发明内容
本发明针对上述课题,从蒙古国传统功能性发酵乳——酸马奶中分离乳杆菌,采用体外耐酸性试验、耐胆酸盐试验、降胆固醇试验等一系列试验筛选一株具有潜在益生作用的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilusMG2-1),并通过动物实验证实了降低血清胆固醇含量及提高免疫力的功能。
本发明所要解决的技术问题是提供一种嗜酸乳杆菌(Lactobacillusacidophilus MG2-1)的新菌株及其制备方法。该嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus MG2-1)新菌株已于2006年4月21日,在地址为中国北京市海淀区中关村北一条13号,中国科学院微生物研究所内的中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心(国家专利局指定专利微生物保藏中心)保藏,保藏号CGMCC No.1698。
本发明另一解决的问题是公开该菌株在降低血清胆固醇含量和提高免疫力方面的应用。
一种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus MG2-1)是从酸马奶中分离的耐酸和耐胆汁酸的益生菌,该菌株已保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物菌种保藏中心,保藏号:CGMCC No.1698。
所述嗜酸乳杆菌在改善血脂代谢和免疫调节中的应用。
所述嗜酸乳杆菌在发酵剂或添加的发酵乳、健康食品以及动物保健制品中的应用。
一种嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus MG2-1)的制备方法:
a.以酸马奶为乳杆菌分离样品,取2mL所述酸马奶放入灭菌小试管中,再取1mL所述酸马奶放入装有灭菌CaCO3粉的无菌容积为2mL的采样瓶中,作为备用样品放在冰箱内在4℃条件下冷藏;然后用一灭菌吸管吸取1mL所述酸马奶样品并接种于10mL石蕊牛乳培养基中;
b.将所述接种的培养基置于30℃恒温箱中增菌培养至培养基酸化凝固并呈现粉红色时取出;用灭菌接种环再将经过增菌培养的菌株划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基中;
c.然后将其放入
厌氧培养罐中,置于30~37℃条件下培养48~72小时,形成菌落;用接种环挑取菌落,接种于MRS培养液中,置于30~37℃条件下培养24~48小时,使菌株生长;
d.待菌株生长良好后,再次用接种环划线将菌株接种于BL琼脂培养基中,置于30~37℃条件下培养24~48小时,观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征,并进行革兰氏阳性、过氧化氢酶试验,分离出在所述试验中呈阴性的杆菌,所述杆菌为乳杆菌;
e.将所述乳杆菌进一步纯化培养,并进行低温保存;将所述分离的乳杆菌菌株经过分析鉴定后制成乳杆菌菌液,吸取所述乳杆菌悬浮液10μL接种于5mL PH3.5的MRS液体培养基中,置于37℃条件下进行24小时培养;同时吸取乳杆菌悬浮液1.0mL与9.0mL PH3.0的人工胃液混合后,置于37℃条件下培养,分别在培养开始时间0小时和培养3小时后取样;
f.然后用BCP琼脂培养基测定活菌数,筛选出具有高耐酸性生长的乳杆菌菌株;进一步测定所述乳杆菌菌株在不同人工胃液和肠液中的存活能力以及通过体外耐胆盐试验和降低胆固醇试验,由此获得嗜酸乳杆菌。
所述乳杆菌低温保存为低温真空冷冻保存。
所述乳杆菌低温保存为-85℃冻结保存。
所述乳杆菌低温保存为4℃条件下冷藏保存。
所述人工胃液的制备方法:NaC1 0.2%、胃蛋白酶pepsin,sigma 0.35%,用1mol/L HC1调整pH值为3.0后,过滤除菌备用。
本发明的嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus MG2-1)具有较强的耐性和耐酸生长特性、能够耐受人工胃肠消化液,尤其在脱脂乳液中能够耐受pH2.0的人工胃液;能耐受的胆盐浓度达0.6%;具有良好的体外降胆固醇活性,并通过大鼠血清脂质含量的影响实验以证明具有抑制血清胆固醇上升作用。在对小鼠外周T淋巴细胞亚群和血清IgG和肠黏膜SIgA水平的影响研究也显示了良好的调节细胞免疫和体液免疫功能以及肠黏膜局部免疫的调节作用。因此,该菌株适用于功能性发酵乳制品的生产、也可作为功能性食品添加剂或保健制剂应用于降低人类血清胆固醇浓度或抑制胆固醇浓度的上升、调节免疫功能的各个方面。
通过以下各个实验内容,更详细地说明本发明。以下实例为仅说明性的,本发明并不受这些实例的限制。
具体实施方式:
下面结合附图和实施例对本发明作进一步描述。
本发明的L.acidophilus MG2-1,经过pH2.0、pH3.0和pH4.0的人工胃液作用3h后,随即分别接入pH8.0的人工肠液,作用0h、3h、6h、24h后的活菌数变化结果如图2所示。
本发明的L.acidophilus MG2-1,接种到10%脱脂乳中,置37℃培养凝乳后,按比例与不同pH值人工胃液混合后于37℃处理3h,然后,转接到pH8.0的人工肠液中,随时间测定其活菌数变化,如图3所示。
结果显示,L.acidophilus MG2-1具有极强的耐酸特性和耐受人工胃肠液的能力,尤其在脱脂乳中时能够耐受pH2.0的人工胃酸而存活率未见降低。
并从图4可知,L.acidophilus MG2-1活菌体细胞在生长过程中从介质中除去胆固醇的数量显著高于热灭活的菌体细胞。但是,并未因热处理导致降胆固醇作用的消失,而只是能力有所降低。
本发明中嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus MG2-1)的分离纯化过程如下:
以蒙古国传统功能性发酵乳——酸马奶为乳杆菌分离样品,将牧民家庭自然发酵制作的酸马奶,在其发酵容器中充分搅拌后,用带有灭菌吸头的移液器,吸取2mL放入带有胶塞的灭菌小试管(15mm×150mm)中封口,再吸取1mL于放入带螺旋帽装有灭菌CaCO3粉的无菌容积为2mL的采样瓶中,拧紧螺旋帽作为备用样品。将收集的样品放入冰盒内冷却,间隔一定时间更换冰袋,保持较低温度状态下带回实验室转放在4℃冰箱,尽快进行乳酸菌的分离。
乳杆菌分离时,用灭菌吸管吸取1mL酸马奶样品接种于10mL灭菌石蕊牛乳培养基中,置30℃恒温箱增菌培养至酸化凝固,培养基颜色变为粉红时取出,用灭菌接种环钓取划线接种于含有10ppm放线菌酮和10ppm硫酸粘菌素的BL琼脂培养基上,放入
厌氧培养罐中,置30℃,培养48h~72h。待菌落形成后,用接种环或接种针挑取菌落,接种于MRS培养液中,置30℃,培养24h~48h。待菌株生长良好后,再次划线接种于BL琼脂培养基,置30℃,培养24h~48h,仔细观察记录菌落形态和革兰氏染色细胞形态特征,并同时进行过氧化氢酶试验。将革兰氏阳性、过氧化氢酶试验阴性的杆菌,暂定为乳杆菌并进一步纯化培养,并采用低温真空冷冻保存。
将从酸马奶样品中分离的乳杆菌菌株,经生理生化学试验、乳酸旋光性测定等一系列试验分析鉴定。并将鉴定后菌株分别制成供试菌液,吸取菌悬液10μL接种于5mL pH3.5的MRS液体培养基,置37℃培养24h培养;同时吸取菌悬液1.0mL与9.0mL pH3.0的人工胃液(制备法:NaCl 0.2%、胃蛋白酶(pepsin,sigma)0.35%,用1mol/L HCl调整pH值为3.0后,过滤除菌备用)混合后,置37℃培养,分别在开始(0h)和3h后取样用BCP琼脂培养基(日本荣研株式会社制品)测定活菌数,并计算菌株存活率。通过以上方法筛选出具有高耐酸性生长和耐胃酸的乳杆菌菌株。进一步测定在不同人工胃液和肠液中的存活能力以及通过体外耐胆盐试验和降低胆固醇试验,获得了一株嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus MG2-1),并经动物模型测定对血清胆固醇含量上升的抑制作用以及对小鼠外周血T淋巴细胞亚群及其血清IgG水平和肠黏膜SIgA水平的影响分析,证明了对细胞免疫、体液免疫和肠黏膜局部免疫功能的增强作用。
实施例1:样品的采集和乳杆菌的分离鉴定。
样品为:传统方法制作的酸马奶,样品采集于蒙古国乌兰巴托市郊牧民家庭。
样品中乳杆菌的分离于纯化:其操作过程如图1所示。
乳杆菌的鉴定:分离纯化的乳杆菌,经生理生化学特性分析和16S rDNA序列分析的方法鉴定,其微生物学特性如表1所示。
表1
实施例2:嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus MG2-1)的耐酸性及其人工胃肠液中的耐受性分析。
从酸马奶样品中分离鉴定的30株乳杆菌中,经过pH3.5的MRS液体培养基中生长试验及在pH3.0人工胃液中的存活率测定,筛选到1株耐酸性极强的乳杆菌,即嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus MG2-1)。
Lactobacillus acidophilus MG2-1,经过pH3.5的MRS液体培养基中生长试验及在pH3.0人工胃液中的存活率测定,结果见表2。
表2
注:表中菌数均为两次实验的平均值。
实施例3:L.acidophilus MG2-1对胆盐的耐受性和体外降胆固醇能力分析。
将本发明的L.acidophilus MG2-1,接种于含有0.3%胆盐的培养基中,厌氧培养观察分析了胆盐对其生长的影响,结果如表3所示。
L.acidophilus MG2-1对胆盐的耐受性(n=3,x±sd) 表3
将本发明的L.acidophilus MG2-1接种于含不同浓度胆盐的TPY琼脂平板培养基和液体培养基中,通过对其生长情况的观察,分析了能够耐受胆盐的最高浓度,结果如表4所示。结果显示L.acidophilus MG2-1耐受的最高胆盐浓度达0.6%。
L.acidophilus MG2-1对不同浓度胆盐的耐受性 表4
注:△A620为0h和12h吸光值之差,结果为三次试验的平均值+表示有菌落生长,-表示无菌落生长,ND未测试。
将本发明的L.acidophilus MG2-1,接种于含有0.2%牛磺胆酸钠的MRS-THIO培养基中,37℃培养24h,测定上清液中游离胆酸含量,来判断乳杆菌对胆盐的分解作用,结果如表5所示。结果显示,本实验中L.acidophilus MG2-1有一定的胆盐脱结合活性,对牛磺胆酸钠解共轭所产生的游离胆酸量为2.53±0.31μmoL/mL。
L.acidophilus MG2-1对胆盐脱结合作用(n=3,x±sd) 表5
将本发明的L.acidophilus MG2-1,接种于含有150μg/mL胆固醇的MRS-THIO液体培养基中,置37℃厌氧培养24h后,检测了其培养液中残留的胆固醇含量,并计算了胆固醇减少量和降低率,结果如表6所示。L.acidophilus MG2-1的胆固醇降低率为51.75%。
L.acidophilus MG2-1在培养液中对胆固醇的降低作用(n=3,x±sd) 表6
根据以上实验,进一步将L.acidophilus MG2-1株菌,在150μg/mL胆固醇的MRS-THIO液体培养基中培养后,将培养液经离心分离获得上清液、菌体洗涤液以及其菌体细胞超声波破碎液,分别测定了其中胆固醇的含量,结果如表7所示。结果显示L.acidophilus MG2-1菌的培养上清液中胆固醇含量占原培养液中的48.25%,细胞洗涤液和细胞破碎液中的胆固醇含量分别占原培养液中的25.99%和29.91%。说明除了一部分胆固醇存在于培养液中外,近50%左右的胆固醇或吸附于菌体细胞或被吸收到细胞中,其中近30%的的胆固醇被菌体细胞所同化,近26%的的胆固醇被菌体细胞所吸附。
L.acidophilus MG2-1培养液离心后上清液、菌体洗涤液、菌体破碎液胆固醇含量(n=3,x±sd) 表7
应用实施例1:L.acidophilus MG2-1对大鼠血清脂质代谢的影响研究(体内实验,动物实验)。
将本发明的L.acidophilus MG2-1的热致死菌体脱脂乳制剂(其菌数为2.0×109cfu/mL)和活菌体脱脂乳制剂(其菌数为2.0×109cfu/mL)分别与高胆固醇饲料同时投喂wistar系大白鼠,并以高脂饲料组大鼠灌服灭菌脱脂乳液和基础饲料组大鼠灌服灭菌生理盐水作对照,进行了该菌株对大鼠脂质含量的影响效果分析,实验分组情况见表8所示。饲喂L.acidophilus MG2-1后的第14d时对大鼠血清总胆固醇(TC)、TG和HDL-C含量及动脉硬化指数(AI=(CHO-HDL-C)/HDL-C,Kawase M,HashimotoH,Hsoda M,et al.Effect of administration of fermented milkcontaining whey protein concentrate to rats and healthy men on serumlipids and blood pressure.J Dairy Sci,2000,83:255-263)的影响和粪便中胆汁酸含量见表9和10。
实验分组及饲养方式 表8
注:各组名称以下分别简称为L.acidophilus MG2-1热致死菌体组、L.acidophilus MG2-1活菌体组、高脂饲料组和基础饲料组。
灌服L.acidophilus MG2-1 14d时对大鼠血清脂质浓度(mmol/L)及动脉硬化指数AI的影响(n=6)
表9
注:与高脂饲料组比较:ap<0.05,aap<0.01。
灌服L.acidophilus MG2-1时对大鼠粪便中总胆汁酸含量的影响(mmol/3 day,n=6)表10
注:与高脂饲料组比较:ap<0.05,aap<0.01;与正常对照组比较:bp<0.05,bbp<0.01。
结果显示,本发明的L.acidophilus MG2-1具有良好的抑制大鼠血清胆固醇浓度的上升及增加粪便中总胆汁酸含量的生理活性,具有一定的改善脂质代谢的活性。
应用实施例2:L.acidophilus MG2-1菌体对小鼠外周血CD4+、CD8+淋巴细胞含量及其比值分析结果。
将本发明的L.acidophilus MG2-1制备成含有2.0×1010cfu/mL的脱脂乳菌悬液,连续灌服小鼠10天及20天后,采集各实验组小鼠外周血样品,经处理后在流式细胞仪上检测其中CD4+、CD8+淋巴细胞含量。实验分组情况如表11所示。
实验分组及饲养方式 表11
注:小鼠的等效剂量相当于人体推荐量的10倍(以60kg体重成人为例),卫生部卫生监督司(1996)。
将本发明的L.acidophilus MG2-1制成2.0×1010cfu/mL的脱脂乳悬液连续灌服小鼠10天后,采集各实验组小鼠外周血样品,经处理后在流式细胞仪上检测其中CD4+、CD8+淋巴细胞含量。检测到的数据用Cellqust软件分析处理,并采用二维点阵图形式表示。实验结果如表12。
乳杆菌对小鼠外周血CD4+、CD8+淋巴细胞以及CD19+淋巴细胞含量的影响(%) 表12
注:与对照组相比较*p<0.05;**p<0.01。
将小鼠外周血经溶血处理后获得的单个淋巴细胞,用特异性CD4+和CD8+单克隆抗体标记染色后,在流式细胞仪上能够根据细胞大小可获得区域明显的淋巴细胞团,进一步用Cellqust软件处理后,可得到分群显著的CD4+、CD8+淋巴细胞亚群以及各细胞亚群的百分率。灌服不同剂量L.acidophilus MG2-1株菌液的各实验组外周血CD4+细胞百分率均高于未灌服菌液的对照组,其中只有高剂量组CD4+细胞百分率呈显著性差异(p<0.05);而中剂量组和高剂量组的CD8+细胞百分率低于对照组,但尚未达到显著性差异水平。各剂量组小鼠外周血CD4+/CD8+值也高于对照组,其中中剂量组和高剂量组比值呈显著性差异(p<0.05)。本实验中,给小鼠灌服L.acidophilus MG2-1株菌液对其外周血CD19+细胞亚群百分率,与未灌服菌液的对照组比较均有明显提高。其中,中剂量组和高剂量组CD19+细胞亚群百分率呈显著性差异(p<0.05),而低剂量组未呈达到显著性差异水平。
以上结果表明,蒙古国酸马奶中分离鉴定,并通过人工消化液耐受性和体外降胆固醇作用分析筛选的L.acidophilus MG2-1株菌,非特异性地对活化小鼠外周血淋巴细胞亚群具有一定的促进作用。
应用实施例3:对小鼠血清IgG和肠粘膜SIgA含量的影响分析。
从表13中可知,给小鼠每日灌服一次L.acidophilus MG2-1脱脂乳制剂至第15天时,对照组血清IgG含量均低于未灌服乳杆菌制剂组,与低剂量组相比,达到显著性差异水平(p<0.05),与中剂量组和高剂量组相比,已达到极显著性差异水平(p<0.01)。灌服乳杆菌制剂后刮取肠粘膜测定了SIgA含量。各剂量组小鼠肠粘膜中SIgA含量均大幅度提高,均达到极显著性差异水平(p<0.01),并呈现明显的量-效关系。可见口服L.acidophilusMG2-1制剂能够显著提高肠粘膜免疫机能。
小鼠血清IgG和肠粘膜SIgA含量测定结果 表13
注:与对照组相比较*p<0.05;**p<0.01。
由此可见,本发明的L.acidophilus MG2-1对小鼠体液免疫及肠黏膜局部免疫具有一定的功效,为进一步益生菌及益生发酵乳的开发奠定了基础.
通过以上实施例证明,蒙古国锡林郭勒盟正蓝旗酸马奶中分离的L.acidophilus MG2-1具有极强的耐酸性、耐受人工胃肠消化液、耐受0.6%的胆盐和胆盐脱结合活性以及体外降解胆固醇的作用,因此,该菌株适用于功能性发酵乳制品的生产,也可以作为食品添加剂或保健剂应用于降低人类胆固醇浓度或抑制胆固醇浓度的上升,调节免疫功能的各方面。