CN111011493A - 一种富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳的制备方法及其发酵乳 - Google Patents
一种富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳的制备方法及其发酵乳 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供一种富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳的制备方法，包含以下步骤：(1)在原料乳中接种发酵菌，充分搅拌，混合均匀；(2)0.2h‑0.5h内接种动物双歧杆菌，充分搅拌，混合均匀；(3)无菌灌装后，静置发酵，得发酵乳；冷藏熟化，即可得富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳。本发明提供动物双歧杆菌的凝固型发酵乳制备方法，通过分步发酵实验发现了接种时机更改对动物双歧杆菌的生长促进作用，该乳介质体系由于在0.2h‑0.5h内加入双歧杆菌，使得发酵菌代谢产生的小分子肽或是其他因子能为双歧杆菌所利用，实现其快速增殖，保证正常的凝乳时间和凝乳状态，经发酵，动物双歧杆菌活菌数可达108CFU/mL以上。
Description
技术领域
本发明属于微生物发酵技术领域，尤其涉及一种富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳的制备方法及其发酵乳。
背景技术
肠胃疾病为常见病多发病,总发病率约占人口的20％左右。年龄越大,发病率越高,特别是 50岁以上的中老年人更为多见。目前已经确认幽门螺杆菌与上胃肠道慢性胃炎、消化性溃疡、胃癌、淋巴瘤这四种疾病密切相关,大概有67-80％的胃溃疡和95％的十二溃疡是由它引起的，传播范围广且非常迅速，其传染率甚至赶超乙肝病毒，有效抑制其在人体胃幽门处的有害作用对人体肠胃健康至关重要，因此，益生菌相关产品则成为肠胃病最重要的干预手段，且发酵乳是益生菌最良好的营养载体。
市面上现有的益生菌发酵乳大多只是标示的出厂前的益生菌活菌数，且受到益生菌添加量成本限制，大多数产品中包含的益生菌含量有限，并不能有效定植于肠道并发挥稳定的肠道改善作用。为此，产业界一直在尝试构建有利于功能性益生菌增殖的新型发酵乳体系。
人体、动物体内常用的益生菌主要有：酪酸梭菌、乳酸菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌等，是一类能稳定定植于人体肠道、生殖系统内对宿主有益的活性微生物。双歧杆菌是对肠道及机体水平的健康具有重要作用一类乳酸菌。研究表明，双歧杆菌具有促营养吸收、抗肿瘤、增强免疫力、改善胃肠道功能等多种重要的生理功能，然而随着人体的衰老，双歧杆菌的数量也随之衰减，同时有害菌增殖，胃肠健康必然受到威胁，通过外源补充双歧杆菌则是调节菌群平衡的有效手段。
然而，双歧杆菌在乳品领域规模化应用还面临一个主要的技术难题，目前已发现的双歧杆菌菌株均难以在乳介质中生长或保持有效的菌活力，因而在乳介质中加入适宜的发酵菌，某些发酵菌特殊的代谢产物刚好可以被双歧杆菌吸收利用，同时发酵产酸速度恰当，后酸化程度较弱以此为双歧杆菌提供适合的生长和保藏环境，但发酵菌的过量加入也会与双歧杆菌的增殖形成竞争关系，不利于双歧杆菌的增殖。故必须尝试构建有利于功能性益生菌增殖的新型发酵乳体系，如在发酵体系中加入具有协调作用的其他乳酸菌属、生长因子、促生长的益生元因子等，上述研究虽然有一些技术突破，但由于发酵乳的风味不能有效保证，在实际生产应用中有很大的局限性。
发明内容
为克服现有技术存在的问题，本发明的目的在于提供一种富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳的制备方法及其发酵乳。
本发明采用的技术方案是：
一种富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳的制备方法，包含以下步骤：
(1)在原料乳中接种发酵菌，充分搅拌，混合均匀；
(2)0.2h-0.5h内接种动物双歧杆菌，充分搅拌，混合均匀；
(3)无菌灌装后，静置发酵，得发酵乳；
(4)冷藏熟化，即可得富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳。
优选的，步骤(1)中发酵菌与步骤(2)中双歧杆菌的接种量之比为1:15-5:1。
优选的，步骤(2)中动物双歧杆菌的接种量为106-107CFU/mL。
优选的，动物双歧杆菌为保藏号为CGMCCNO.15206的动物双歧杆菌Y6。
优选的，发酵菌选自嗜热链球菌(S.thermophilus)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、植物乳杆菌FEED8(L.plantarum)的至少两种。
优选的，步骤(1)中植物乳酸杆菌为保藏编号为CGMCC No.15029的植物乳酸杆菌FEED8。
优选的，步骤(3)中静置发酵至滴定酸度为70°T-95°T。
优选的，步骤(1)中原料乳包含以下质量百分比的原料：68％-88％生牛乳、0-0.6％乳清蛋白粉、1％-8％蔗糖、0-1％低聚果糖、0-0.3％银耳多糖、0-2％稀奶油、0-0.3％明胶和余量反渗透水。
优选的，所述原料乳的制备方法为：所述质量百分比的原料在线循环溶解剪切、高压均质、杀菌、冷却后得原料乳。
本发明还提供一种根据上述制备方法制得富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳。
本发明的有益效果是：
1.本发明提供的富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳制备方法，制备过程采用的发酵培养基的来源广泛、成本低廉、天然安全；通过分步发酵实验发现了接种时机更改对动物双歧杆菌的生长促进作用，并在此基础上通过同时控制分步发酵的接种时间间隔、搅拌时间、接种温度、益生元、菌种比例等因素制备了本发明的富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳，在发酵制品中构建了基于保加利亚乳杆菌、嗜热链球菌常规发酵剂、植物乳杆菌FEED8、嗜酸乳杆菌NCFM益生菌和动物双歧杆菌益生菌的多元分步接种发酵体系，该体系在乳介质中在实现动物双歧杆菌生长的同时，该乳介质体系由于在0.2h-0.5h内加入双歧杆菌，使得发酵菌代谢产生的小分子肽或是其他因子能为双歧杆菌所利用，实现其快速增殖，保证正常的凝乳时间和凝乳状态，经发酵，动物双歧杆菌活菌数可达108CFU/mL以上。
2.本发明制备的富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳香气自然浓郁，营养丰富、质地细腻嫩滑，没有明显乳清析出，制备方法简单易行，保藏期内发酵乳中的双歧杆菌含量高，坚持食用可以有效调节肠道、缓解便秘，具有极高的市场应用价值。
3.实现了动物双歧杆菌在多元化乳酸菌体系中的生长：以动物双歧杆菌为代表的益生菌在乳制品中的规模化应用提供了新的技术路径，在未来富含益生菌发酵乳的开发及复合益生菌制剂领域将有重要应用价值。
生物材料保藏信息：
本发明提供的菌株，植物乳杆菌(L.plantarum)FEED8，保藏编号为CGMCCNo.15029，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum，及乳双歧杆菌Y6菌种保藏号为CGMCC NO.15206，分类命名为：动物双歧杆菌乳亚种Bifidobacterium animalissubsp.lactis，均已于2017年12月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)保藏单位的缩写为CGMCC。
附图说明
图1为实施例1制得的凝固型发酵乳中双歧杆菌数量和乳酸菌总数随时间变化图。
图2为实施例1制得的凝固型发酵乳pH、酸度、硬度随时间变化图。
图3为实施例1制得的凝固型发酵乳，图3(a)和图3(b)展示为不同视角的实施例1制得的凝固型发酵乳。
图4为实施例2制得的凝固型发酵乳中双歧杆菌数量和乳酸菌总数随时间变化图。
图5为实施例2制得的凝固型发酵乳pH、酸度、硬度随时间变化图。
图6为实施例2制得的凝固型发酵乳，图6(a)和图6(b)展示为不同视角的实施例2制得的凝固型发酵乳。
图7为实施例3制得的凝固型发酵乳中双歧杆菌数量和乳酸菌总数随时间变化图。
图8为实施例3制得的凝固型发酵乳pH、酸度、硬度随时间变化图。
图9为实施例3制得的凝固型发酵乳，图9(a)和图9(b)展示为不同视角的实施例3制得的凝固型发酵乳。
图10为受试人群饮用前后临床症状积分的变化柱状图。
图11受试人群饮用前后粪便中短链脂肪酸的变化柱状图。
图12饮用前后受试人群物种多样性Alpha指数稀释线图。
图13为受试人群的生物样本组成的OUT丰度曲线分析图。
图14为受试人群的肠道菌群的多样性指数对比图。
图15为受试人群饮用前后肠道菌群门水平的柱形图。
图16为受试人群饮用前后肠道菌群属水平的柱形图。
图17为受试人群饮用前后人群肠道菌群结构的PCA分析图。
图18为对比例中发酵菌与双歧杆菌不同接种方式对乳酸菌和双歧杆菌活菌总数的影响图。
具体实施方式
实施例1一种富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳的制备方法，包含以下步骤：
(1)原料乳制备：85％巴氏杀菌(80℃，15s)处理过的生牛乳、8％的蔗糖、0.2％的乳清蛋白粉TP 800、0.6％的低聚果糖、1.5％的稀奶油、0.3％的明胶、0.03％的银耳多糖及补足至100％的反渗透水，在线高剪切循环15min，均质(65℃，二级均质压力5MPa，一级均质压力20MPa)，95℃保温杀菌5min，冷却至25℃待用；
(2)向原料乳中分别接种嗜热链球菌107CFU/mL、保加利亚乳杆菌107CFU/mL、嗜酸乳杆菌106CFU/mL、106CFU/mL植物乳杆菌FEED8，搅拌20min，混合均匀；
(3)0.2h后接种107CFU/mL动物双歧杆菌Y6，搅拌5min，混合均匀；
(4)升温至45℃无菌灌装，于42℃温房静置发酵至滴定酸度为70°T，得发酵乳；
(5)步骤(4)中的发酵乳于6℃中冷藏熟化10h，即可得富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳。
保藏期内，对上述发酵乳样品取样，进行乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌活菌平板计数实验，结果如图1所示，可见该发酵乳在保藏期内活性动物双歧杆菌的含量均可稳定在108CFU/mL的水平。同时进行pH、酸度、硬度及析水情况监控实验，pH、酸度和硬度评分(0-10分从软到硬，0分代表液体状态，10分代表坚硬的固态)结果如图2所示，显示保藏期内的发酵乳后酸化程度较弱，质构比较稳定。保藏期末析水情况见图3，无明显乳清析出。
实施例2一种富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳的制备方法，包含以下步骤：
(1)原料乳制备：80％巴氏杀菌(80℃，15s)处理过的生牛乳、7.5％的蔗糖、0.1％的乳清蛋白粉TP 800、0.6％的低聚果糖、1.2％的稀奶油、0.25％的明胶、0.02％的银耳多糖及补足至100％的反渗透水，在线高剪切循环15min，均质(65℃，二级均质压力5MPa，一级均质压力20MPa)，95℃保温杀菌5min，冷却至30℃待用；
(2)向原料乳中分别接种嗜热链球菌106CFU/mL、嗜酸乳杆菌107CFU/mL、106CFU/mL植物乳杆菌FEED8，搅拌20min，混合均匀；
(3)0.2h后接种107CFU/mL动物双歧杆菌Y6，搅拌5min，混合均匀；
(4)升温至45℃无菌灌装，于42℃温房静置发酵至滴定酸度为75°T，得发酵乳；
(5)步骤(4)中的发酵乳于6℃中冷藏熟化10h，即可得富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳。
保藏期内，对上述发酵乳样品取样，进行乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌活菌平板计数实验，结果如图4所示，可见该发酵乳在保藏期内活性动物双歧杆菌的含量均可稳定在108CFU/mL的水平。同时进行pH、酸度、硬度及析水情况监控实验，pH、酸度和硬度评分(0-10分从软到硬，0分代表液体状态，10分代表坚硬的固态)结果如图5所示，显示保藏期内的发酵乳后酸化程度较弱，质构比较稳定。保藏期末析水情况见图6，无明显乳清析出。
实施例3一种富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳的制备方法，包含以下步骤：
(1)原料乳制备：85％巴氏杀菌(80℃，15s)处理过的生牛乳、8％的蔗糖、0.2％的乳清蛋白粉TP 800、0.6％的低聚果糖、1.5％的稀奶油、0.3％的明胶、0.03％的银耳多糖及补足至100％的反渗透水，在线高剪切循环15min，均质(65℃，二级均质压力5MPa，一级均质压力20MPa)，95℃保温杀菌5min，冷却至40℃待用；
(2)向原料乳中分别接种嗜热链球菌107CFU/mL、保加利亚乳杆菌107CFU/mL、106CFU/mL植物乳杆菌FEED8，搅拌20min，混合均匀；
(3)0.4h后接种107CFU/mL动物双歧杆菌Y6，搅拌5min，混合均匀；
(4)升温至45℃无菌灌装，于42℃温房静置发酵至滴定酸度为75°T，得发酵乳；
(5)步骤(4)中的发酵乳于6℃中冷藏熟化12h，即可得富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳。
保藏期内，对上述发酵乳样品取样，进行乳酸球菌、乳酸杆菌、双歧杆菌、嗜酸乳杆菌活菌平板计数实验，结果如图7所示，可见该发酵乳在保藏期内活性动物双歧杆菌的含量均可稳定在108CFU/mL的水平。同时进行pH、酸度、硬度及析水情况监控实验，pH、酸度和硬度评分(0-10分从软到硬，0分代表液体状态，10分代表坚硬的固态)结果如图8所示，显示保藏期内的发酵乳后酸化程度较弱，质构比较稳定。保藏期末析水情况见图9，无明显乳清析出。
实验例一种富含动物双歧杆菌Y6的凝固型发酵乳对肠道的改善作用
1.受试目标人群选定：(1)纳入者标准：选择功能性消化不良，伴有长期胃肠不适，主诉食欲不振，早饱、气多，胃肠胀满，呕吐，不明原因慢性腹泻或大便秘结等自愿受试者。(2)排除者标准：急性腹泻者、严重器质性病变引起的消化不良者、体质虚弱无法接受试验者、合并有心血管、肝、肾和造血系统等严重全身性疾病患者、未按要求服用受试样品，无法判断饮用结果者、乳糖不耐受或牛奶过敏者。
对招募的志愿者的肠道健康进行了如表1所示的调查，并进行了相应的积分记录，男女不限，年龄20-60岁。实验共筛选出25人作为合格受试者，其中男士6人，女士19人，年龄均在40-58岁之间，BMI在20.4-26.8之间。
表1受试者饮用前肠道健康调查表
2.食用剂量及时间：由实施例1制得的富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳样品置于4℃冰箱存放，每天早饭或午饭后一小时以内服用，每天服用一瓶(产品规格：200g)。连续服用 28天。试验期间不改变原来的饮食习惯，正常饮食。此外，受试者每天填写生活日志和膳食统计表。然后每3天由实验人员收取生活日志和膳食统计表。并在饮用后最后一天再次取便并进行肠道健康调查问卷。如服用药物在此期间发生变动，请及时记录服药情况。
3.排空期7天后第一次生物样本采集：排空期期间，志愿者均保持原用降糖药物及饮食、运动、生活规律不变动，但不可饮用任何发酵食品(包括泡菜、腐乳、酸奶、奶酪、活性乳酸菌饮料等)，可饮用不含乳酸菌的乳制品。排空期结束后，采集受试者的粪便，粪便采集方法：小便后，将卫生纸垫在马桶或便池里，用标记好的采便管自带的小铲子取5-8小铲粪便，拧紧盖子，取2管，将采样管放入自封袋封口，连同冰袋一起放入泡沫盒，尽快送检。
4.实验数据说明：实验分析所用数据均是受试者实验的均值±标准差，采用SPSS17.0 进行平行数据及组间数据之间的显著性分析，并利用Origin 9.0软件进行绘图。
5.安全性指标：饮用前后各一次血常规和血生化检测，将25名受试者的血常规和血生化检测结果进行显著性差异分析，结果显示25名受试者的测试指标相互间均无显著性差异 (p>0.05)，故将统计结果取平均数处理，结果如表2所示，饮用前血常规、血生化和饮用后血常规、血生化指标均在正常范围，表明试饮益生菌发酵乳产品是安全的。
表2饮用前后血常规和血生化检测结果(平均值，±SD)
6.功效性观察：准确记录受试者试验前后的临床症状，按下表3给予量化评分，该评分由医生完成(北京市门头沟区医院)。对受试者的临床症状积分进行统计分析，并取平均数，结果如图10所示，饮用Y6发酵乳后14天，消化不良各种症状显著缓解，饮用28天后，嗳气、泛酸、食欲不振症状消失，其他症状也基本消失。
表3临床症状积分
7.粪便中短链脂肪酸含量：通过色谱分析检测受试者饮用前后粪便样本中的总SCFAs 和乙酸、丙酸、丁酸的含量变化，并各取平均值，结果见图11。饮用发酵乳后，乙酸含量在饮用期14天没有显著性增加，在饮用28天和洗脱期显著性增加；丙酸含量在洗脱期显著增加，丁酸含量在饮用28天和洗脱期显著增加，总酸在饮用28天和洗脱期显著增加，表明饮用Y6发酵乳28天可以增加短链脂肪酸的含量。
8.肠道菌群的改变情况：高通量测序方法检测受试者饮用前后粪便样本中的菌群组成情况。测序数量足够大，可以反映样本中绝大多数的微生物多样性信息，本次试验测序数量情况见图12，可知，随着测序数量的增多，物种的丰富度和多样性趋于平缓，说明本次测序数量合理，测序深度可以覆盖样品中的绝大部分微生物种类。
由图13可知，相对丰度高于1％的细菌种类在各样本中均较少，随样本中物种组成丰富度的增加，曲线逐渐平坦，说明物种组成的均匀度逐渐提高，当样本中相对丰度低于0.01％时，曲线趋于水平，不同样本在不同OTU(operational taxonomic units)丰度达到平台期。
由图14可以看出，饮用后与饮用前相比样本各物种均一性指数(Shannon指数)没有显著性差异，饮用28天，样本中观察到的OTU物种数目Sobs指数与菌种丰富度指数(Chao指数)有所增加但是不显著，且Shannon指数越大代表菌群多样性越高，Chao值越大代表物种总数越多，说明饮用前后肠道菌群的物种多样性和丰富度没有显著改变。
由图15可知，在门水平，受试者干预前后肠道菌群中的优势菌门为拟杆菌门(Bacteroidetes)、厚壁菌门(Firmicutes)、变形菌门(Proteobacteria)、放线菌门(Actinobacteria)、疣微菌门(Verrucomicrobia)与梭杆菌门(Fusobacteria)。各菌门变化情况见表4。
表4与第0天相比菌群在门水平的变化情况(平均情况)
在属水平，对相对丰度大于1％的菌属进行了分析，由图16可知，饮用后，在属水平上肠道菌群各菌属的比例与饮用前有所不同。其中主要的有益菌和有害菌变化情况如表5所示。饮用14天后，有7种有益菌增加，饮用28天后有5种有益菌增加，并且在洗脱期有3种有益菌增加；饮用后和洗脱期内有四种有害菌减少。表明，饮用Y6发酵乳有利于肠道菌群中有益菌的增加，有害菌减少。
表5与第0天相比菌群在属水平的变化情况(平均值)
运用PCoA简化分析技术，分析不同样本的OUT(97％相似性)组成，反映样本间的差异和距离，样本组成越相似，则反映在PCoA图中的距离越近，结果如图17所示，PC1为第一主坐标，对整体菌群的代表性为55.04％，PC2为第二主坐标，对整体菌群的代表性为22.61％，饮用前后，群落整体位于右侧，各组之间未分开，说明各组菌群组成未发生显著改变。
综上所述，持续饮用一段时间的实施例1中的富含乳双歧杆菌Y6的发酵乳，能在一定程度上改善特定的肠道问题，调节肠道菌群。
对比例：发酵菌与双歧杆菌不同接种方式对乳酸菌和双歧杆菌活菌总数的影响。
对比实验方法：发酵乳基料制备步骤：(1)配料：称取0-0.6％乳清蛋白粉、1％-8％蔗糖、 0-0.3％银耳多糖、0-0.3％明胶，干混，加入55℃预热处理过的68％-88％生牛乳，搅拌均匀，再加入0-2％稀奶油和0-1％低聚果糖，再用反渗透水定容至100％；(2)升温至65-70℃水浴保温15min；(3)取出，采用弗鲁克FM30-D型号的高剪切机分散乳化机2500rpm处理15min； (4)继续65-70℃水浴保温15min；(5)均质处理，二级均质压力50-70MPa；一级均质压力16-20MPa；(6)水浴至发酵乳基料的中心温度达95℃，保温5min杀菌；(7)降温至42℃水浴保温备用。
接种方案：采用无菌水按1:10的稀释比例将所有菌配制成均一的溶液，无菌接种，每次接种完发酵菌或双歧杆菌均手动搅拌2-5min。(1)接种量：①发酵菌：107CFU/mL的嗜热链球菌、107CFU/mL的保加利亚乳杆菌、106CFU/mL的嗜酸乳杆菌、106CFU/mL的植物乳杆菌FEED8；②益生菌：107CFU/mL的动物双歧杆菌Y6；(2)接种方式：①实施例：向发酵乳基料中先接种发酵菌，再0.2-0.5h接种双歧杆菌Y6；②1号对比组：同步接种发酵菌和双歧杆菌；③2号对比组：先接种发酵菌，再1h接种双歧杆菌；④3号对比组：先接种双歧杆菌，再8h后接种发酵菌。
发酵过程样品测试方案：将上述接种完发酵菌和双歧杆菌的每一组样品无菌分装到10mL 的无菌管中，每组保证有50个分装样，分别用于测试42℃发酵1h、2h、3h、4h、5h、5.5h、 6h及发酵乳保藏期间的pH、酸度、微生物指标(乳酸杆菌、乳酸球菌和双歧杆菌活菌数)，全部的检测方法均按国标法操作完成，发酵过程监测结果如表6所示。
表6各组发酵过程pH、酸度、乳酸菌和双歧杆菌总数随时间变化表(乳酸菌总数×108 CFU/mL、双歧杆菌×107CFU/mL，酸度°T)
发酵终点：发酵样品pH 4.3-4.5，酸度70-80°T终止发酵，6.5h后还不能达到终点pH、酸度指标的也仍然终止发酵，4℃冷藏放置12-16h后作为样品保藏的起始时间0d。
保藏期测试：取上述4℃冷藏放置的各组发酵乳样品，做0d、4d、8d、12d、15d的pH、酸度、微生物指标(乳酸杆菌、乳酸球菌和双歧杆菌活菌数)测试，全部的检测方法均按国标法操作完成，结果如表7所示。
表7各组乳酸菌和双歧杆菌总数随时间变化表(乳酸菌总数×109CFU/mL、双歧杆菌×108 CFU/mL)
由表7和图18可看出，实施例乳酸菌总数相对于其他组别没有显著性差异，实施例双歧杆菌总数与3号对比组无显著性差异(p>0.05)，但在其他对比组之上，且与1号和2号对比组具有极显著性差异(p<0.01)，说明本发明先接种发酵菌，再在0.2h-0.5h内接种双歧杆菌能更好促进乳酸菌和双歧杆菌的增殖，发酵菌在该段时间内代谢产生的小分子肽或是其他因子能为双歧杆菌增殖所利用。1号对比组同步接种发酵菌和双歧杆菌，导致发酵菌和双歧杆菌在该系统中形成竞争关系，不利于双歧杆菌的生长增值；2号对比组先接种发酵菌，再在1h 接种双歧杆菌，由于该段时间内，发酵菌产酸量偏大，不利于双歧杆菌的环境适应、增殖及后续的存活力，不利于双歧杆菌的生长增值；实施例与3号对比组的双歧杆菌活菌数无显著性差异，但先接种双歧杆菌，再在8h后接种发酵菌，该方法确实有利于双歧杆菌的缓慢增殖，但由于接种双歧杆菌与发酵菌的时间间隔为8h，间隔时间过长，工业化用发酵罐不能保证完全无菌状态，双歧杆菌不易成为优势生长菌株，此过程杂种微生物污染风险极高，微生物污染控制风险高，控制难度大，并不符合工业化的要求。
上述实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受上述实施例的限制，其他的任何未背离本发明的精神实质与原理下所作的改变、修饰、替代、组合、简化，均应为等效的置换方式，都包含在本发明的保护范围之内。
Claims (10)
1.一种富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳的制备方法，包含以下步骤：
(1)在原料乳中接种发酵菌，充分搅拌，混合均匀；
(2)0.2h-0.5h内接种动物双歧杆菌，充分搅拌，混合均匀；
(3)无菌灌装后，静置发酵，得发酵乳；
(4)冷藏熟化，即可得富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳。
2.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述发酵菌与步骤(2)中所述动物双歧杆菌的接种量之比为1:15-5:1。
3.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(2)中所述动物双歧杆菌的接种量为106-107CFU/mL。
4.根据权利要求1-3任一项所述的制备方法，其特征在于：所述动物双歧杆菌为保藏号为CGMCCNO.15206的动物双歧杆菌Y6。
5.根据权利要求1或2所述的制备方法，其特征在于：所述发酵菌选自嗜热链球菌(S.thermophilus)、保加利亚乳杆菌(L.bulgaricus)、嗜酸乳杆菌(L.acidophilus)、植物乳杆菌FEED8(L.plantarum)的至少两种。
6.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述的植物乳酸杆菌为保藏编号为CGMCC No.15029的植物乳酸杆菌FEED8。
7.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(3)中所述静置发酵至滴定酸度为70°T-95°T。
8.根据权利要求1所述的制备方法，其特征在于：步骤(1)中所述原料乳包含以下质量百分比的原料：68％-88％生牛乳、0-0.6％乳清蛋白粉、1％-8％蔗糖、0-1％低聚果糖、0-0.3％银耳多糖、0-2％稀奶油、0-0.3％明胶和余量反渗透水。
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于：所述原料乳的制备方法为：所述质量百分比的原料在线循环溶解剪切、高压均质、杀菌、冷却后得原料乳。
10.一种富含动物双歧杆菌的凝固型发酵乳，其特征在于：根据权利要求1-8任一项所述的制备方法制得。
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