CN115161250B - 一株具有安眠和健脑益智功能的植物乳杆菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株具有安眠和健脑益智功能的植物乳杆菌及其应用，植物乳杆菌为植物乳杆菌LP‑100，分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545。本发明所提供的植物乳杆菌LP‑100能够代谢产生γ‑氨基丁酸和α‑亚麻酸，能同时发挥助眠和健脑益智的功效。菌粉在活菌型和灭活型两种形态均能发挥助眠益智功效，应用场景非常广泛，可以直接食用菌粉或是将菌粉制成粉剂、片剂、口服液等，也可利用植物乳杆菌LP‑100制备发酵物。

Description

一株具有安眠和健脑益智功能的植物乳杆菌及其应用
技术领域
本发明涉及益生菌技术领域，尤其涉及一种具有安眠和健脑益智功能的植物乳杆菌及其应用。
背景技术
人的一生有三分之一的时间是在睡眠中度过，人体在睡眠时，各器官均能得到很好的休息。睡眠质量差容易导致焦虑、疲惫、眼睛干涩、智力下降等不适症状。睡眠是当代重要问题，睡眠质量好坏直接关系人体健康。当代人失眠只能依靠安眠药来进行缓解，但是药三分毒，长期服用安眠药容易导致毒素积聚在肝脏中，导致肝脏内毒素增加。同时，人体容易产生耐药性，导致助眠效力减弱，需要加大服用量。由睡眠质量不佳而导致的记忆力下降、反应速度减慢、注意力不集中不持久等智力下降的表现对人们的日常生活和工作产生了很大影响。
益生菌作为当代新兴的生物疗法，定殖于肠道后能分泌多种益生因子。多种益生因子，如：血清素及其代谢产物褪黑素，能够调节血清素系统；乙酸，能调节血脑屏障；以及γ-氨基丁酸、5-羟色胺、褪黑素等功能性代谢物。有望通过益生菌来改善睡眠，健脑益智。然而市面上的助眠产品功能比较单一，没有一类产品能同时发挥助眠效果和修复脑细胞损伤、健脑益智。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明的目的之一在于提供一株具有安眠和健脑益智功能的植物乳杆菌。
本发明的目的之二在于提供所述植物乳杆菌的发酵培养方法。
本发明的目的之三在于提供所述所述植物乳杆菌的应用。
本发明的目的之一采用如下技术方案实现：
一株具有安眠和健脑益智功能的植物乳杆菌，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌LP-100，分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545。
本发明的植物乳杆菌LP-100，为厌氧的革兰氏阳性菌，视野下呈短杆菌状，耐酸、耐胆盐，能分泌丰富的短链脂肪酸、B族维生素、氨基酸和细菌素以及其他营养因子；肠道粘附力强。
作为本发明的一个优选方案，所述植物乳杆菌LP-100能代谢产生γ-氨基丁酸和α-亚麻酸。
本发明的第二个目的采用以下技术方案实现：
一株具有安眠和健脑益智功能的植物乳杆菌的发酵培养方法，包括以下步骤：调节培养基的初始pH为6.4-7.6，将植物乳杆菌按照2-5%的接菌量接种至所述培养基中，于36-37℃厌氧培养4-18 h；所述培养基的配方为：胰酪蛋白胨15-30 g/L、牛肉膏5-12 g/L、酵母提取物3-8 g/L、淀粉15-30 g/L、柠檬酸氢二铵1-3 g/L、无水乙酸钠3-8 g/L、磷酸氢二钾1-3 g/L、吐温-80 0.5-2 g/L、硫酸镁0.5-1 g/L、硫酸锰0.2-0.5 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.2-0.8 g/L；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌LP-100，分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545。
作为本发明的一个优选方案，所述具有安眠和健脑益智功能的植物乳杆菌的发酵培养方法，包括以下步骤：调节培养基的初始pH为7.2，将所述植物乳杆菌LP-100按照4%的接菌量接种至所述培养基中，于37℃厌氧培养16 h；所述培养基的配方为：胰酪蛋白胨20g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、淀粉20 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、吐温-80 1 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L。
本发明的第三个目的采用以下技术方案实现：
本发明还提供了植物乳杆菌在制备具有安眠和健脑益智功能产品中的应用，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌LP-100，分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545。
作为本发明的一个优选方案，所述具有安眠和健脑益智功能产品的活性成分包括植物乳杆菌LP-100的活菌体和/或灭活型菌体。
作为本发明的一个优选方案，所述植物乳杆菌LP-100在所述具有安眠和健脑益智功能产品中的添加量为106-1011CFU/g或106-1011CFU/ml。
作为本发明的一个优选方案，所述具有安眠和健脑益智功能产品包括药品。
作为本发明的一个优选方案，所述具有安眠和健脑益智功能产品为口服制剂，所述口服制剂的剂型包括口服液、滴剂、片剂、粉剂、胶囊剂或颗粒剂。
本发明还提供了一种具有安眠和健脑益智功能的益生菌冻干粉，由益生菌菌泥和冻干保护剂溶液经过冷冻干燥而成，所述益生菌菌泥包括植物乳杆菌LP-100，或者，所述益生菌菌泥包括植物乳杆菌LP-100和植物乳杆菌FEED8；所述植物乳杆菌LP-100的分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545；所述植物乳杆菌FEED8的分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.15029；所述冻干保护剂溶液包括以下原料：海藻糖、赖氨酸、果胶、脱脂奶粉、丙三醇和甘露醇。
作为本发明的一个优选方案，在所述益生菌冻干粉中，所述益生菌菌泥与所述冻干保护剂溶液的重量比为1：（1-5），优选地为1：（1-3），更加优选地为1：2；在所述冻干保护剂溶液中，海藻糖的重量占比为6-12%，赖氨酸的重量占比为0.05-0.15%、果胶的重量占比为0.5-2.0%、脱脂奶粉的重量占比为4-16%、丙三醇的重量占比为0.4-1.2%，甘露醇的重量占比为0.4-1.2%。
本发明还提供了一种具有安眠和健脑益智功能的益生菌微胶囊，所述微胶囊包括芯层以及壁材层，所述芯层包括植物乳杆菌菌泥或植物乳杆菌固态发酵物，所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌LP-100，或者，所述植物乳杆菌包括植物乳杆菌LP-100和植物乳杆菌FEED8；所述植物乳杆菌LP-100的分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545；所述植物乳杆菌FEED8的分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.15029。
本发明还提供了一种具有安眠和健脑益智功能的益生菌晶球，包括益生菌活性物、液体油溶基质层和胶体层，所述胶体层包裹所述液体油溶基质层，所述益生菌活性物分布于所述液体油溶基质层内；所述益生菌活性物包括植物乳杆菌LP-100，或者，所述益生菌活性物包括植物乳杆菌LP-100和植物乳杆菌FEED8；所述植物乳杆菌LP-100的分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545；所述植物乳杆菌FEED8的分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.15029。
作为本发明的一个优选方案，在所述益生菌晶球中，所述益生菌活性物为益生菌冻干粉或益生菌微胶囊。
作为本发明的一个优选方案，在所述益生菌晶球中，当所述益生菌活性物为益生菌冻干粉时，所述益生菌冻干粉由益生菌菌泥和冻干保护剂溶液经过冷冻干燥而成，所述益生菌菌泥包括所述植物乳杆菌LP-100，或者，所述益生菌菌泥包括所述植物乳杆菌LP-100和所述植物乳杆菌FEED8；所述冻干保护剂溶液包括以下原料：海藻糖、赖氨酸、果胶、脱脂奶粉、丙三醇和甘露醇。
作为本发明的一个优选方案，在所述益生菌晶球中，当所述益生菌活性物为益生菌冻干粉时，所述益生菌菌泥与所述冻干保护剂溶液的重量比为1：（1-5），优选地为1：（1-3），更加优选地为1：2；在所述冻干保护剂溶液中，海藻糖的重量占比为6-12%，赖氨酸的重量占比为0.05-0.15%、果胶的重量占比为0.5-2.0%、脱脂奶粉的重量占比为4-16%、丙三醇的重量占比为0.4-1.2%，甘露醇的重量占比为0.4-1.2%。
相比现有技术，本发明的有益效果在于：
本发明所提供的植物乳杆菌LP-100能够代谢产生γ-氨基丁酸和α-亚麻酸，能同时发挥助眠和健脑益智的功效。菌粉在活菌型和灭活型两种形态均能发挥助眠益智功效，应用场景非常广泛，可以直接食用菌粉或是将菌粉制成粉剂、片剂、口服液等，也可利用植物乳杆菌LP-100制备发酵物。
生物材料保藏信息：
植物乳杆菌LP-100，保藏编号为GDMCC No.61545，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ，已于2021年3月3日保藏于广东省微生物菌种保藏中心 (地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，广东省微生物研究所，邮政编码：510070)，保藏单位的缩写为GDMCC。
植物乳杆菌FEED8，保藏编号为CGMCC No.15029，分类命名为：植物乳杆菌Lactobacillus plantarum ，已于2017年12月07日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心 (地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所，邮政编码：100101)，保藏单位的缩写为CGMCC。
具体实施方式
下面，结合具体实施方式，对本发明做进一步描述，需要说明的是，在不相冲突的前提下，以下描述的各实施例之间或各技术特征之间可以任意组合形成新的实施例。在下述实施例中所采用的原材料、设备等除特殊限定外均可以通过商业渠道购买获得。
一、助眠、健脑益智益生菌筛选
γ-氨基丁酸（γ-amino butyric acid，GABA）是一种天然的功能性非蛋白质氨基酸，广泛存在于茶、萝卜叶、甲壳类和哺乳动物等各种动植物体内。人体中的GABA不仅作为抑制性神经传达物质高浓度存在于中枢神经系统，还存在于肠道等末梢脏器。GABA是一种生理活性成分，具有激活脑内葡萄糖代谢、降血氨、抗惊厥、降血压、增进脑活力、增加神经营养、增强长期记忆、促进生长激素分泌、活化肾功能、肝功能，改善更年期综合征等重要生理功能，可以作为助眠的重要活性成分。
α-亚麻酸是人体必需脂肪酸，它参与人体磷脂的合成，并转化为人体必需的 DHA（二十二碳六烯酸）和 EPA（二十碳五烯酸），以维持人体的正常生理功能。α-亚麻酸具有增强免疫力、提高记忆力、调节血压、降低胆固醇、预防心脑血管疾病等显著的生物活性功能，可以作为健脑益智的重要活性成分。
1、产γ-氨基丁酸菌株筛选
1.1、培养基配置：
（1）GYP种子培养基：葡萄糖10g、酵母粉10g、蛋白胨5g、醋酸钠2g、硫酸镁0.02g、硫酸锰0.001g、硫酸亚铁0.001g、氯化纳0.001g、蒸溜水1L，pH6.8，1×105Pa，高压灭菌15-20min。
（2）GYP发酵培养基：GYP种子培养基中添加1%的L-谷氨酸钠，pH6.8，1×105Pa，高压灭菌15-20min。
1.2、菌种培养：将副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、鼠李糖乳杆菌、婴儿双歧杆菌分别接种于100mL GYP的种子培养基中，30℃静置或振荡培养1d，然后分别以1%的接种量接入到100mL GYP的发酵培养基中，30℃静置或振荡培养2d，对各菌株发酵液进行γ－氨基丁酸的相对定量分析。本测试中所用的植物乳杆菌为植物乳杆菌LP-100和植物乳杆菌FEED8。
1.3、γ-氨基丁酸定量分析：将γ-氨基丁酸标准品配成0.10g/L，0.20g/L，0.30g/L，0.40g/L，0.50g/L，0.60g/L，0.70g/L，0.80g/L，0.90g/L，1.00g/L的标准溶液。对标准溶液和上述待测发酵液进行点样、展层等定性分析，确认无误后，将标准溶液与待测样品一致的斑点剪下，洗脱，洗脱液在分光光度计波长520nm处测定吸光值。绘制γ-氨基丁酸标准曲线并求出回归方程，将侍测样品的吸光值带入公式，求出待测样品的γ-氨基丁酸含量，结果如表1所示。
表1 产γ－氨基丁酸的含量（g/L）
Figure 90405DEST_PATH_IMAGE001
由表1可得，相比其余菌，植物乳杆菌LP-100可以高产γ-氨基丁酸。因此，筛选出植物乳杆菌LP-100作为助眠菌株。
2、产α-亚麻酸菌株筛选
2.1、LBS琼脂培养基配置：胰酪蛋白胨10g，酵母浸粉5.g，葡萄糖20g，磷酸二氢钾6g，柠檬酸铵2g，醋酸钠25g，吐温80 1g，硫酸镁0.575g，硫酸锰0.12g，硫酸亚铁0.034g，琼脂15g，pH5.5±0.2（25℃），高压灭菌15-20min。
2.2、菌种培养：将副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、动物双歧杆菌乳亚种、鼠李糖乳杆菌、婴儿双歧杆菌分别接种于100mL 的LBS琼脂培养基中，37℃静置或振荡厌氧培养48h，对各菌株发酵液进行α-亚麻酸的测定。本测试中所用的植物乳杆菌为植物乳杆菌LP-100和植物乳杆菌FEED8。
2.3α-亚麻酸含量的测定方法
2.3.1 溶液的制备
1）碱性甲醇溶液：称取2.0 g NaOH，用色谱甲醇溶解并定容至100.0 mL。
2）盐酸溶液：量取 2.5 mL浓盐酸，用去离子水定容至25.0 mL。
3）乙酸溶液：量取1.0 mL冰乙酸，用去离子水定容至100.0 mL，用真空抽滤器过微孔滤膜封口备用。
2.3.2 试样的制备
精密称取待测试样100.0 mg于25 mL容量瓶中，加15 mL碱性甲醇溶液摇匀，密封后在 60℃恒温水浴震荡30 min。取出后冷却至室温，用盐酸溶液调节pH至中性，之后用色谱甲醇定容至25 mL备用。准确吸取1.00 mL上述备用甲醇溶液于10 mL容量瓶中，用色谱甲醇定容至刻度。用一次性注射器从10 mL容量瓶中吸取适量溶液，过滤膜后装入进样瓶。在指定的色谱条件下，进行高效液相色谱测定。
2.3.3 色谱条件
色谱柱：C18，250 mm×4.6 mm，5 μm，流动相：甲醇：1 %乙酸溶液=90：10，流速: 1mL/min，
柱温：30 ℃，检测波长：205 nm，进样量：20 μL。蒸发光检测器参数：载气流速2 L/min，漂移管温度75℃。
2.3.4α-亚麻酸浓度标准曲线的绘制
精密称取α-亚麻酸标准品100.0 mg于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得标准储备液。精密量取α-亚麻酸标准品储备液 0.1、0.2、0.5、0.8、1.0、1.5、2.0、3.0 mL于10mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，制得标准溶液。经高效液相色谱测定，绘制α-亚麻酸浓度标准曲线。根据标准曲线，计算试样的α-亚麻酸含量，结果如表2所示。
表2 产α-亚麻酸的含量（mg/mL）
Figure 476387DEST_PATH_IMAGE002
由表2可得，相比其余菌，植物乳杆菌LP-100可以高产α-亚麻酸。因此，筛选出植物乳杆菌LP-100作为健脑益智菌株。
二、植物乳杆菌LP-100的发酵培养方法
进一步筛选植物乳杆菌LP-100的最优培养条件。
1、培养基的筛选
用于培养植物乳杆菌LP-100的MRS培养基基础成分为：蛋白胨10 g/L、牛肉膏10g/L、酵母提取物5 g/L、葡萄糖20 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、吐温-80 1 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L，以此为基础进行碳源及氮源优化（在进行碳源和氮源优化时，仅变动碳源和氮源，其余原料及用量不变）。将植物乳杆菌LP-100以2%的接菌量接入培养基中，设置初始pH为7.2，于37 ℃培养16 h，测定发酵液的pH值、600 nm波长处光密度（OD600 nm）及活菌数，结果见表4。
碳源的选择包括：葡萄糖、淀粉、蔗糖。
氮源的选择包括：花生粉、大豆粉、牛骨膏和胰酪蛋白胨中的一种或任意组合。具体筛选条件见表3。
表3 培养基的筛选条件
Figure 521703DEST_PATH_IMAGE003
表4 培养条件筛选结果
Figure 261120DEST_PATH_IMAGE005
从表4的记录可得，对于植物乳杆菌LP-100的培养基，当淀粉添加量为20 g/L、胰酪蛋白胨添加量为20 g/L、牛骨膏添加量为10 g/L时，活菌数最高，确定为最优碳源、氮源。
2、培养条件的筛选
（1）pH筛选：选定植物乳杆菌LP-100培养基配方为：胰酪蛋白胨添加量20 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、淀粉20 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、吐温-80 1 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5g/L。将植物乳杆菌LP-100以2%的接菌量接入培养基中，分别设定初始pH值为6.4、6.8、7.2、7.6，分别于37 ℃厌氧培养16 h，测定发酵液pH值、OD600 nm及活菌数。结果见下表5。
表5 不同培养基初始pH值对植物乳杆菌LP-100的影响
Figure 544334DEST_PATH_IMAGE006
由表5可知，随着培养基初始pH值的升高，植物乳杆菌LP-100发酵液OD600 nm先升高后降低，发酵液活菌数也是同样的变化趋势，最适初始pH值为7.2。
（2）接种量筛选：选定植物乳杆菌LP-100培养基配方为：胰酪蛋白胨添加量20 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、淀粉20 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、吐温-80 1 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L。将植物乳杆菌LP-100分别以2%、3%、4%、5%的接菌量接入培养基中，设定初始pH值为7.2，分别于37 ℃厌氧培养16 h，测定发酵液pH值、OD600 nm及活菌数。结果见下表6。
表6 不同接种量对植物乳杆菌LP-100生长的影响
Figure 694692DEST_PATH_IMAGE007
由表6可知，植物乳杆菌LP-100的接种量为4%时，所得的发酵液活菌数最高，因此选择接种量4%作为植物乳杆菌LP-100最适接种量。
（3）发酵终止时间筛选：选定植物乳杆菌LP-100培养基配方为：胰酪蛋白胨添加量20 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、淀粉20 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、无水乙酸钠5g/L、磷酸氢二钾2 g/L、吐温-80 1 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L。将植物乳杆菌LP-100以4%的接菌量接入培养基中，设定初始pH值为7.2，于37℃厌氧培养，分别在发酵0、4、8、12、16、18 h取发酵液，测定pH值、OD600 nm和活菌数，绘制最终的发酵曲线，确定发酵终止时间。测定发酵液pH值、OD600 nm及活菌数。结果见下表7。
表7 发酵终止时间对植物乳杆菌LP-100生长的影响
Figure 430567DEST_PATH_IMAGE008
由表7可知，随着发酵时间的延长，发酵液OD600nm、活菌数增大，pH值减小，发酵16 h时，菌落生长到达稳定期，此时的活菌数最高，而pH值接近最低，说明此时发酵液产酸最多，因此选择16 h作为最终发酵时长。
综上所述，本发明实施例所提供的植物乳杆菌LP-100的最佳培养条件为：培养基配方为胰酪蛋白胨添加量20 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、淀粉20 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、吐温-80 1 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L，pH值7.2，接种量4%，最佳发酵时长为16 h。
三、植物乳杆菌LP-100的应用场景
本发明实施例还提供了植物乳杆菌LP-100在助眠、健脑益智领域的实际应用场景。例如，对植物乳杆菌LP-100进行包埋制成晶球益生菌，所得晶球益生菌具有安神助眠、健脑益智的功效。又如，利用植物乳杆菌LP-100制成粉剂、片剂以及其他剂型等均有显著效果。下面，将对不同的应用场景进行展示。
3.3益生菌冻干粉
实施例11
一种具有安眠和健脑益智功能的益生菌冻干粉，由重量比为1：2的益生菌菌泥和冻干保护剂溶液经过冷冻干燥而成，益生菌菌泥为植物乳杆菌LP-100菌泥（Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545）。冻干保护剂溶液由海藻糖、赖氨酸、果胶、脱脂奶粉、丙三醇和甘露醇溶于水中，搅拌均匀而成。在冻干保护剂溶液中，海藻糖的重量占比为8%，赖氨酸的重量占比为0.15%、果胶的重量占比为2.0%、脱脂奶粉的重量占比为16%、丙三醇的重量占比为1.2%，甘露醇的重量占比为1.2%。冷冻干燥的方式如下：
将益生菌菌泥和冻干保护剂溶液混合，搅拌均匀，形成菌悬液（乳化液），然后置于-80℃冰箱预冻2 h，取出后立即放入冷冻干燥机中，避免因温度突然上升而致菌体受损。将样品置于冷冻干燥机中持续冻干24 h（冷冻干燥机要预先开启，使冷阱温度降至-55℃，工作时真空度降至1 Pa）。冷冻完成后，检测冻干存活率。冻干存活率按下公式计算，结果见表10。
Figure 895047DEST_PATH_IMAGE009
式中：n1为乳化液活菌数/（CFU/g）；m1为乳化液质量/g；n2为冻干粉活菌数/（CFU/g）；m2为冻干粉质量/g。乳化液指冻干前从高密度培养基中获得的菌泥与冻干保护剂溶液混合后所得溶液。
实施例12
实施例12与实施例11的不同之处在于：调整益生菌菌泥和冻干保护剂溶液的重量比为1：1，其余与实施例11相同。
实施例13
实施例13与实施例11的不同之处在于：调整益生菌菌泥和冻干保护剂溶液的重量比为1：3，其余与实施例11相同。
实施例14
实施例14与实施例11的不同之处在于：在冻干保护剂溶液中，海藻糖的重量占比为6%，赖氨酸的重量占比为0%、果胶的重量占比为0.5%、脱脂奶粉的重量占比为4%、丙三醇的重量占比为1.2%，甘露醇的重量占比为1.2%，其余与实施例11相同。
实施例15
实施例15与实施例11的不同之处在于：在冻干保护剂溶液中，海藻糖的重量占比为6%，赖氨酸的重量占比为0.1%、果胶的重量占比为1.5%、脱脂奶粉的重量占比为12%、丙三醇的重量占比为0.4%，甘露醇的重量占比为0.8%，其余与实施例11相同。
实施例16
实施例16与实施例11的不同之处在于：在冻干保护剂溶液中，海藻糖的重量占比为8%，赖氨酸的重量占比为0.1%、果胶的重量占比为2%、脱脂奶粉的重量占比为4%、丙三醇的重量占比为0.8%，甘露醇的重量占比为0.4%，其余与实施例11相同。
实施例17
实施例17与实施例11的不同之处在于：在冻干保护剂溶液中，海藻糖的重量占比为10%，赖氨酸的重量占比为0.1%、果胶的重量占比为0.5%、脱脂奶粉的重量占比为8%、丙三醇的重量占比为0.4%，甘露醇的重量占比为0.8%，其余与实施例11相同。
表10 益生菌冻干粉的冻干存活率
Figure 908133DEST_PATH_IMAGE010
从表10中的记录可得，对于益生菌冻干粉，冻干保护剂溶液中，当海藻糖添加量8%、赖氨酸添加量0.15%、果胶添加量2%、脱脂奶粉添加量16%、丙三醇添加量1.2%、甘露醇添加量1.2%，且益生菌菌泥与冻干保护剂的质量比为1∶2时，植物乳杆菌LP-100菌粉的活菌数达到4.98×1011 CFU/g，冻干存活率为92.32%，为最佳实施例（实施例11）。取实施例11获取的益生菌冻干粉进行耐酸性耐胆盐实验，结果见表13。
3.4 益生菌晶球
实施例18
一种具有安眠和健脑益智功能的益生菌晶球，包括益生菌活性物、液体油溶基质层和胶体层，胶体层包裹液体油溶基质层，益生菌活性物分布于液体油溶基质层内，益生菌活性物为益生菌冻干粉；益生菌冻干粉由重量比为1：2的益生菌菌泥和冻干保护剂溶液经过冷冻干燥而成，益生菌菌泥为植物乳杆菌LP-100菌泥（Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545）。冻干保护剂溶液由海藻糖、赖氨酸、果胶、脱脂奶粉、丙三醇和甘露醇溶于水中，搅拌均匀而成。在冻干保护剂溶液中，海藻糖的重量占比为8%，赖氨酸的重量占比为0.15%、果胶的重量占比为2.0%、脱脂奶粉的重量占比为16%、丙三醇的重量占比为1.2%，甘露醇的重量占比为1.2%。按照以下方法制备而成：
1、制液体油溶基质层：按照表11将配方量的大豆油、葵花籽油、玉米油和维生素E称样，混匀，得基料A；
2、混料：将基料A与1g 植物乳杆菌LP-100冻干菌粉（1000亿CFU/g）混匀后得益生菌晶球预混料；
3、化胶：称取一定量的明胶加入冷水中进行吸水膨胀，并且在冷水中加入比例为1：5的对羟基苯甲酸甲酯与羟基苯甲酸甲酯（二者总的用量应为胶液总量的0.2%），起到防腐剂的作用，浸泡时间为1.5小时。按明胶：水：甘油比例3：1：1依次添加至保温桶中，控制温度在65℃左右（最高不得超过70℃）。持续搅拌，使之熔融成均匀的胶液，保温3小时抽真空除去胶液中的气泡；
4、制胶带：将保温桶中已经配制好的的明胶液通过软胶囊机的管路流至胶带定型皮轮，在胶带定型皮轮上明胶液会形成胶带，控制温度50℃，调整为胶带厚度0.6 mm 左右；
5、压丸：将益生菌晶球预混料充入软胶囊机的两胶带之间所形成的模腔包托而形成的囊腔内，粘合压型得益生菌晶球半成品A；
6、干燥：将益生菌晶球半成品A置于空气相对湿度20%、干燥温度25 ℃的条件下，进行鼓风干燥2h左右，得半成品B；
7、洗丸：用95％乙醇洗涤半成品B并在40℃下吹干，得半成品C；
8、二次干燥：在温度18℃，相对湿度35-40％条件下干燥 6-8 h，每小时翻动一次，得益生菌晶球。
取实施例18获取的益生菌晶球进行耐酸性耐胆盐实验，结果见表13。
表11 液体油溶基质层配方表
Figure 104759DEST_PATH_IMAGE011
实施例19
实施例19与实施例18的不同之处在于，液体油溶基质层的配方不同，详见表11，其余与实施例18相同。
实施例20
实施例20与实施例18的不同之处在于，液体油溶基质层的配方不同，详见表11，其余与实施例18相同。
实施例21
实施例21与实施例18的不同之处在于，液体油溶基质层的配方不同，详见表11，其余与实施例18相同。
根据中华人民共和国国家标准GB 4789.35-2016对实施例19-22的益生菌晶球中的植物乳杆菌LP-100（乳酸菌）进行含量检测，结果见表12。
表12 实施例19-22益生菌晶球活菌数（108CFU/g）
Figure 452564DEST_PATH_IMAGE012
由表12可得，实施例18-21获得的益生菌晶球活菌数均较高，这说明了本发明实施例所提供的液体油溶基质能很好地保护益生菌的活性，特别是实施例19的液体油溶基质层配方对益生菌的活性保护最好，作为晶球益生菌的最佳油溶基质。
取实施例11的益生菌冻干菌粉，用麦芽糊精稀释至1000亿CFU/g规格的益生菌冻干菌粉；以及取实施例19的益生菌晶球。它们分别在模拟胃酸pH3.0的条件下作用0.5h，在模拟胆盐浓度0.3%的条件下作用0.5h，然后测定其活菌数。结果见表13。
表13 益生菌菌粉、微胶囊和益生菌晶球的耐酸性耐胆盐试验结果记录表
Figure 658417DEST_PATH_IMAGE013
注：表13中，植物乳杆菌FEED8一栏与植物乳杆菌LP-100一栏相比，各实施例（冻干粉、微胶囊、晶球）的实验条件一样，区别在于将植物乳杆菌LP-100替换成植物乳杆菌FEED8。
由表13可得，本发明实施例所提供的植物乳杆菌LP-100冻干粉耐酸、耐胆盐性质非常好；将益生菌冻干粉制作形成益生菌晶球后，可以实现99%以上活菌直达肠道。且植物乳杆菌LP-100的效果要优于植物乳杆菌FEED8。
3.6 人群功效验证
人群招募：招募15名志愿者，这些志愿者均同时具备失眠、记忆力低下等体征，年龄在22-60岁之间，随机分成3组，每组5人。
试验方法：分别将实施例1的益生菌发酵酸奶、实施例6的益生菌发酵植物基饮品和实施例19的益生菌晶球发放给各个组，每个志愿者的服用频率为1袋/次、2次/天，服用周期为2个月。试验结束后，通过日常观察记录监测睡眠质量、背书质量、眼睛干涩等情况，评价指标见表14，结果如表15所示。
表14 各指标评估表/分
Figure 447382DEST_PATH_IMAGE014
表15 各指标人群情况反馈表/分
Figure DEST_PATH_IMAGE015
由表15可得，志愿者在坚持服用实施例19的益生菌晶球剂量2个月后，均反馈整体精神有显著改善，如睡眠质量提高、记忆力增强、眼睛干涩症状得到缓解等，且服用晶球益生菌效果更为显著，能有效安神助眠、健脑益智。
本发明实施例所提供的植物乳杆菌LP-100在不同的发酵基质中均能产生不同浓度的γ-氨基丁酸，且产量较高。将植物乳杆菌LP-100制成益生菌晶球，菌株能更好地直达肠道，在肠道中定点释放、定殖，在调节肠道菌群平衡的同时能产生丰富的益生因子，如：γ-氨基丁酸、α-亚麻酸等，其安神助眠、健脑益智效果更为显著。植物乳杆菌LP-100的应用场景非常广泛。本发明实施例所提供的植物乳杆菌LP-100冻干菌粉在活菌型、灭活型均有助眠益智功效，直接食用菌粉或是将菌粉制成粉剂、片剂、口服液均有显著性效果。
上述实施方式仅为本发明的优选实施方式，不能以此来限定本发明保护的范围，本领域的技术人员在本发明的基础上所做的任何非实质性的变化及替换均属于本发明所要求保护的范围。

Claims (10)

1.一株具有安眠和健脑益智功能的植物乳杆菌，其特征在于，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌LP-100，分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545。
2.权利要求1所述的植物乳杆菌在制备具有安眠和健脑益智功能产品中的应用，所述植物乳杆菌为植物乳杆菌LP-100，分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545。
3.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述功能产品包括药品。
4.如权利要求2所述的应用，其特征在于，所述具有安眠和健脑益智功能产品的活性成分包括植物乳杆菌LP-100的活菌体和/或灭活型菌体。
5.一株具有安眠和健脑益智功能的植物乳杆菌的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：调节培养基的初始pH为6.4-7.6，将植物乳杆菌按照2-5%的接菌量接种至所述培养基中，于36-37℃厌氧培养4-18 h；所述培养基的配方为：胰酪蛋白胨15-30 g/L、牛肉膏5-12 g/L、酵母提取物3-8 g/L、淀粉15-30 g/L、柠檬酸氢二铵1-3 g/L、无水乙酸钠3-8 g/L、磷酸氢二钾1-3 g/L、吐温-80 0.5-2 g/L、硫酸镁0.5-1 g/L、硫酸锰0.2-0.5 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.2-0.8 g/L；所述植物乳杆菌为植物乳杆菌LP-100，分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545。
6.如权利要求5所述的具有安眠和健脑益智功能的植物乳杆菌的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：调节培养基的初始pH为7.2，将所述植物乳杆菌LP-100按照4%的接菌量接种至所述培养基中，于37℃厌氧培养16 h；所述培养基的配方为：胰酪蛋白胨20 g/L、牛肉膏10 g/L、酵母提取物5 g/L、淀粉20 g/L、柠檬酸氢二铵2 g/L、无水乙酸钠5 g/L、磷酸氢二钾2 g/L、吐温-80 1 g/L、硫酸镁0.58 g/L、硫酸锰0.25 g/L、L-半胱氨酸盐酸盐0.5 g/L。
7.一种具有安眠和健脑益智功能的益生菌冻干粉，其特征在于，由益生菌菌泥和冻干保护剂溶液经过冷冻干燥而成，所述益生菌菌泥包括植物乳杆菌LP-100，或者，所述益生菌菌泥包括植物乳杆菌LP-100和植物乳杆菌FEED8；所述植物乳杆菌LP-100的分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545；所述植物乳杆菌FEED8的分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.15029；
所述冻干保护剂溶液包括以下原料：海藻糖、赖氨酸、果胶、脱脂奶粉、丙三醇和甘露醇。
8.如权利要求7所述的有安眠和健脑益智功能的益生菌冻干粉，其特征在于，所述益生菌菌泥与所述冻干保护剂溶液的重量比为1：（1-5）；在所述冻干保护剂溶液中，海藻糖的重量占比为6-12%，赖氨酸的重量占比为0.05-0.15%、果胶的重量占比为0.5-2.0%、脱脂奶粉的重量占比为4-16%、丙三醇的重量占比为0.4-1.2%，甘露醇的重量占比为0.4-1.2%。
9.一种具有安眠和健脑益智功能的益生菌晶球，其特征在于，包括益生菌活性物、液体油溶基质层和胶体层，所述胶体层包裹所述液体油溶基质层，所述益生菌活性物分布于所述液体油溶基质层内；所述益生菌活性物包括植物乳杆菌LP-100，或者，所述益生菌活性物包括植物乳杆菌LP-100和植物乳杆菌FEED8；所述植物乳杆菌LP-100的分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为GDMCC No.61545；所述植物乳杆菌FEED8的分类学命名为Lactobacillus plantarum，保藏编号为CGMCC No.15029。
10.如权利要求9所述的具有安眠和健脑益智功能的益生菌晶球，其特征在于，所述益生菌活性物为益生菌冻干粉；所述益生菌冻干粉由益生菌菌泥和冻干保护剂溶液经过冷冻干燥而成，所述益生菌菌泥包括所述植物乳杆菌LP-100，或者，所述益生菌菌泥包括所述植物乳杆菌LP-100和所述植物乳杆菌FEED8；所述冻干保护剂溶液包括以下原料：海藻糖、赖氨酸、果胶、脱脂奶粉、丙三醇和甘露醇。
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