CN110373354A - 一株植物乳杆菌及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及微生物技术领域，具体公开了一株植物乳杆菌FEED8及其应用。本发明所述植物乳杆菌保藏编号为CGMCC No.15029，分离自广西巴马长寿老人的肠道。灌胃该植物乳杆菌组与空白对照组相比小鼠血清、脑、肝脏中SOD活性、GSH‑Px活性和T‑AOC含量显著提高，MDA含量显著降低，且提高、降低程度与菌浓度正相关。其中在相同浓度时，活菌抗氧化效果好于活菌和死菌混合，更好于死菌体。十分适合用于食品、保健品、药品、食品补充剂等产品的制备。
Description
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，更具体的涉及植物乳杆菌及其抗氧化的应用。
背景技术
衰老是自然界生物的普遍规律，关于衰老的机理，目前公认度最高的是1957年由Harman等人提出的自由基理论。该理论认为机体进行正常氧化作用的同时会产生副产物活性氧(reactive oxygen species，ROS)，导致内源性自由基积累，这些自由基会破坏机体细胞，导致细胞内脂质、蛋白质、DNA等损伤。
正常情况下，细胞内ROS水平和抗氧化保护体系处于动态平衡。机体在特定状态下，比如感染时，ROS产生量会增加。外源性因素例如紫外照射、电离辐射、化学治疗以及毒素和重金属污染等也会诱导ROS水平升高，使得ROS含量超过抗氧化体系耐受水平，从而导致氧化应激发生。在氧化应激状态下，生物体SOD、CAT和GSH-PX等血清抗氧化酶水平降低，丙二醛(Malondialdehyde，MDA)和羰基化合物等氧化产物含量升高，以及肝脏肾脏等组织器官组织结构受损。
机体存在多种抗氧化物质，可分为两大类：酶类抗氧化物质和非酶类抗氧化物质。谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)和超氧化物歧化酶(SOD)是机体内两种重要的酶类抗氧化物质，GSH-Px能催化过氧化氢的分解；SOD能够清除超氧阴离子自由基，这两种酶活力的变化能反映机体氧化损伤的程度。非酶类抗氧化物包括维生素C、维生素E等。评判机体氧化程度的指标还有丙二醛(MDA)和总抗氧化能力(T-AOC)，MDA是脂质过氧化的产物，它的变化可以反映细胞损伤的程度；而T-AOC反映的是机体总的抗氧化能力，它的升降表明机体整体的抗氧化能力水平。
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)是一种常见的乳酸菌，主要分布于发酵蔬菜，乳制品、肉制品、人体唾液以及肠道环境。植物乳杆菌属于厚壁菌门(Firmicutes)的乳杆菌属(Lactobacillus)，兼性异型乳酸发酵。目前，植物乳杆菌在食品工业以及医药领域都有着广泛的应用。
随着植物乳杆菌第一个菌株-Lactobacillus plantarum WCFS1的全基因组公布之后，目前已有多达55株植物乳杆菌全基因组完成图在NCBI(National Center forBiotechnology Information，https://www.ncbi.nlm.nih.gov/)上公布，促进了植物乳杆菌相关的研究。其中，植物乳杆菌的抗氧化特性受到了广泛关注据报道，植物乳杆菌特定菌株干预对D-半乳糖、重金属、毒素以及有毒化学物质等诱导的动物氧化损伤模型均有一定的保护作用，对于肾脏、肝脏等组织的损伤具有较好的缓解作用。人体试验结果也显示，通过膳食补充植物乳杆菌发酵豆奶(Lactobacillus plantarum A7)可以显著提高二型糖尿病患者血清SOD水平，提示具有改善氧化损伤的作用。然而，目前已报道具有抗氧化功能的乳杆菌和双歧杆菌种类繁多，在不同研究报道中同种乳杆菌的抗氧化能力差别较大甚至同种不同菌株在不同研究中抗氧化能力都具有较大的差异。
因此，本发明通过建立小鼠D-半乳糖诱导的氧化损伤模型，测定植物乳杆菌FEED8的干预对小鼠血清、脑或肝脏等器官中SOD和GSH-PX抗氧化酶水平、总氧化能力T-AOC以及脂质过氧化反应MDA水平的影响，表征该植物乳杆菌FEED8的抗氧化能力。
发明内容
鉴于上述内容，本发明的目的是提供一株具有抗氧化功能的植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)FEED8。该菌分离自广西巴马长寿老人的肠道，经分离鉴定为植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)。与植物乳杆菌299DSM6595相比，显著增加了机体的抗氧化作用。
本发明的另一个目的在于提供一株植物乳杆菌FEED8，在机体抗氧化作用中的应用。更具体的为所述植物乳杆菌FEED8在制备药品、保健品、食品、食品补充剂中的应用。
本发明提供的植物乳杆菌FEED8经培养可得到大量植物乳杆菌活菌体，所述培养方法无特别要求，只要能使菌株增殖即可，例如可按照107CFU/mL的接种量接种于乳杆菌培养基中，于厌氧条件下，在25-45℃下培养5-72小时后，得到培养液。所述乳杆菌的培养基可以为本领域公知的各种适合乳杆菌培养的培养基，例如可以为乳汁和/或(《乳酸菌——生物学基础及应用》，杨洁彬轻工业出版社1996年出版)中的MRS培养基。
本发明可继续分离上述培养液中的植物乳杆菌FEED8活菌体，所述分离方法无特别限制，只要能从培养液中富集菌体即可，例如可以通过本领域公知的离心和/或过滤的方法实现，所述的离心和/或过滤的条件为公知的条件，本发明不再赘述。
根据本发明，所述植物乳杆菌的死菌体制备方法业内常规，例如，可以将上述培养后的植物乳杆菌活菌体加热致死，也可以将其辐射致死。所述加热致死的条件可以包括：温度65-85℃，时间0.5-1.5小时。
本发明的发明人发现，在制备所述食品、保健品、药品、食品补充剂中无论是所述植物乳杆菌FEED8的活菌体还是死菌体或是活菌体和死菌体的混合菌体作为活性成分，均具有良好的抗氧化作用。优选地，为了进一步增加抗氧化的能力，含活菌体作为活性成分。当使用活菌体和死菌体作为活性成分时，活菌体的数量高于死菌体的数量。
根据本发明，尽管将上述植物乳杆菌FEED8添加到所述食品、保健品、药品、食品补充剂中，并对个体进行食用，即可实现本发明目的，起到抗氧化的作用。但优选地，以每克或每毫升所述食品、保健品、药品、食品补充剂为基准，所述植物乳杆菌含量为106-1011CFU/g或/ml，优选为108-1010CFU/g或/ml。在上述优选情况下，食品、保健品、药品、食品补充剂的抗氧化能力更显著。
CFU(Colony-Forming Units，菌落形成单位)指活菌个数。在活菌培养计数时，由单个菌体或聚集成团的多个菌体在固体培养基上生长繁殖所形成的集落，称为菌落形成单位，以其表达活菌的数量。本发明中，当的乳酸杆菌的死菌体浓度以CFU/g或/ml表示时，是指将乳酸杆菌的活菌体致死得到相应数量的死菌体，并将其溶于缓冲液中配制成所需浓度。
本发明还提供了一种食品、保健品、药品、食品补充剂，所述药品可以根据给药途径不同而制备成不同形式，例如，可制备成散剂、片剂、颗粒剂、胶囊剂、溶液剂、乳剂、混悬剂等形式，所述药品中还可包括药学上可接受的佐剂。
所述食品包括任意类型的食品，例如固体饮料、豆制品、果汁制品、乳制品、冰淇淋、糖果、饼干等。所述食品中还可含有常规的添加剂、营养强化剂原辅料，例如香精香料、稳定剂、增稠剂、防腐剂、矿物质、维生素、麦芽糊精等。
有益效果：
植物乳杆菌FEED8能够一定程度的改善小鼠的抗氧化能力，从而对机体细胞起到保护作用，是一种很有开发潜力的生物活性物质。该植物乳杆菌FEED8对D-半乳糖致衰小鼠抗氧化系统的试验表明，空白对照组及灌胃该植物乳杆菌组小鼠血清、脑、肝脏中SOD活性、GSH-Px活性和T-AOC含量均有升高，MDA含量均有降低，三个组织中结果一致。但空白对照组变化不显著，可能与小鼠机体的自身修复相关。灌胃该植物乳杆菌组与空白对照组相比小鼠血清、脑、肝脏中SOD活性、GSH-Px活性和T-AOC含量显著提高，MDA含量显著降低，且提高、降低程度与菌浓度正相关。其中在相同浓度时，活菌抗氧化效果好于活菌和死菌混合，更好于死菌体。
生物保藏：
植物乳杆菌(Lactobacillus plantarum)FEED8于2017年12月7日被保藏在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)保藏单位的缩写为CGMCC，保藏编号为CGMCCNo.15029。
具体实施例
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明，以下实施例为本发明较佳的实施方式，但本发明的实施方式并不受下述实施例的限制，因此本发明要求保护的范围并不局限于所述。
首先，建立D-半乳糖诱导氧化损伤模型以考察植物乳杆菌FEED8体内缓解氧化损伤的能力。技术路线为：建立小鼠D-半乳糖诱导氧化损伤模型——灌胃小鼠受试物植物乳杆菌FEED8——称重小鼠——取血、处死小鼠取肝脏、脑——利用试剂盒测定各评价指标——实验结果的分析评价。其中表1为灌胃受试物前后小鼠体重变化情况，表2、3、4分别为植物乳杆菌FEED8对小鼠血清、脑、肝脏中GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量的影响。
1、实验耗材、设备及动物来源：
(1)实验菌株：植物乳杆菌(Lactobacillus Plantarum)FEED8，保藏编号为CGMCCNo.15029)，分离自广西巴马长寿老人肠道。
(2)阳性对照菌株：植物乳杆菌299 DSM6595，来自帝斯曼公司。
(3)实验动物：KM雄性小鼠，SPF级，二月龄，18-22g，购于广东省实验动物中心。
(4)无乳杆菌小鼠饲料购自上海斯莱克实验动物有限责任公司，饲喂前经辐射灭菌。
(5)实验试剂：D-半乳糖，购于中国医药集团上海化学试剂公司；GSH-Px试剂盒、SOD试剂盒、T-AOC试剂盒、MDA试剂盒，蛋白定量测试盒，购于南京建成生物工程研究所；其他试剂均为分析纯或优级纯。
(6)试验仪器：高压灭菌锅，型号为GI54DWS，购于zealway公司；多功能生化培养箱，型号为ZSD-1160，购于TOKYO RIKAKIKAI CO.LTD；电热恒温鼓风干燥箱，型号为DHG-9076A，购于上海精宏实验设备有限公司；低温高速离心机，型号为3K30，购于德国Satorious公司；紫外-可见分光光度计，型号为UV-2800，尤尼柯(上海)仪器有限公司；匀浆器，购于德国普鲁克公司。
2、实验材料的制备：
(1)植物乳杆菌活菌体菌悬液的制备：将植物乳杆菌按照107CFU/ml的接种量分别接种于500ml的MRS液体培养基中，37℃厌氧培养18h，4500r/min离心15min收集菌体，菌体沉淀重悬于质量分数10％(w/v)的脱脂乳中，分别配制成2×106CFU/ml的低剂量菌悬液L1(实施例1)、2×108CFU/ml的中剂量菌悬液M1(实施例2)、2×1010CFU/ml的高剂量菌悬液H1(实施例3)。
(2)植物乳杆菌死菌体菌悬液的制备：将植物乳杆菌按照107CFU/ml的接种量接种于100ml的MRS液体培养基中，37℃培养18h，70℃灭活1小时，4500r/min离心15min收集菌体，菌体沉淀重悬于质量分数10％的脱脂乳中，配制成2×108CFU/ml的菌悬液M2(实施例4)。
(3)植物乳杆菌死活混合菌体菌悬液的制备：按照(1)和(2)中的方法制备植物乳杆菌的活菌体和死菌体，按1:1的体积比配制成2×108 CFU/ml的菌悬液M3(实施例5)。
(4)阳性对照植物乳杆菌299 DSM6595菌悬液的制备：按照(1)的方法制备2×108CFU/ml的植物乳杆菌299 DSM6595对照菌悬液C1(对比例1)。
(5)D-半乳糖溶液：D-半乳糖以灭菌生理盐水配制成60mg/mL溶液，使用前0.22微孔滤膜过滤除菌。
适应一周后，80只小鼠随机分组，每组10只。植物乳杆菌FEED8干预组、阳性对照植物乳杆菌299 DSM6595、D-半乳糖模型组的小鼠称重后分别腹腔注射600mg/kg/d小鼠体重的D-半乳糖溶液，空白对照组小鼠用等量的生理盐水替代。同时，灌胃0.1ml/kg/d小鼠体重的植物乳杆菌FEED8、阳性对照、脱脂乳粉，详细情况见表1。期间每3天称重1次，调整灌胃量，连续灌服45d。实验期间实验小鼠自由饮食，12小时灯照/黑暗循环。
表1动物实验分组
取上述步骤中连续灌服45d的实验小鼠，于末次灌胃后称重，并禁食12h，眼球取血并用颈椎脱臼法处死小鼠。肝素钠抗凝收集血液，3000r/min离心10min，上清液0℃低温保藏备用。解剖小鼠，取出脑和肝脏，分别称取0.1～0.2g脑和肝脏组织，加入9倍体积的生理盐水，于匀浆器中制成10％的组织匀浆液，3000r/min离心10min，分别取上清液0℃低温保藏备用。通过生化试剂盒分别测GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量和蛋白含量。其中各测试方法按照试剂盒说明书进行测定。小鼠体重结果见表2，血清各指标见表3，脑组织各指标见表4，肝脏组织各指标见表5。
3、实验结果的统计分析：
超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)、过氧化氢酶(catalase，CAT)及谷胱甘肽过氧化物酶(glutathione peroxidase，GSH-Px)等酶类都是铁卟啉蛋白酶，是机体内清除自由基的主要酶系统，其原理主要是催化体内氧化酶的毒性产物H2O2分解。因此，在D-半乳糖致小鼠衰老的模型中，与对照组相比，当机体内SOD和GSH-Px酶活性提高越多，则说明植物乳杆菌FEED8改善小鼠抗氧化能力越强。
当器官衰老或在逆境下遭受伤害，往往发生膜脂过氧化作用而产生丙二醛(MDA)。MDA被释放出后，可以与蛋白质、核酸结合，从而使其丧失功能，还可使纤维素分子间的桥键松驰或抑制蛋白质的合成。因此，MDA的积累可能对细胞造成一定的损伤，MDA的变化和植物乳杆菌FEED8的抗氧化能力负相关。
总抗氧化能力(Total antioxidant capacity，T-AOC)利用在酸性环境下，物质还原Fe3+-三吡啶三吖嗪(Fe3+-TPTZ)产生蓝色的Fe2+-TPTZ的能力，来测定总抗氧化水平。当T-AOC越大时说明植物乳杆菌FEED8的抗氧化能力越强。
表2实验前后各组小鼠体重变化
注：与对比例2相比，实施例差异明显(P<0.05)。
由表2可看出，与对比例3(体重增加6.94g)比较，对比例2(体重增加4.78g)中的小鼠体重增加放缓，说明造模对小鼠生长有不利影响。实施例1-5中小鼠体重增加量高于对比例2，说明植物乳杆菌FEED8对小鼠体重增加有促进作用。其中实施例1-3中，随着浓度增加，小鼠体重与对比例2相比增加5.4％-40.8％，说明植物乳杆菌FEED8浓度与小鼠体重正相关。实施例1-5小鼠体重差异与比例1相比也有影响，但影响不显著。
表3植物乳杆菌FEED8对小鼠血清GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量影响
由表3可看出，与对比例3比较，对比例2中的小鼠血清中的GSH-Px和SOD的活力、T-AOC含量分别降低了49.7％，18.2，44.2％，MDA含量升高了46.7％，说明衰老小鼠造模成功。
灌胃植物乳杆菌FEED8的小鼠，实施例1-5中，小鼠血清中的GSH-Px和SOD的活力、T-AOC含量均高于对比例2，特别是GSH-Px和SOD的活力比对比例2提高了21.6％-88.8％，3.7％-19.1％，显著提高；且实施例1-5中，小鼠血清中的MDA含量比对比例2中降低了13.3％-30.6％，显著降低，说明本发明中植物乳杆菌FEED8具有抗氧化作用。其中实施例1-3中，随着浓度增加，小鼠血清中的GSH-Px和SOD的活力、T-AOC含量增加，且MDA含量降低，说明浓度抗氧化效果越好。实施例2、实施例4和实施例5对比，活菌体抗氧化效果好于活菌和死菌混合，更好于死菌体。实施例2与对比例1相比，该植物乳杆菌FEED8比阳性对照植物乳杆菌299 DSM6595小鼠血清中的GSH-Px和SOD的活力、T-AOC含量增加了30.61U/mL，8.6U/mL，1.11U/mL；MDA含量降低了1.4nmol/mL，因此，该植物乳杆菌FEED8比阳性对照植物乳杆菌299DSM6595抗氧化效果更显著。
表4植物乳杆菌FEED8对小鼠脑GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量影响
由表4可看出，与对比例3比较，对比例2中的小鼠脑中的GSH-Px和SOD的活力、T-AOC含量降低了52.2％，53.1％，76.1％，MDA含量升高了52.0％，说明衰老小鼠造模成功。
灌胃植物乳杆菌FEED8的小鼠，实施例1-5中，小鼠脑中的GSH-Px和SOD的活力、T-AOC含量均高于对比例2，特别是T-AOC含量比对比例2提高了263.0％，显著提高；且实施例1-5中，小鼠脑中的MDA含量比对比例2降低了32.4％，显著降低，说明本发明中植物乳杆菌FEED8具有抗氧化作用。其中实施例1-3中，随着浓度增加，小鼠脑中的GSH-Px和SOD的活力、T-AOC含量增加，且MDA含量降低，说明浓度抗氧化效果越好。实施例2、实施例4和实施例5对比，活菌体抗氧化效果好于活菌和死菌混合，更好于死菌体。实施例2与对比例1相比，该植物乳杆菌FEED8比阳性对照植物乳杆菌299DSM6595小鼠脑中的GSH-Px和SOD的活力、T-AOC含量增加了35.35U/mg pro，4.07U/mg pro，1.61U/mg pro；MDA含量降低了1.04nmol/mgpro，因此，该植物乳杆菌FEED8比阳性对照植物乳杆菌299 DSM6595抗氧化效果显著。此结果与小鼠血清结果相符。
表5植物乳杆菌FEED8对小鼠肝脏GSH-Px活力、SOD活力、T-AOC含量、MDA含量影响
由表5可看出，与对比例3比较，对比例2中的小鼠肝脏中的GSH-Px和SOD的活力、T-AOC含量降低了32.2％，30.7％，62.2％，MDA含量升高了113.0％，说明衰老小鼠造模成功。
灌胃植物乳杆菌FEED8的小鼠，实施例1-5中，小鼠肝脏中的GSH-Px和SOD的活力、T-AOC含量比对比例2提高了17.2％-40.6％，13.6％-41.0％，50.5％-132.7％，特别是GSH-Px和T-AOC活力明显高于对比例2；且实施例1-5中，小鼠肝脏中的MDA含量与对比例2相比降低了9.2％-31.3％，说明本发明中植物乳杆菌FEED8具有抗氧化作用。其中实施例1-3中，随着浓度增加，小鼠肝脏中的GSH-Px和SOD的活力、T-AOC含量增加，且MDA含量降低，说明浓度抗氧化效果越好。实施例2、实施例4和实施例5对比，活菌体抗氧化效果好于活菌和死菌混合，更好于死菌体。实施例2与对比例1相比，该植物乳杆菌FEED8比阳性对照植物乳杆菌299DSM6595小鼠肝脏中的GSH-Px和SOD的活力、T-AOC含量增加了19.02U/mg pro，1.32U/mgpro，0.44U/mg pro；MDA含量降低了1.06nmol/mg pro，因此，该植物乳杆菌FEED8比阳性对照植物乳杆菌299 DSM6595抗氧化效果显著。此结果与小鼠血清、脑结果相符。
综合分析，该植物乳杆菌FEED8对D-半乳糖致衰小鼠抗氧化系统的试验表明，空白对照组及灌胃该植物乳杆菌组小鼠血清、脑、肝脏中SOD活性、GSH-Px活性和T-AOC含量均有升高，MDA含量均有降低，三个组织中结果一致。但空白对照组变化不显著，可能与小鼠机体的自身修复相关。灌胃该植物乳杆菌组与空白对照组相比小鼠血清、脑、肝脏中SOD活性、GSH-Px活性和T-AOC含量显著提高，MDA含量显著降低，且提高、降低程度与菌浓度正相关。其中在相同浓度时，活菌抗氧化效果好于活菌和死菌混合，更好于死菌体。因此，该植物乳杆菌能够一定程度的改善小鼠的抗氧化能力，从而对机体细胞起到保护作用，是一种很有开发潜力的生物活性物质。
本发明的上述实施例仅仅是为清楚地说明本发明所作的举例，而并非是对本发明的实施例的限定。对于所属领域的普通技术人员来说，在上述说明的基础上还可以做出其它不同形式的变化或变动，这里无需也无法对所有的实施例予以穷举。凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等均应包含在本发明权利要求的保护范围之内。
Claims (6)
1.一株植物乳杆菌，其特征在于，所述的植物乳杆菌被命名为FEED8,该菌株的保藏编号为CGMCC No.15029。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌在抗氧化中的应用。
3.根据权利要求2所述的植物乳杆菌在抗氧化中的应用，其特征在于，制备抗氧化功效的食品、保健品、药品、食品补充剂中的应用。
4.根据权利要求3所述的植物乳杆菌在抗氧化中的应用，其特征在于，所述的食品、保健品、药品、食品补充剂包括植物乳杆菌的活菌体和/或死菌体作为活性成分。
5.根据权利要求4所述的植物乳杆菌在抗氧化中的应用，其特征在于，以每克或每毫升食品、保健品、药品、食品补充剂的总重量为基准，所述植物乳杆菌的添加量为106-1011CFU/g或106-1011CFU/ml。
6.根据权利要求5所述的植物乳杆菌在抗氧化中的应用，其特征在于，以每克或每毫升食品、保健品、药品、食品补充剂的总重量为基准，所述植物乳杆菌的添加量为108-1010CFU/g或108-1010CFU/ml。
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