCC 2263)。
实验动物：
Balb/c雌性小鼠：6～8周龄，体重18～22g，SPF级，购自北京维通利华实验动物技术有限公司。
试剂与设备
试剂：RPMI 1640培养基干粉：Gibco公司；青霉素(PenicillinGSodiunSalt)、链霉素(StreptomycinSulfate)、Hepes、丙酮酸钠(PyruvicAcid)、PMS、硝基氯化四氮唑(INT)等：Amresco公司；MTT：Promega公司；刀豆球蛋白A(ConA)、DL-乳酸锂Sigma公司；氧化型辅酶I(NAD)：Roche公司；胎牛血清(FBS)：PAA公司；绵羊红细胞(SRBC)：北京大学医学部动物中心；鸡红细胞(CRBC)：中国农业大学动物医学院；K562细胞：中国协和医科大学；补体、都氏试剂、Giemsa染料：中国医学科学院药用植物研究所；培菲康(国药准字S10950032；产品批号20071104，每粒(210mg)含活菌数不低于1.0×107CFU/mL)：上海医药(集团)有限公司信谊制药总厂；其余试剂均为分析纯。
设备：生物培养箱；CO2细胞培养箱(NAPCO)；倒置显微镜(CK2，日本产)；YJ-875型超净工作台：苏州净化设备厂；μQuant连续波长酶标仪(Bio-tec)；CS-15R低温离心机Bechman公司；96孔细胞培养板Costar公司；微量振荡器(WZ-2A)；细胞计数板。
实验动物分组及处理：
Bal/C小鼠随机分组，空白组每只灌服脱脂乳0.2mL/d；阳性对照组每只灌服培菲康胶囊药液(28mg/mL)0.2mL/d；低剂量、中剂量、高剂量组每天分别灌服1×106、1×108、1×1010CFU/mL的受试菌。灌胃4周，25℃饲养，自由饮水采食，每周换两次垫料，每周称一次体重。在处死前5d腹腔注射0.5mL2％的绵羊红细胞(SRBC)致敏。
检测项目：
1.绵羊红细胞(SRBC)诱导的迟发型变态反应(DTH)
实验动物处死前一天用游标卡尺测量左后足趾部厚度，在测量部位皮下注射20％的SRBC每只20μl，24h后再次测量左后足趾部厚度，同一部位多次测量取平均值。以攻击前后的足趾厚度差值来表示DTH的厚度。
2.滴片法测定巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬率
常规分离小鼠腹腔细胞液，细胞液与1％鸡红细胞等体积混和，加入胎牛血清使其终浓度为10％。混合细胞液滴加到用3％琼脂封闭边缘的玻片封闭圈内，37℃培养20min，结束后迅速用生理盐水将未贴壁细胞冲掉，于甲醇液中固定1min，Giemsa液染色15min，蒸馏水冲洗干净，晾干。用40×显微镜计数吞噬率(每100个巨噬细胞中吞噬鸡红细胞的巨噬细胞所占的百分比)。
3.乳酸脱氢酶(LDH)法测定自然杀伤细胞(NK细胞)活性
靶细胞(K562)传代培养，使用前洗涤、调整细胞浓度为4×105个/mL。制备小鼠脾细胞，用无菌水轻晃20秒以裂解红细胞，立即加入2×hank’s液恢复原液压，再次洗涤后调整细胞浓度为2×107个/mL。反应孔取靶细胞(K562)和效应细胞(脾细胞)各100μl加入96孔板中；靶细胞自然释放孔加入靶细胞和培养基各100μl；靶细胞最大释放孔加入靶细胞和2.5％Triton各100μl。上述各项均设3个平行孔，于37℃培养4h后吸取上清100μl于新的培养板中，加入LDH基质液(DL-乳酸锂5×10-2mol/L，硝基氯化四氮唑(INT)6.6×10-4mol/L，PMS2.8×10-4mol/L，氧化型辅酶I(NAD)1.3×10-3mol/L，溶于Tris-HCL(0.2mol/L，pH8.2)，需现用现配)100μl/孔，室温反应10min后每孔加入1 mol/lHCL30μl，在酶标仪490nm处测OD值。
4.血清半数溶血值(HC50)
小鼠摘除眼球取血收集血清，血清临用前用生理盐水稀释500倍，补体稀释10倍。将稀释后的血清0.5mL至于试管内，依次加入10％SRBC0.25mL，补体0.5mL，空白对照管用生理盐水0.5mL代替血清。置37℃恒温水浴中保温30min，冰浴终止反应。2000r/min离心10min，取上清0.5mL，加入都氏试剂1.5mL；同时取10％SRBC 0.125mL，加都氏试剂至2mL作为半数溶血对照，充分混匀。放置10min后，以空白对照管作为空白，于540nm处测定各管光密度值。
5.T淋巴细胞转化增殖
无菌取出脾，置于盛有适量无菌Hank’s液(含5％胎牛血清，1％双抗)的小平皿中，用眼科手术剪轻轻将脾剪碎，用注射器内芯将脾磨碎，制成单细胞悬液，经200目筛网过滤，用无菌吸管将细胞悬液吸入10mL离心管。用Hank’s液洗3次，每次离心10min(1800r/min)。用添加了10％胎牛血清，1％双抗的完全RPMI-1640培养液调整小鼠脾细胞密度为2×106/mL。
于96孔细胞培养板中加入脾细胞悬浮液，每孔0.1mL，再加入含有或不含有ConA的完全RPMI-1640培养液，每孔0.1mL。每只小鼠设空白对照孔和试验孔各设5个重复孔，空白对照孔不含ConA，试验孔ConA终浓度为1.5μg/mL。将96孔细胞培养板放入37℃，5％CO2饱和湿度培养箱中培养。72h后，每孔吸弃上清70μL，加入20μL MTT显色液(5mg/mL)，37℃显色4h，加入细胞裂解液0.1mL，37℃过夜。用酶标仪于570nm下测定OD值。刺激率＝(试验孔OD值-对照孔OD值)/对照孔OD值
6.体重变化
每周测定各组小鼠的体重一次，记录小鼠生长状况。
7.实验数据统计
实验数据结果采用X±SD表示，SPSS13.0统计软件做方差分析和t-检验。
结果如表1所示：
唾液乳杆菌FDL89
Figure G2009101315830D00091
表1FDL89不同剂量处理对小鼠免疫指标的影响
*：p＜0.05；**p＜0.01
(1)迟发型变态反应(DTH)——足趾增厚法
唾液乳杆菌FDL89各剂量处理组小鼠的足趾厚度差均显著高于对照组(p＜0.01)，其中低剂量的作用效果显著高于中剂量，中剂量和高剂量之间差异不显著。(见表1)
(2)巨噬细胞吞噬鸡红细胞实验
唾液乳杆菌FDL89的低剂量和中剂量的吞噬率显著高于对照组(p＜0.05)，其中中剂量的效果极显著(p＜0.01)，显著高于低剂量。(见表1)
(3)自然杀伤细胞活性
唾液乳杆菌FDL89高剂量的反应吸光值显著高于对照组(p＜0.05)。(见表1)
(4)血清溶血值
唾液乳杆菌FDL89各剂量处理组小鼠的HC50值显著高于对照组(p＜0.01)，各剂量组之间差异不显著。(见表1)
(5)T淋巴细胞的体外转化增殖
唾液乳杆菌各剂量对淋巴细胞体外转化增殖能力的促进作用不明显，各剂量组与对照组差异不显著(p＜0.05)，各剂量之间差异也不显著。(见表1)
(6)喂养过程中小鼠体重的变化
唾液乳杆菌FDL89各剂量处理对小鼠体重的变化影响不显著(p＜0.05)。(见图1)
结论
唾液乳杆菌FDL89活菌能够显著促进小鼠致敏淋巴细胞增殖能力，提高腹腔巨噬细胞的吞噬能力，增强自然杀伤细胞的杀伤活性，增强血清中溶血 素抗体的产生能力；体外对淋巴细胞的增殖促进作用不显著。在受试过程中，对小鼠体重变化影响不显著，不影响小鼠的正常生长状况。
实施例4唾液乳杆菌脱除基因毒性功能
(一)材料与方法
受试菌：唾液乳杆菌FDL89：分离自广西巴马长寿老人粪便，经鉴定为Lactobacillussalivariussubsp.salivarius，2007年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(菌种保藏号CGMCC 2263)。干酪乳杆菌、鼠李糖乳杆菌(分离至商业化乳制品，经16S rDNA序列同源性鉴定)
SOS显色反应试剂：
M63培养基：琼脂15g，KH2PO4 13.6g，(NH4)2SO4 2g，FeSO4.7H2O0.5mg，MgSO4.7H2O 0.2g/L蒸馏水，用KOH调节pH值为7。
SOS点实验中无转化活性的STA培养基：乳糖(20％)2ml，葡萄糖(20％)0.5ml，色氨酸(1％)2ml，苏氨酸(1％)2ml，组氨酸(1％)2ml，尿嘧啶(1％)2ml，硫胺素(1％)2ml，氨苄青霉素(10mg/ml)2ml，X-gal(20mg/ml DMSO)2ml过滤除菌，加到1L M 63培养基中。
SOS指示菌E.coli PQ37培养基
LB培养基：胰蛋白胨10g，酵母粉5g，氯化钠10g，配成1L溶液，pH 7.2；
La培养基：L培养基加20μg/ml的氨苄青霉素。
SOS显色反应的缓冲溶液和试剂
B缓冲液：Na2HPO3 16.1g，NaH2PO3·H2O 5.5g，KCl 0.75g，MgSO·7H2O 0.25g，SDS 1g，β-巯基乙醇2.7ml，用蒸馏水配成1L溶液，pH调至7。
P缓冲液：羟甲基氨基甲烷(C4H11NO3)：121g，SDS 1g，用蒸馏水配成1L溶液，用盐酸调pH至8.8。
ONPG(4mg/ml)：400mg ONPG加到100ml的pH 7buffer中。
pH 7buffer：61ml 0.1M Na2HPO3·7H2O，39ml 0.1M NaH2PO3·H2O。
PNPP溶液(4mg/ml)：400mg PNPP加到100ml P buffer。
4-NQO用DMSO配成1mg/ml的贮液，-20℃冻存，用时以水稀释。
SOS显色反应标准程序：
指示菌的活化：取0.05ml冻存的E.coli PQ 37甘油菌接入5ml La培养基中，37℃振荡，过夜培养。
取0.1ml指示菌的过夜培养液加到5ml La培养基中，37℃震荡(200rpm)培养2h左右，使菌数达到2×108CFU/ml。取1ml菌液到9ml新鲜的L培养基中进行下一步反应。取0.6ml该溶液到EP管中，加待测化合物(4-NQO)，37℃震荡培养2h。将0.6ml上述菌液平均分到两个EP管中，3000g 2min离心，生理盐水洗涤，菌体沉淀重悬至0.3ml B缓冲液(X-系列)或P缓冲液(Y-系列)中，分别进行β-半乳糖苷酶反应和碱性磷酸酶反应，两个反应可以同时做。
β-半乳糖苷酶反应：X-系列管中加2.7ml B缓冲液，37℃保温5-10min。每管加0.6ml 4mg/ml ONPG溶液，反应10-90min，加2ml 1mol/L的NaCO3终止反应。可以根据具体情况调整反应时间使A420的时间在0.1～0.4。以无指示菌的阴性对照为空白读A420的值。
碱性磷酸酶反应：Y-系列管中加2.7ml P缓冲液，37℃保温5-10min。每管加0.6ml 4mg/ml PNPP溶液，反应10-90min，加1ml 2.5mol/L的HCl终止反应，此时颜色消失。放置5min，加1ml 2mol/L tris(hydroxymethy)aminomethane使颜色恢复，恢复的颜色在几小时内保持稳定。可以根据具体情况调整反应时间使A420的值在0.1～0.4。以无菌阴性对照为空白读A420的值。结果表达公式(1)：
酶活性U＝1000×A420/t                 (1)
式中A420是420nm处的读数，t是底物(ONPG或PNPP)的保温时间。
在蛋白合成受抑制时，化合物对sfi A基因的诱导可以用β-半乳糖苷酶与碱性磷酸酶的比值R反映(公式2)。
其中tB、A420B以及tP、A420P分别代表β-半乳糖苷酶和碱性磷酸酶的反应时间t及相应时间A420的值。
为了便于不同实验之间尤其是不同实验室之间进行比较，引出了SOS诱导因子(IFsos)的概念。诱导因子是浓度为c时的R值R(c)与浓度为0时R值R(0)的比值(公式3)。
IFsos＝R(c)/R(0)                  (3)
唾液乳杆菌脱基因毒性作用检测方法：
乳酸菌MRS的过夜培养液，离心(6000g，5min)，以生理盐水洗涤，菌体沉淀重悬在生理盐水中至终浓度为108-109CFU/ml(OD600为1.0左右)，取5ml菌悬液加4-NQO贮液，使其终浓度在20mg/L，制成乳酸菌与4-NQO共培养液，在37℃200rpm条件下震荡180min培养。共培养后离心(6000g，15min)，取上清液以0.45μm滤膜过滤，取过滤液备用。SOS显色反应测定过滤上清液残余的基因毒性活性。同时以生理盐水做阴性对照，以不加乳酸菌的4-NQO做阳性对照。
残余基因毒性(％)＝(IFX-1)/(IF4-NQO-1)×100           (1)
脱基因毒性(％)＝1-残余基因毒性(％)                   (2)
IF4-NQO：阳性对照4-NQO(20mg/L)的IF值；
IFX：共培养物上清液的IF值；
1：阴性对照生理盐水的IF值。
(二)结果
结果如下：
表2唾液乳杆菌株抑制4-NQO基因毒性的能力
Figure G2009101315830D00121
结论：
应用SOS显色反应评价了长寿老人源唾液乳杆菌脱除4-NQO基因毒性的能力。4-NQO(终浓度为20mg/L)与待测菌(108-109CFU/ml)37℃共培养180min后，唾液乳杆菌FDL89菌株脱基因毒性能力最强，基因毒性脱除率为92.91％。
实施例5唾液乳杆菌脱除基因毒性过程研究
(一)材料与方法
试验菌株：唾液乳杆菌FDL89：分离自广西巴马长寿老人粪便，经鉴定为Lactobacillussalivariussubsp.salivarius，2007年11月26日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(菌种保藏号CGMCC 2263)。
试验方法：
菌株活化：乳酸菌甘油冻存管以1％(V/V)的接种量接入MRS培养基，在螺口管厌氧条件下37℃培养24h，活化两代备用。
脱基因毒性过程研究：待测菌株在最适培养条件下过夜培养，以6000g的离心力离心5min，所得菌体沉淀用生理盐水洗涤，再次离心，将洗涤后的菌体重悬在生理盐水中制成菌悬液。取一定菌悬液加4-NQO贮液配制菌体4-NQO共培养物，菌体浓度109-1010CFU/ml，4-NQO终浓度为20mg/L。共培养物在厌氧避光条件下震荡培养(37℃，200rpm)3h。共培养物离心(6000g，5min)，取上清液以0.45μm滤膜过滤，制成无菌共培养液，进行紫外扫描和HPLC分析。
HPLC-MS分析方法：唾液乳杆菌L.salivarius FDB89与4-NQO共培养液经4℃冷藏36h后，用HPLC-MS分析。HPLC洗脱液A为超纯水(0.1％TFA)；洗脱液B为甲醇，采用梯度洗脱程序5-35min，10％～80％B。紫外检测器355nm波长检测。
电喷雾电离源(ESI)，喷射电压：3.50kV；正离子模式，干燥气(N2)流速为6.0L/min，温度为350℃，毛细管输出电压：3500V。离子扫描范围：100-1000m/z。质谱分析结果借助仪器附带的软件进行处理。
(二)结果
伴随着脱基因毒性过程，唾液乳杆菌将4-NQO转化为其它的化合物。应用HPLC方法研究了唾液乳杆菌FDL89菌株与4-NQO的共培养液过程的HPLC图谱变化。L.Salivarius FDB89在浓度为2×109CFU/mL，与4-NQO共培养液随时间的变化的HPLC图见附图2。其中，共培养时间为：(A)0h；，(B)1h，(C)2h，(D)3h。图中：峰4为4-NQO，峰1，2，3为转化产物。经过3个小时的共培养，4-NQO峰面积降低，HPLC图谱上又出现了3个产物峰，作为对照，L.salivarius FDB89在MRS培养基中培养12小时培养液的HPLC图谱中没有出峰，HPLC图谱中所出的峰都是4-NQO或者其转化物。不同菌体浓度唾液乳杆菌与与4-NQO共培养3h的HPLC图谱见附图3。菌体浓度为：(A)0CFU ml-1；(B)2.1×106CFU ml-1；(C)3.5×107CFU ml-1；(D)5.4×108CFU ml-1；(E)2.3×109CFU ml-1；(F)9.3×109CFU ml-1。图中：：峰4为4-NQO，峰1，2，3为转化产物。随着菌体浓度增大，4-NQO的含量下降。在共培养的3小时内，菌体浓度增大，转化产物P2向P1及P3转化的比 例增大；当菌体浓度达到9×109CFU/ml时，3h内就可以完全转化为P1物质，说明这一步转化与菌体浓度成正相关。
HPLC-MS采用柱后串联质谱分析唾液乳杆菌FDL89对4-NQO的转化产物结构，质谱图见附图4。3个主要成分的m/z(M+H)+值分别为145、177和161，经结构推算，转化产物P1，P2和P3分别为4-氨基喹啉(4-AQ)、4-羟氨基喹啉-N-氧化物(4-HAQO)和4-氨基喹啉-N-氧化物(4-AQO)。
结论：
唾液乳杆菌对4-NQO的转化完全程度有菌量依赖效应，对4-NQO的转化过程是：
4-NQO→4-HAQO→4-AQ(+4-AQO)
实施例6含唾液乳杆菌FDL89的食品组合物
 原料   原料要求   添加量
 白砂糖   50-100克
 稳定剂YO825   来自丹尼斯克   3-8克
 唾液乳杆菌FDL89   冻干菌粉和培养液   105-1010CFU/mL
 鲜牛奶   符合国家《生鲜牛乳收购标准》   定容至1000克
1.工艺流程
采用本领域的常规方法制备含唾液乳杆菌FDL89的食品组合物。简要地，所述方法包括如图5所示流程。
2.工艺要点说明
2.1配料
2.1.1在配料罐中调入适量牛奶，牛奶的量淹没搅拌叶，调奶过程搅拌不可开启，调奶结束后开启搅拌，原奶温度小于10℃。
2.1.2牛奶不用升温，将白砂糖、稳定剂、胶原蛋白和抗氧化物的原料混合均匀后，加入循环的牛奶中，配料时搅拌开启。
2.1.3配料完成后，停止循环，直接进行顶管操作.
2.2定容
2.2.1按配方进行定容，定容结束后搅拌1min，取样检测。
2.2.2水合20min，检测合格后进行下一步工序。定容后料液酸度小于180T，巴杀过程中开启定容罐的搅拌。
2.3预热温度：60℃-65℃。
2.4脱气温度：60℃-65℃；压力：-90-80KPa。
2.5均质压力：150-170bar。
2.6杀菌温度：95士3℃；时间：300秒。
2.7冷却冷却至42士1℃。
2.8接种、发酵：当料液进入发酵罐1/3时，启动搅拌，待进料结束后继续搅拌10-15分钟；停止搅拌，开始计时发酵。要求：(1)对操作工的要求，剪短指甲，戴口罩；(2)接种时先将手，菌种袋以及菌种添加系统口周围用75％的酒精喷雾消毒，再用明火消毒；
2.9发酵酸度测定：发酵4.0小时后，开始测酸，到达终点后及时破乳、打冷。
2.10打冷、检测：将发酵奶全部打入贮罐冷却至20士2℃，搅拌15-100的秒后，及时灌装。
2.11灌装：酸奶贮罐中的料液12小时内(自冷却完毕开始计时)灌完。
2.12入库：产品在2小时内入库，并在2-6℃的冷库中放置12小时以上。
2.13出库：检测合格后出库。
2.14在运输和销售过程中必须确保冷链配置(2-6℃)
其中，所有的温度指料液温度而非设定温度。
以上所述仅为本发明示意性的具体实施方式，并非用以限定本发明的范围。任何本领域的技术人员，在不脱离本发明的构思和原则的前提下所作的等同变化、修改与结合，均应属于本发明保护的范围。

Claims (13)

1.一种唾液乳杆菌，其中该唾液乳杆菌是FDB89(Lactobacillus salivarius)菌株，保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC NO：2263。
2.包含权利要求1所述的唾液乳杆菌的组合物。
3.如权利要求2所述的组合物，该组合物是食品组合物。
4.如权利要求3所述的组合物，该组合物还包含食品学上可接受的载体。
5.如权利要求3或4所述的组合物，该组合物包含105-1010CFU/mL所述唾液乳杆菌。
6.用权利要求1所述的唾液乳杆菌制备的纯培养物，其中用牛奶作为培养基。
7.如权利要求6所述的纯培养物，其中所述牛奶中还含有糖和稳定剂，其中糖50-100克/升，稳定剂3-8克/升，并添加了105-1010CFU/毫升如权利要求1所述的唾液乳杆菌。
8.制备如权利要求6或7所述的纯培养物的方法，其包括如下步骤：1)配料；2)定容；3)均质；4)杀菌；5)冷却后接种发酵；6)测酸后打冷、检测；7)灌装；其中，步骤5)中使用如权利要求1所述的唾液乳杆菌。
9.如权利要求8所述的方法，其中所述步骤1)中的配料方法如下：将50-100克糖，3-8克稳定剂混合后用牛奶定容到1000毫升；步骤5)中以所述唾液乳杆菌的冻干菌粉或新鲜培养液以105-1010CFU/mL的浓度接入到原料混合物，在40-42℃下发酵。
10.如权利要求8所述的方法，其中所述步骤2)和3)之间还包括步骤2.1)水合20分钟；步骤2.2)在60-65℃下预热；和步骤2.3)在温度60℃-65℃和压力-90-80Kpa下脱气。
11.如权利要求8所述的方法，其中所述步骤6)为将发酵奶全部打入贮罐冷却至20±2℃，搅拌15-100秒后，及时灌装。
12.如权利要求1所述的唾液乳杆菌在食品工业中的应用。
13.如权利要求1所述的唾液乳杆菌在制备用于调节免疫力的生物制剂中的应用。
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