CN115141775B - 一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法及其应用，所述培养方法包括如下步骤：将活化后的菌株接种到发酵培养基中进行发酵培养，在发酵培养过程中流加补料，所述补料包括硒原料、氨基酸及其盐、营养元素和富硒促进剂。本发明所涉及的培养方法不仅能提高益生菌的富硒能力，还能促进益生菌菌体自身功效的发挥，具有重要的应用价值。

Description

一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法及其应用
技术领域
本发明属于微生物发酵及微生态制剂领域，涉及一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法及其应用。
背景技术
硒已被联合国FAO/IAEA/WHO共同确认为人体必需的重要微量元素之一。它与维持机体正常生理功能及引起多种疾病的发生有着密切关系，具有抗氧化、提高机体免疫力等生理功能。目前，补硒的方法大多仍是用无机硒化合物即亚硒酸钠制成口服制剂，但亚硒酸钠具有较强的毒副作用。研究表明，无机硒经生物转化后形成的有机硒化物，其毒性低，在激发免疫反应上较无机硒显著，而且吸收率更高，这对于我国推广并改善硒缺乏的现状有极大意义。获得有机硒的途径中，人工合成技术因为难度较大、成本较高，在应用上受到了限制，所以不少学者在生物的吸收、转化上进行了大量探索。
益生菌对宿主机体免疫调节能力及肠道健康功能起到重要的生理作用，其通过多种作用机制来提供功效作用，包括提供胃肠道保护屏障，改变肠道内环境pH来提供非致病菌的增殖，从而增强宿主的免疫应答能力，提升抗氧化能力，产生抗菌物质与其在受体肠道中进行竞争。在国外许多研究表明，除了在改善宿主胃肠道方面益生菌有着突出作用，其代谢产物也能够在胃酸分泌方面提供一定的缓解作用。如果能够将益生菌等微生物作为补硒载体，将能同时起到保健和补硒两大功效。大多数补硒都是以无机硒(亚硒酸钠等)为原料，通过微生物的发酵，将无机硒转化成有机硒，目前在微生物方面研究最多的是酵母菌，但是由于其制备过程中导致具有生物活性的酵母菌大量死亡，因此其只具有补充硒元素的功能，其生物活性功能完全丧失；而且无机硒对微生物的生长会有一定的抑制作用，同时未完全利用完的无机盐对被人体过量食用也会造成一定的危害。
因此，如何开发一种方法，既能利用益生菌作为补硒载体，提高其富硒能力，同时增强益生菌菌株自身的功效，成为本领域当前亟待解决的问题。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法及其应用。
本发明所述自身功效包括菌株自身的增强免疫力及抗氧化功效。
本发明所述富含硒是指益生菌冻干粉中，有机硒含量为1200ppm以上。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
第一方面，本发明提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，所述培养方法包括如下步骤：
将活化后的菌株接种到发酵培养基中进行发酵培养，在发酵培养过程中流加补料，所述补料包括硒原料、氨基酸及其盐、营养元素和富硒促进剂；
所述硒原料包括硒代半胱氨酸；所述氨基酸及其盐包括精氨酸、赖氨酸、天冬氨酸、半胱氨酸盐酸盐或谷氨酸中的任意一种或至少两种的组合；所述营养元素包括硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸镁、硫酸锌、氯化钙、氯化钠或氯化钾中的任意一种或至少两种的组合；所述富硒促进剂包括维生素C、维生素E、没食子酸丙酯、谷胱苷肽或肌醇中的任意一种或至少两种的组合。
优选地，所述氨基酸及其盐包括谷氨酸和L-半胱氨酸盐酸盐。
优选地，所述谷氨酸与L-半胱氨酸盐酸盐的质量比为(5-10):1。
上述(5-15)中的具体数值例如5、5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9、9.5、10、11、12、13、14、15等。
优选地，所述营养元素包括硫酸亚铁、硫酸锰、硫酸镁、硫酸锌、氯化钙、氯化钠和氯化钾。
优选地，所述营养元素以重量份数计包括硫酸亚铁0.10-0.25份、硫酸锰0.010-0.025份、硫酸镁2.0-4.5份、硫酸锌1.5-2.5份、氯化钙0.5-1.0份、氯化钠0.5-1.5份和氯化钾1.5-3.5份。
上述0.10-0.25份中的具体数值例如0.10份、0.12份、0.15份、0.17份、0.20份、0.22份、0.25份等。
上述2.0-4.5份中的具体数值例如2.0份、2.2份、2.5份、2.7份、3.0份、3.2份、3.5份、3.7份、4.0份、4.2份、4.5份等。
上述1.5-2.5份中的具体数值例如1.5份、1.6份、1.7份、1.8份、1.9份、2.0份、2.1份、2.2份、2.3份、2.4份、2.5份等。
上述0.5-1.0份中的具体数值例如0.5份、0.55份、0.6份、0.65份、0.7份、0.75份、0.8份、0.85份、0.9份、0.95份、1.0份等。
上述0.5-1.5份中的具体数值例如0.5份、0.6份、0.7份、0.8份、0.9份、1.0份、1.1份、1.2份、1.3份、1.4份、1.5份等。
上述1.5-3.5份中的具体数值例如1.5份、1.7份、2.0份、2.2份、2.5份、2.7份、3.0份、3.2份、3.5份等。
优选地，所述富硒促进剂包括肌醇、维生素E和没食子酸丙酯。
优选地，所述肌醇、维生素E与没食子酸丙酯的质量比为1:(1-4):(1-5)。
上述(1-4)中的具体数值例如1、1.2、1.5、1.7、2.0、2.2、2.5、2.7、3.0、3.2、3.5、3.7、4.0等。
上述(1-5)中的具体数值例如1、1.2、1.5、1.7、2.0、2.2、2.5、2.7、3.0、3.2、3.5、3.7、4.0、4.2、4.5、4.7、5.0等。
优选地，所述流加补料是指当菌株生长到对数期初期时开始进行，至对数期末期停止。
优选地，所述补料还包括碳源。
优选地，所述碳源包括葡萄糖。
优选地，所述碳源的流加速度为5-20g/L/h，例如5g/L/h、7g/L/h、9g/L/h、11g/L/h、13g/L/h、15g/L/h、18g/L/h、20g/L/h等。
优选地，所述硒原料的流加速度为71-140mg/L/h，例如71mg/L/h、75mg/L/h、80mg/L/h、85mg/L/h、90mg/L/h、95mg/L/h、100mg/L/h、105mg/L/h、110mg/L/h、115mg/L/h、120mg/L/h、125mg/L/h、130mg/L/h、135mg/L/h、140mg/L/h。
优选地，所述氨基酸及其盐的流加速度为0.5-1.5g/L/h，例如0.5g/L/h、0.6g/L/h、0.7g/L/h、0.8g/L/h、0.9g/L/h、1.0g/L/h、1.1g/L/h、1.2g/L/h、1.3g/L/h、1.4g/L/h、1.5g/L/h等。
优选地，所述营养元素的流加速度为6-14g/L/h，例如6g/L/h、7g/L/h、8g/L/h、9g/L/h、10g/L/h、11g/L/h、12g/L/h、13g/L/h、14g/L/h等。
优选地，所述富硒促进剂的流加速度为2-10g/L/h，例如2g/L/h、3g/L/h、4g/L/h、5g/L/h、6g/L/h、7g/L/h、8g/L/h、9g/L/h、10g/L/h等。
本发明所述g/L/h是指每小时向每升发酵液中加入的补料的质量。
优选地，所述发酵培养的温度为32-40℃，例如32℃、32.5℃、33℃、33.5℃、34℃、34.5℃、35℃、35.5℃、36℃、36.5℃、37℃、37.5℃、38℃、38.5℃、39℃、39.5℃、40℃等。
优选地，所述发酵培养的时间为15-20h，例如15h、16h、17h、18h、19h、20h等。
优选地，所述发酵培养基包括MRS培养基。
优选地，所述益生菌包括青春双歧杆菌、动物双歧杆菌(例如动物双歧杆菌乳亚种)、两歧双歧杆菌、短双歧杆菌、婴儿双歧杆菌、长双歧杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、卷曲乳杆菌、德氏乳杆菌(例如德氏乳杆菌乳亚种、德氏乳杆菌保加利亚亚种)、发酵乳杆菌、格氏乳杆菌、瑞士乳杆菌、约氏乳杆菌、副干酪乳杆菌、植物乳杆菌、罗伊氏乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、唾液乳杆菌、嗜热链球菌、乳酸乳球菌(例如乳酸乳球菌乳酸亚种、乳酸乳球菌乳脂亚种、乳酸乳球菌双乙酰亚种)、费氏丙酸杆菌(费氏丙酸杆菌谢氏亚种)、肠膜明串珠菌(肠膜明串珠菌肠膜亚种)、马克斯克鲁维酵母、乳酸片球菌、戊糖片球菌、凝结芽孢杆菌、清酒乳杆菌或产丙酸丙酸杆菌中的任意一种或至少两种的组合。
第二方面，本发明提供一种富含硒的益生菌冻干粉，所述富含硒的益生菌冻干粉的制备原料包括由如第一方面所述的提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法培养得到的益生菌培养物和冻干保护剂。
优选地，所述冻干保护剂包括海藻糖、蔗糖或甘油中的任意一种或至少两种的组合，所述至少两种的组合例如海藻糖和蔗糖的组合、蔗糖和甘油的组合、海藻糖和甘油的组合等，其他任意的组合方式均可。
优选地，所述冻干保护剂以重量份数计包括海藻糖10-20份、蔗糖2-7份和甘油2-5份。
上述10-20份中的具体数值例如10份、11份、12份、13份、14份、15份、16份、17份、18份、19份、20份等。
上述2-7份中的具体数值例如2份、2.5份、3份、3.5份、4份、4.5份、5份、5.5份、6份、6.5份、7份等。
上述2-5份中的具体数值例如2份、2.5份、3份、3.5份、4份、4.5份、5份等。
优选地，所述富含硒的益生菌冻干粉由包括如下步骤的制备方法制备得到：
利用如第一方面所述的培养方法培养益生菌，得发酵培养液，离心，收集菌泥，与冻干保护剂混合，冻干，即得。
优选地，所述离心的转速为6500-8000转/分，离心时间为15-20min。
第三方面，本发明提供由如第一方面所述的提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法培养得到的益生菌培养物或如第二方面所述的富含硒的益生菌冻干粉在制备增强免疫力和/或抗氧化的食品、保健品或药品中的应用。
本发明所述的数值范围不仅包括上述列举的点值，还包括没有列举出的上述数值范围之间的任意的点值，限于篇幅及出于简明的考虑，本发明不再穷尽列举所述范围包括的具体点值。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
发明创造性地在益生菌发酵过程中补加氨基酸及其盐、营养元素和富硒促进剂，显著促进了益生菌的富硒能力，缺少任一组分，富硒能力都会降低。
其中，(1)氨基酸及其盐特定地选择L-半胱氨酸盐酸盐和谷氨酸的组合，二者相互配合，协同增效，能够更好地被益生菌吸收利用，从而促进益生菌富硒能力的提高。(2)在发酵过程中额外补充铁等营养元素，更利于益生菌进行富硒。(3)特定选择肌醇、没食子酸丙酯和维生素E作为富硒促进剂，这三种组分在提高益生菌富硒能力方面具有预料不到的协同增效的作用。(4)在发酵过程中硒原料、氨基酸及其盐及营养元素的流加速度对于菌体中硒含量的高低有影响，将各组分以合适的速度进行流加，更利于益生菌富硒。
而且，采用本发明提供的该方法培养得到的益生菌，制得的冻干粉不仅硒含量高，而且菌株在富硒的过程中可能产生了某些有益代谢物，提高了菌体自身的功效，因此功效好于菌株常规培养后补硒的方式。说明本发明的方法不仅能提高益生菌的富硒能力，还能促进菌体自身功效(增强免疫力、抗氧化)的发挥，具有重要的应用价值。
具体实施方式
为更进一步阐述本发明所采取的技术手段及其效果，以下结合本发明的优选实施例来进一步说明本发明的技术方案，但本发明并非局限在实施例范围内。
以下实施例中，若无特殊说明，所以的试剂及耗材均购自本领域常规试剂厂商；若无特殊说明，所用的实验方法和技术手段均为本领域常规的方法和手段。
下述实施例、对比例所涉及的原料信息及方法如下：
MRS液体培养基：将蛋白胨10.00g、牛肉膏10.00g、酵母膏5.00g、柠檬酸氢二铵2.00g、葡萄糖20.00g、吐温-80 1mL(1g)、磷酸氢二钾2.00g、硫酸锰0.58g和硫酸镁0.28g溶于1L蒸馏水，调节pH值至6.4。
下述方法均以植物乳杆菌Lp90(保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏编号为：CGMCC No.10453)为例进行说明。但本领域技术人员应当知晓，本发明所述方法并不限于植物乳杆菌Lp90，其他种类的益生菌均适用。
硒代半胱氨酸购自山东丰泰生物科技有限公司；肌醇购自成都万象宏润生物科技有限公司。
实施例1
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，具体如下：
(1)菌种制备：取-80℃保存的植物乳杆菌Lp90甘油管，接种(接种量为10％)于含有MRS培养基的试管中进行活化，37℃恒温厌氧培养20h。
(2)种子培养：将步骤(1)中得到的菌种扩培到250mL的三角瓶中(装液量为200mL的MRS培养基，接种量为2％)，37℃恒温厌氧培养16h。
(3)发酵培养：将10L MRS培养基投入15L的发酵罐中，灭菌后，将步骤(2)中制得的种子接入发酵罐中进行发酵培养，接种量为2％，发酵温度为37℃，发酵总时间为18小时；
在发酵过程中，当菌株生长到对数期初期时开始流加补料，以每升发酵液为基准：葡萄糖，流加速度为15g/h；硒原料(硒代半胱氨酸)，流加速度为100mg/h；氨基酸及其盐(谷氨酸和L-半胱氨酸盐酸盐，质量比为10:1)，流加速度为1g/h；营养元素(硫酸亚铁0.2g/h，硫酸锰0.02g/h，硫酸镁3g/h，硫酸锌2g/h，氯化钙0.8g/h，氯化钠1g/h，氯化钾2g/h)，总流加速度为9.02g/h；以及富硒促进剂(肌醇、维生素E和没食子酸丙酯，质量比为1:2.5:3.0)，流加速度为6g/h；至对数期末期停止流加。
实施例2
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，具体如下：
(1)菌种制备：取-80℃保存的植物乳杆菌Lp90甘油管，接种(接种量10％)于含有MRS培养基的试管中进行活化，37℃恒温厌氧培养24h。
(2)种子培养：将步骤(1)中得到的菌种扩培到250mL的三角瓶中(装液量为200mL的MRS培养基，接种量2％)，37℃恒温厌氧培养20h。
(3)发酵培养：将10L MRS培养基投入15L的发酵罐中，灭菌后，将步骤(2)中制得的种子(接种量2％)接入发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为37℃，发酵总时间为20小时；
在发酵过程中，当菌株生长到对数期初期时开始流加，以每升发酵液为基准：葡萄糖，流加速度为10g/h；硒原料(硒代半胱氨酸)，流加速度为80mg/h；氨基酸及其盐(谷氨酸和L-半胱氨酸盐酸盐，质量比为6:1)，流加速度为1.5g/h；营养元素(硫酸亚铁0.1g/h，硫酸锰0.025g/h，硫酸镁2g/h，硫酸锌2.5g/h，氯化钙0.5g/h，氯化钠1.5g/h，氯化钾1.5g/h)；以及富硒促进剂(肌醇、维生素E和没食子酸丙酯，质量比为1:1.5:2.0)，流加速度为4g/h；至对数期末期停止流加。
实施例3
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，具体如下：
(1)菌种制备：取-80℃保存的植物乳杆菌Lp90甘油管，接种(接种量10％)于含有MRS培养基的试管中进行活化，37℃恒温厌氧培养18h。
(2)种子培养：将步骤(1)中得到的菌种扩培到250mL的三角瓶中(装液量为200mL的MRS培养基，接种量2％)，37℃恒温厌氧培养14h。
(3)发酵培养：将10L MRS培养基投入15L的发酵罐中，灭菌后，将步骤(2)中制得的种子(接种量2％)接入发酵罐中进行发酵培养，发酵温度为37℃，发酵总时间为16小时；
在发酵过程中，当菌株生长到对数期初期时开始流加，以每升发酵液为基准：葡萄糖，流加速度为20g/h；硒原料(硒代半胱氨酸)，流加速度为135mg/h；氨基酸及其盐(谷氨酸和L-半胱氨酸盐酸盐，质量比为13:1)，流加速度为0.5g/h；营养元素(硫酸亚铁0.25g/h，硫酸锰0.01g/h，硫酸镁4g/h，硫酸锌1.5g/h，氯化钙1g/h，氯化钠0.5g/h，氯化钾3g/h)；以及富硒促进剂(肌醇、维生素E和没食子酸丙酯，质量比为1:3.5:4.5)，流加速度为8g/h；至对数期末期停止流加。
实施例4
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，硒原料的流加速度改为65mg/h，并保持整个发酵过程中添加的硒原料总量不变，加完即止，其他原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例5
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，硒原料的流加速度改为150mg/h，并保持整个发酵过程中添加的硒原料总量不变，加完即止，其他原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例6
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，将“谷氨酸和L-半胱氨酸盐酸盐”替换为“谷氨酸”，流加速度及总加入量均不变，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例7
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，将“谷氨酸和L-半胱氨酸盐酸盐”替换为“L-半胱氨酸盐酸盐”，流加速度及总加入量均不变，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例8
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，将“谷氨酸和L-半胱氨酸盐酸盐”替换为“天冬氨酸和赖氨酸，质量比10:1”，流加速度及总加入量均不变，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例9
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，氨基酸及其盐的流加速度改为0.3g/h，并保持整个发酵过程中添加的氨基酸及其盐总量不变，加完即止，其他原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例10
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，氨基酸及其盐的流加速度改为2g/h，并保持整个发酵过程中添加的氨基酸及其盐总量不变，加完即止，其他原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例11
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，流加的营养元素“缺少硫酸亚铁”，缺少的量用其他营养元素补足，并保持其他营养元素的配比不变，总量不变，其他原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例12
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，将各营养元素的流加速度减小三分之一，总流加速度变为6.01g/h，并保持整个发酵过程中添加的各营养元素总量不变，加完即止，其他原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例13
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，将各营养元素的流加速度增加二分之一，总流加速度变为13.53g/h，并保持整个发酵过程中添加的各营养元素总量不变，加完即止，其他原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例14
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，将富硒促进剂“肌醇、维生素E和没食子酸丙酯，质量比为1:2.5:3.0”替换为“肌醇和没食子酸丙酯，质量比1:3”，流加速度及总加入量均不变，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例15
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，将富硒促进剂“肌醇、维生素E和没食子酸丙酯，质量比为1:2.5:3.0”替换为“肌醇和维生素E，质量比1:2.5”，流加速度及总加入量均不变，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例16
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，将富硒促进剂“肌醇、维生素E和没食子酸丙酯，质量比为1:2.5:3.0”替换为“维生素E和没食子酸丙酯，质量比2.5:3”，流加速度及总加入量均不变，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例17
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，将富硒促进剂“肌醇、维生素E和没食子酸丙酯，质量比为1:2.5:3.0”替换为“维生素E”，流加速度及总加入量均不变，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例18
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，将富硒促进剂“肌醇、维生素E和没食子酸丙酯，质量比为1:2.5:3.0”替换为“肌醇”，流加速度及总加入量均不变，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例19
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，将富硒促进剂“肌醇、维生素E和没食子酸丙酯，质量比为1:2.5:3.0”替换为“没食子酸丙酯”，流加速度及总加入量均不变，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
实施例20
本实施例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，将富硒促进剂“肌醇、维生素E和没食子酸丙酯，质量比为1:2.5:3.0”替换为“肌醇、维生素C和谷胱甘肽，质量比为1:2.5:3.0”，流加速度及总加入量均不变，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
对比例1
本对比例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，不流加硒原料，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
对比例2
本对比例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，不流加氨基酸及其盐(谷氨酸和L-半胱氨酸盐酸盐)，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
对比例3
本对比例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，不流加营养元素，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
对比例4
本对比例提供一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法，其与实施例1的区别仅在于，步骤(3)的发酵过程中，不流加富硒促进剂，其他各原料的流加速度及加入量均不变，其他条件参照实施例1。
测试例
将上述实施例、对比例中发酵结束后的发酵液离心(7000转/分钟)，收集菌泥，将菌泥与保护剂(以质量百分含量计，海藻糖15％、蔗糖5％、甘油2.5％，余量为水)以质量比1:1的比例混合均匀后冻干，得到富硒植物乳杆菌Lp90冻干粉，其中水分含量小于4％。
冻干步骤：
S1、-48℃预冻3h；
S2、经过360min升温至-25℃后，维持960min；
S3、经过6h升温至0℃后，维持5h；
S4、经过240min升温至15℃后，维持240min；
S5、经过60min升温至25℃后，维持360min。
1.1硒含量的检测：
检测冻干粉中的硒含量，检测方法参考《GB 5009.93-2017食品安全国家标准食品中硒的测定》中总硒分析方法。结果见表1。
表1
结果分析：由实施例1与对比例2-4的对比结果可知，本发明创造性地在益生菌发酵过程中补加氨基酸及其盐、营养元素和富硒促进剂，显著促进了益生菌的富硒能力，缺少任一组分，富硒能力都会降低。
由实施例1与实施例14-20的对比结果可知，在总量一定的情况下，富硒促进剂选择特定的肌醇、没食子酸丙酯和维生素E的组合，相较于任意单一组分、任意两者的组合或其他三种组分的组合而言，培养得到的益生菌菌体中硒含量更高，此结果充分说明了，肌醇、没食子酸丙酯和维生素E这三种组分在提高益生菌富硒能力方面具有预料不到的协同增效的作用。
由实施例1与实施例6-8的对比结果可知，在总量一定的情况下，在发酵过程中补加L-半胱氨酸盐酸盐和谷氨酸，相较于仅补加单一的L-半胱氨酸盐酸盐或单一的谷氨酸而言，培养得到的益生菌菌体中硒含量更高，而换用其它种类的氨基酸及其盐，得到的硒含量会降低，这说明L-半胱氨酸盐酸盐和谷氨酸二者相互配合，协同增效，能够更好地被益生菌吸收利用，从而促进益生菌富硒能力的提高。
由实施例1与实施例11的对比结果可知，在发酵过程中额外补充铁元素，利于益生菌进行富硒。
由实施例1与实施例4-5、实施例1与实施例9-10、以及实施例1与实施例12-13之间的对比结果可知，添加量一定的情况下，在发酵过程中硒原料、氨基酸及其盐及营养元素的流加速度对于菌体中硒含量的高低有影响，将各组分以合适的速度进行流加，更利于益生菌富硒。
1.2菌株功能测试(动物实验)
50只SPF级小白鼠，雌雄各半，6-8周龄，体重19-23g，适应环境1周后，随机分为5组，每组含小鼠10只：空白组(以无菌水进行灌胃)；试验组3组(实施例1培养得到的菌制得的冻干粉1g，加一定量的水，制备菌悬液，3种剂量)，菌悬液的浓度分别为1×109CFU/mL(低剂量，实验组1)、3×109CFU/mL(中剂量，实验组2)、5×109CFU/mL(高剂量，实验组3)，对照组(对比例1培养得到的菌制得的冻干粉，加水，制备菌悬液，浓度为1×109CFU/mL，另外向菌悬液中添加硒代半胱氨酸，添加量与实施例1的菌悬液中硒含量一致)；各组小鼠均每天早上9点开始灌胃，每次0.2mL，连续灌胃30天。
免疫力测试：
试验后对比各组小鼠的胸腺/体重比值、脾脏/体重比值是否有差异，来评估冻干粉对小鼠的胸腺和脾脏的重量是否有影响。利用ConA诱导的小鼠淋巴细胞转化试验(MTT法，A差值越大说明淋巴细胞转化能力越强，说明小鼠的体液免疫能力越强)以及NK(自然杀伤细胞，natural killer cell)细胞活性测定(LDH法)对冻干粉进行增强免疫力功能测试。测试结果见表2。
表2
结果分析：首先，各组小鼠的胸腺/体重比值以及脾脏/体重比值之间并无显著差异(p>0.05)，说明益生菌冻干粉对小鼠的胸腺和脾脏的重量没有显著影响。表2的免疫力测试结果显示，与空白组相比，灌喂益生菌冻干粉的对照组及实验组的小鼠淋巴细胞转化能力以及NK细胞活性均显著提高，值得注意的是，实验组1的结果好于对照组(未进行富硒培养，但额外加入了等量的硒)，说明采用本发明提供的该方法培养得到的益生菌，制得的冻干粉不仅硒含量高，而且菌株在富硒的过程中可能产生了某些有益代谢物，提高了菌体的提高免疫力的功效，因此功效好于对照组的常规培养后补硒的方式。说明本发明的方法不仅能提高益生菌的富硒能力，还能促进菌体自身功效(增强免疫力)的发挥。
抗氧化能力测试：
试剂：丙二醛(MDA，是机体内自由基作用于脂质过氧化的终末产物，大量产生时可导致细胞膜损伤)、超氧化物歧化酶(SOD，是生物体中清除自由基的主要物质，其水平常作为象征衰老的直观指标)、谷胱甘肽(GSH，是机体内一种强抗氧化剂)及蛋白质羰基试剂盒来自南京建成生物工程研究所。
分别于试验前和试验后采尾尖血制成4％溶血液，用试剂盒测定其MDA水平变化，结果见表3。试验后，测量全血中GSH含量，摘眼球采血，离心后取血清测定SOD活力及蛋白质羰基含量，结果见表4。
表3
表4
结果分析：与对照组(未进行富硒培养，但额外加入了等量的硒)相比，实验组的小鼠血中MDA含量呈明显下降，SOD活力、GSH含量呈明显上升，蛋白质羰基含量无明显变化，此结果说明本发明的方法不仅能提高益生菌的富硒能力，还能促进菌体自身抗氧化能力的提高。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种提升益生菌的自身功效及富硒能力的培养方法及其应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。

Claims (6)

1.一种提升益生菌的富硒能力及其提高宿主免疫能力的培养方法，其特征在于，所述培养方法包括如下步骤：
将活化后的保藏编号为CGMCC No.10453的植物乳杆菌 Lp90菌株接种到发酵培养基中进行发酵培养，在发酵培养过程中流加补料，所述补料包括硒原料、氨基酸及其盐、营养元素、富硒促进剂和碳源；
所述流加补料是指当菌株生长到对数期初期时开始进行，至对数期末期停止；所述硒原料的流加速度为71-140 mg/L/h；所述氨基酸及其盐的流加速度为0.5-1.5 g/L/h；所述营养元素的流加速度为6-14 g/L/h；所述富硒促进剂的流加速度为2-10 g/L/h；
所述碳源为葡萄糖；所述硒原料为硒代半胱氨酸；所述氨基酸及其盐为质量比为(5-15):1的谷氨酸和L-半胱氨酸盐酸盐；所述营养元素以重量份数计为硫酸亚铁0.10-0.25份、硫酸锰0.010-0.025份、硫酸镁2.0-4.5份、硫酸锌1.5-2.5份、氯化钙0.5-1.0份、氯化钠0.5-1.5份和氯化钾1.5-3.5份的组合；所述富硒促进剂为质量比为1:(1-4):(1-5)的肌醇、维生素E和没食子酸丙酯。
2.如权利要求1所述的提升益生菌的富硒能力及其提高宿主免疫能力的培养方法，其特征在于，所述碳源的流加速度为5-20 g/L/h。
3.如权利要求1所述的提升益生菌的富硒能力及其提高宿主免疫能力的培养方法，其特征在于，所述发酵培养的温度为32-40℃。
4.如权利要求1所述的提升益生菌的富硒能力及其提高宿主免疫能力的培养方法，其特征在于，所述发酵培养的时间为15-20 h。
5.如权利要求1所述的提升益生菌的富硒能力及其提高宿主免疫能力的培养方法，其特征在于，所述发酵培养基为MRS培养基。
6.由如权利要求1-5中任一项所述的提升益生菌的富硒能力及其提高宿主免疫能力的培养方法培养得到的益生菌培养物在制备抗氧化的保健品或药品中的应用。
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乳酸菌富硒优化及其活性评价;易鑫;周琦;欧阳祝;谈安群;范佳莹;李则灵;朱霞建;黄林华;李贵杰;王华;;食品与发酵工业(08);全文 *

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