CN114921383B - 一种具有清除胆固醇功能的益生菌制剂及其制备方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及功能微生物应用技术领域，具体提供了一种具有清除胆固醇功能的益生菌制剂及其制备方法。所述益生菌制剂中的鼠李糖乳杆菌为鼠李糖乳杆菌YKSW（Lactobacillus rhamnosus YKSW），已于2022年3月29日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022337。该菌株耐胃酸和胆汁盐，具有很强的抗氧化性，并且对大肠杆菌和幽门螺旋杆菌的抑制作用显著。所述益生菌制剂能明显增加人体肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，优化菌群结构，有利于维持肠道健康，提高机体免疫力；还能高效清除机体内的胆固醇，降低血脂水平，改善机体的脂质代谢，促进总胆汁酸和胆固醇的排泄，应用前景广阔。

Description

一种具有清除胆固醇功能的益生菌制剂及其制备方法
技术领域
本发明涉及微生物筛选技术领域，具体提供了一种具有清除胆固醇功能的益生菌制剂及其制备方法。
背景技术
益生菌（Probiotics）是指摄入后通过改善宿主肠道菌群生态平衡，以提高宿主（人和动物）健康水平和健康状态的活菌制剂及其代谢产物。目前常用的益生菌有保加利亚乳杆菌、嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、发酵乳杆菌、植物乳杆菌、乳酸乳杆菌、胚芽乳杆菌、短乳杆菌、 纤维二糖乳杆菌、鼠李糖乳杆菌、罗伊氏乳杆菌等；双歧杆菌有：青春双歧杆菌、短双歧杆菌、两岐双岐杆菌、婴儿双岐杆菌、长双歧杆菌等。链球菌有：粪链球菌、乳链球菌、嗜热链球菌、乙酸乳酸双链球菌等。含有益生菌的乳制品含有促进人体健康和提高人体免疫力的乳酸菌和双歧杆菌，还含有由乳酸菌产生的益生元、纤维素、钙、ω-3 系列脂肪酸、植物酮和生物活性肽。
人的胎盘本来是无菌的，但婴儿出生时从产道中接受了接种物，肠道便出现了微生物的定植。其中，既包括有益的微生物菌群（如乳酸菌、酵母），也包括了因出生时接触粪便和皮肤而感染的有害菌群（如金黄色葡萄球菌和大肠菌群等）。健康人体的肠道内栖息着500多种、数十万亿个不同的细菌，它们在绝大多数情况下是互相制约、共存共生的，当人体肠道中定植足够数量的益生菌时，机体就会处于健康的状态，但是当体内菌群失去平衡，比如菌种间比例发生大幅变化或者超出正常数值时，那么腹泻、过敏、胃口不佳、疲倦、免疫力低等一系列病症就会随之而来，人体的健康就会亮红灯，而这时适当添加益生菌，协助体内菌群平衡，才能让人体重现健康状态。
益生菌在成年人体内有以下作用：
（1）提高人体对营养物质的消化吸收能力。许多益生菌株在胃肠道内可产生消化酶，这些酶可帮助人体更好地消化所摄入的食品和吸收食品中的营养成分。益生菌还可竞争性抑制有害微生物吸收营养物质及进入血液循环系统，嗜酸乳杆菌是这方面的代表菌株，可分泌消化乳糖的乳糖酶，从而缓解乳糖不耐症。
（2）定植于人体时产生重要的营养物质。定植于肠道中的益生菌能产生维生素，包括泛酸、尼克酸，以及 VB1，VB2，VB6，VK 等，同时能产生短链脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸等物质，这些物质对骨骼成长和心脏健康有重要作用。
（3）可以提高机体抵抗细菌病毒感染的能力。具体有三大途径：①益生菌通过产生杀灭有害菌的化学物质，及在肠道中与有害菌竞争空间和资源以遏制它们的生长；②抑制有害菌产生毒素；③清除有害菌产生的毒素。
众所周知，益生菌的功效具有“高度的菌株特定性”，不同菌种、不同菌株以及不同的菌株配比，可能有完全不同的功效。因此，选择益生菌也应该根据不同的功能需要来选择适合自己的益生菌产品。
发明内容
本发明的目的是提供一种具有清除胆固醇功能的益生菌制剂及其制备方法。所述益生菌制剂中的鼠李糖乳杆菌（Lactobacillus rhamnosus）耐胃酸和胆汁盐，具有很强的抗氧化性，并且对大肠杆菌和幽门螺旋杆菌的抑制作用显著，能有效降低血脂水平，应用前景广阔。
本发明一方面提供了一种益生菌制剂，包含鼠李糖乳杆菌冻干粉。
所述的鼠李糖乳杆菌，为鼠李糖乳杆菌YKSW（Lactobacillus rhamnosus YKSW），已于2022年3月29日保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022337。
所述鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，具体步骤包括：
1）配制液体发酵培养基，灭菌；
2）按发酵量的5-10%接种鼠李糖乳杆菌种子液，37-40℃，发酵18-24h，得发酵液；
3）将发酵液在4℃，5000r/min 条件下离心10min，进行离心，收集菌泥；
4）将菌泥进行真空冷冻干燥，至含水量小于1%；
5）在低温条件下，将冻干的菌泥研磨成60目的粉末，即得鼠李糖乳杆菌冻干粉。
所述液体发酵培养基中各组分及其含量分别为：脱脂奶粉80-120 g/L、葡萄糖70-150 g/L。
进一步优选的，所述液体发酵培养基中各组分及其含量分别为：脱脂奶粉80g/L、葡萄糖150g/L。
所述鼠李糖乳杆菌冻干粉中活菌量不低于1010 CFU/g。
所述的益生菌制剂还包括淀粉、羟丙纤维素、无水硫酸钙、麦芽糊精、低聚半乳糖、水苏糖、低聚果糖、乳粉、风味剂中的一种或多种的组合。
进一步优选的，所述的益生菌制剂还包括麦芽糊精、低聚果糖和风味剂。
进一步优选的，所述的益生菌制剂中各组分及其质量百分比为：鼠李糖乳杆菌YKSW冻干粉50-75%、低聚果糖10-15%、麦芽糊精10-20%和风味剂5-15%。
进一步优选的，所述的益生菌制剂中各组分及其质量百分比为：鼠李糖乳杆菌YKSW冻干粉60%、低聚果糖14%、麦芽糊精12%和风味剂14%。
本发明还提供了所述益生菌制剂在制备具有清除胆固醇功能的制品中的应用。
有益效果
本发明提供的益生菌制剂中包含鼠李糖乳杆菌YKSW冻干粉，活菌量高，超过100亿CFU/g。所述鼠李糖乳杆菌YKSW筛选自健康成年人的粪便，对四环素、氨苄西林等常见抗生素较敏感，生物安全性良好；具有非常强的耐胃酸、耐胆汁盐能力，在人工胃酸和肠液中3h时的存活率分别高达197.40%和90.45%。
所述鼠李糖乳杆菌YKSW对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌均有显著的抑制作用，尤其对大肠杆菌和幽门螺旋杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径超过30mm；高产胞外多糖，产量达689.4 mg/L；具有很强的抗氧化能力，能高效清除DPPH自由基和羟基自由基，其发酵液上清液和无细胞提取物对DPPH·自由基的清除率分别高达78.62%和61.2%，对羟基自由基的清除率分别高达80.15%和60.33%；具有很强的抗脂质过氧化能力，其发酵上清液对脂质氧化的抑制率高达69.55%；能高效去除胆固醇，体外去除率高达89.83%，取得了意料不到的技术效果。
动物实验结果显示，所述益生菌制剂还能高效清除机体内的胆固醇，降低血脂水平，改善机体的脂质代谢，促进总胆汁酸和胆固醇的排泄。与模型组相比，益生菌干预组大鼠血清中的胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平分别降低了45.9-49.6%、34.5-37.2%、64.2-66.2%，肝组织中胆固醇与甘油三酯含量分别下降了43.3-52.1%、39.0-50.3%，粪便中胆固醇和游离胆汁酸的含量分别提高了24.7-48.9%和45.9-113.5%，取得了意料不到的技术效果。
本发明提供的益生菌制剂能明显增加人体肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，优化菌群结构，有利于维持肠道健康，提高机体免疫力。
附图说明
图1为鼠李糖乳杆菌YKSW的菌落形态图。
具体实施例
本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW（Lactobacillus rhamnosus YKSW）为一株新发现的鼠李糖乳杆菌菌株，能有效抑制多种致病菌，高产胞外多糖，可以作为一种食品原料来源使用，长期服用不会有副作用及过量的风险，具有重要的应用价值。
申请人于2022年3月29日将所述鼠李糖乳杆菌YKSW保藏于中国武汉 武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2022337。
下面结合具体实施方式对本发明进行详细阐述。
实施例1鼠李糖乳杆菌YKSW的分离筛选与鉴定
本发明从半年内未进食益生菌制剂的健康志愿者粪便中分离得到一株抑菌效果特别突出的乳酸菌。经菌落形态特征、生理生化特征和分子生物学鉴定，确定该菌株为一株新的鼠李糖乳杆菌，命名为鼠李糖乳杆菌YKSW（Lactobacillus rhamnosus YKSW）。
鼠李糖乳杆菌YKSW的菌落形态如图1所示，菌落直径在1.5-2.5mm，呈圆形，乳白色，表面有光泽、湿润，边缘整齐；在显微镜下观察，菌体呈短杆状。
鼠李糖乳杆菌YKSW的16s rDNA序列为SEQ ID NO:1。
SEQ ID NO:1：
gctccctaaaagggttacgccaccggcttcgggtgttacaaactctcatggtgtgacgggcggtgtgtacaaggcccgggaacgtattcaccgcggcgtgctgatccgcgattactagcgattccgacttcgtgtaggcgagttgcagcctacagtccgaactgagaatggctttaagagattagcttgacctcgcggtctcgcaattcgttgtaccatccattgtagcacgtgtgtagcccaggtcataaggggcatgatgatttgacgtcatccccaccttcctccggtttgtcaccggcagtcttattagagtgcccaactaaatgctggcaactagtcataagggttgcgctcgttgcgggacttaacccaacatctcacgaaacgagctgacgagaaccatacaccacctgtcattttgcccccgaaggggaaacctgatctctcaggtgatcaaaagatgtcaagacctggaaaggttcttcgcgttgcttcgaattaaaccacatgctccaccgcttgtgcgggcccccgtcaattcctttgagtttcaaccttgcggtcgtactccccaggcggaatgcttaatgcgttagctgcggcaatgaagggcggaaaccctccaacacctagcattcatcgtttacggcatggactaccagggtatctaatcctgttcgctaaccatgctttcgagcctcagcgtaagttacagaccagacagccgccttcgccactggtgttcttccatatatctacgcatttcaccgctacacatggagttccactgtcctcttctgcactcaagtttcccagtttccgatgcacttcctcggttaagccgagggctttcacatcagacttaaaaaaccgccttcgctcgctttacgcccaataaattcggataacgcttgccacctacgtattaccgcggctgctggcacgtagttagccgtggctttctggttggataccgtcacgccgacaacagttactctgccgaccattcttctccaacaacagagttttacgacccgaaagccttcttcactcacgcggcgttgctccatcagacttgcgtccattgtggaagatttcctactgctgcctcccgtaggagtttgggccgtgtctcagtcccaatgtggccgatcaacctctcagttcggctacgtatcattgccttggtgagccgttacctcaccaactagctaatacgccgcgggtccatccaaaagcgatagcttacgccatctttcagccaagaaccatgcggttcttggatttatgcggtattagcatctgtttccaaatgttatcccccacttaagggcaggttaaccacgtgttactcacccgtccgccactcgttcaaaattaaatcaagatgcaagcacctttcaataatcagaactcgttcgact。
鼠李糖乳杆菌YKSW碳源代谢试验结果如表1所示。
表1鼠李糖乳杆菌YKSW碳源代谢结果表
纤维二糖 蜜二糖 龙胆二糖 甘露醇 苦杏仁苷
+ - + - +
乳糖 麦芽糖 甘露糖 水杨苷 海藻糖
- + + + +
松三糖 棉子糖 山梨糖醇 木糖 鼠李糖
+ - + - +
蔗糖 半乳糖 阿拉伯糖 葡萄糖酸钠 菊粉
+ + + + -
果糖 D-塔格糖 土伦糖 糖原 甘油
+ + - - +
注：“+”为阳性反应； “-”为阴性反应。
实施例2鼠李糖乳杆菌YKSW对抗生素的耐受性实验
分别配制氨苄西林、四环素、红霉素、庆大霉素、链霉素、克林霉素2048 μg/mL的贮存液，-20℃保存备用。使用时将贮存液用BSM液体培养基进行2倍系列梯度稀释成使用液，梯度稀释浓度为1~1024μg /mL共11个梯度。
将鼠李糖乳杆菌YKSW接种于MRS液体培养基中，37℃培养24h；将新鲜菌液5000rpm离心5 min，用无菌生理盐水洗一次，再用同体积生理盐水重悬菌体后稀释50倍，作为接种液。
采用微量肉汤稀释法测定抗生素对鼠李糖乳杆菌YKSW的最小抑菌浓度MIC值。
具体结果见表2。
表2 鼠李糖乳杆菌YKSW的抗生素MIC值（μg/mL）
从表2的结果可以看出，本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW对四环素、氨苄西林等常见抗生素较敏感，生物安全性良好。
实施例3鼠李糖乳杆菌YKSW的抑菌性能测定
1、乳酸菌菌液制备：
将鼠李糖乳杆菌YKSW接种于100mL MRS液体培养基中，37℃静置培养48h；
2、致病菌菌液制备：
分别将大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌（四种致病菌均由山东大学赠送）接种于营养肉汤培养基，37℃摇床培养过夜；
3、抑菌实验—双层平板，牛津杯法：
每5mL灭菌营养琼脂培养基（50℃左右）加100μL致病菌菌液（菌量106数量级），混匀后倾倒至营养琼脂平板做成双层平板，凝固后在培养基上放置牛津杯，向牛津杯中添加200μL培养好的乳酸菌菌液，待菌液扩散后放入37℃培养箱中培养20h，观察抑菌圈直径。结果如表3所示。
表3 鼠李糖乳杆菌YKSW对致病菌的抑制作用
致病菌 大肠杆菌 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 幽门螺旋杆菌
抑菌圈直径 30mm 23 mm 26mm 31 mm
从表3的数据可以看出，本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌均有显著的抑制作用，尤其对大肠杆菌和幽门螺旋杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径超过30mm。
实施例4 鼠李糖乳杆菌YKSW耐胃酸、耐胆盐实验
1、耐胃酸性能检测方法：
取活化后的鼠李糖乳杆菌YKSW菌悬液40ml加入50ml离心管中，离心（5000g、5min）收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次后向离心管中加入40ml人工胃液（取稀盐酸16.4ml加水摇匀稀释至1000ml，用浓盐酸或10%的NaOH调整pH为2.0，于121℃灭菌30min，在无菌室以1g/100ml比例加胃蛋白酶），37℃水浴培养3h，每隔30min摇匀一次，于0h、2h和3h分别取样作活菌计数，以0h样品为对照，分别计算2h和3h样品菌体的存活率。
2、耐胆汁盐性能检测方法：
取活化后的鼠李糖乳杆菌YKSW菌悬液40ml加入50ml离心管中，离心（5000g、5min）收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次后向离心管中加入40ml人工肠液（配制方法：取KH2PO46.8g，加蒸馏水500ml溶解，用0.4%（w/v）的NaOH溶液调节pH值至6.8，加水至1000ml，每100ml溶液中加0.3g禽胆盐，充分溶解后，于115℃灭菌15min），37℃水浴培养2h，每隔30min摇匀一次，于0h、2h和3h分别取样作活菌计数，以0h样品为对照，分别计算2h和3h样品菌体的存活率。
存活率=（2h或3h时的活菌数/0h时的活菌数）×100%。
同时，以鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552作为对照，进行上述耐胃酸和耐胆汁盐性能检测。具体结果见表4。
表4鼠李糖乳杆菌YKSW耐胃酸、耐胆汁盐性能检测结果
从表4中的数据可以看出，本发明筛选到的鼠李糖乳杆菌YKSW具有非常强的耐胃酸、耐胆汁盐能力。该菌株在人工胃酸和肠液中3h时的存活率分别高达197.40%和90.45%，远远高于对照菌；而且，与2h时的存活率相比，该菌株在人工胃液中3h时的存活率得到明显提高，说明鼠李糖乳杆菌YKSW在胃酸中不但能够有效存活，而且还实现了增殖，取得了意料不到的效果。
实施例5 鼠李糖乳杆菌VHProbi O17产胞外多糖的制备
将鼠李糖乳杆菌YKSW菌株活化后，以5％（v/v）的接种量接种到MRS液体培养基中，37℃培养48 h；将发酵液10000g离心20 min，收集上清液；将上清液中加入3倍体积的预冷无水乙醇，4℃醇沉36h；10000g离心20 min，收集沉淀；用去离子水充分溶解沉淀后，向其中加入同等剂量的10%（m/v）三氯乙酸溶液，4℃放置过夜；再次以10000g离心20 min，去除蛋白，收集上清液。将得到的上清液再次醇沉过夜后离心，收集多糖沉淀。
将多糖沉淀用去离子水溶解后，装入透析袋(MW Cut-off 14 000 Da )；用去离子水透析2天，去除小分子杂质，即得到胞外粗多糖溶液。经过冷冻干燥，得到粉末状胞外粗多糖。将粗多糖加入同等剂量的去离子水后，采用苯酚-硫酸法测定并比较胞外多糖产量。
同时以鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552作为对照菌株，采用上述同样的操作，测定对照菌胞外多糖的产量。
具体结果见表5。
表5 鼠李糖乳杆菌YKSW胞外多糖产量
菌 株 胞外多糖产量
鼠李糖乳杆菌YKSW 689.4 mg/L
对照菌鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552 126.7 mg/L
从表5的结果可知，本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW能高产胞外多糖，产量达689.4 mg/L，远远高于对照菌，取得了意料不到的技术效果。
实施例6 鼠李糖乳杆菌YKSW的抗氧化能力测定
将鼠李糖乳杆菌YKSW进行传代活化后，按5%的体积比接种于MRS液体培养基， 37℃静置培养24h，3 000 r /min，离心15 min，分别收集发酵上清和菌体。
制备无细胞提取物：用pH值为7.4的磷酸缓冲溶液( PBS) 洗涤菌体3次，重新悬浮于磷酸缓冲溶液中，调整菌数至109 cfu /ml；然后超声波冰浴破碎菌体，10000 r /min 离心10 min，上清液即为无胞提取物。
1、DPPH·自由基清除实验
DPPH·是一种很稳定的以氮为中心的自由基，若受试物能清除它，则表示受试物抗氧化效果显著。
DPPH·溶液；各取1 ml发酵上清液和无细胞提取物，分别加入1 ml浓度为0.2mmol /L的DPPH·，混匀，室温下静置30min后，在517 nm处测吸光度变化。
DPPH·的清除率( %) = ［1- ( A1 -A2) /A3］×100。
式中: A1表示未加样品的DPPH ·溶液的原始吸光度；
A2表示样品在测定波长时的本身吸光度；
A3表示加样后DPPH 溶液的吸光度。
结果显示：鼠李糖乳杆菌YKSW 的发酵上清液和无细胞提取物均能强力去除DPPH·，其清除率分别高达78.62%和61.2%。
2、羟基自由基清除实验
ROS自由基中，羟基自由基是最有活性的，在金属离子(如铜离子或铁离子)存在的条件下，超氧阴离子和过氧化氢能生成羟基自由基。羟基自由基是一种氧化性很强的自由基，会对生物细胞大分子造成损伤而影响细胞的正常功能。因此，对羟基自由基的清除能力是抗氧化性能的一个主要指标。
ESR法测定清除羟基自由基的能力：分别将50 µL鼠李糖乳杆菌YKSW 的发酵上清液和无细胞提取物各加入到50 µL浓度为0.3 mol/L的DMPO后，把反应的体系转入到密封的石英毛细管中，然后加50 µL浓度为10 mol/L的H2O2启动反应。反应2.5 min后，通过ER200D SRC ESR光谱仪分析。对照为0.05 mol/L的磷酸盐缓冲溶液（pH 7.4）。样品对•OH的清除作用以清除率表示。
清除率=（H0—H）/ H0×100%。
式中：H和H0分别表示样品与对照波谱信号强度，信号的相对强度用波谱信号的第二个峰值来表示。
结果显示：鼠李糖乳杆菌YKSW 的发酵上清液和无细胞提取物对羟基自由基的清除率分别高达80.15%和60.33%。
上述结果表明，本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW具有很强的抗氧化能力，其发酵液上清液和无细胞提取物能高效清除自由基，而且发酵上清液的清除效果要明显高于无细胞提取物。从而说明鼠李糖乳杆菌YKSW生长期间的代谢产物对自由基的清除发挥更重要的作用，抗氧化能力更强。
3、菌株抗脂质过氧化实验
（1）亚油酸乳化液制备：0.1mL亚油酸，0.2mL Tween 20，19.7mL去离子水。
（2）0.5 mL的PBS溶液（pH 7.4）中加入1 mL亚油酸的乳化液，1 mL FeSO4（1%），再加入0.5 mL鼠李糖乳杆菌YKSW 的发酵上清液，37℃水浴1.5 h，混合液加入0.2 mL TCA（4%），2 mL TBA（0.8%），100 ℃水浴30 min，迅速冷却，4000 rpm/min离心15 min，收集上清液在532 nm下测吸光度即为A；对照组以0.5 mL蒸馏水代替样品即为A0。
抑制率（%）＝(A0－A)/ A0×100%。
注： A为样品组吸光度；A0为对照组吸光度。
同时以鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552作为对照菌株，采用上述同样的操作，测定对照菌的脂质过氧化抑制率。结果见表6。
表6 鼠李糖乳杆菌YKSW抗脂质过氧化能力
菌 株 脂质过氧化抑制率
鼠李糖乳杆菌YKSW 69.55%
对照菌鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552 19.83%
从表6的结果可知，本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW具有很强的抗脂质过氧化能力，其发酵上清液对脂质氧化的抑制率高达69.55%，远远高于对照菌，取得了意料不到的技术效果。
实施例7鼠李糖乳杆菌YKSW对胆固醇的体外去除效果
本实验参照Brashears等( 1998)的方法，并略有改进。
将鼠李糖乳杆菌YKSW菌株活化后接种于MRS 培养基，37℃培养过夜，作为种子液。
配制含5%（v/v）蛋黄液的MRS 培养基，取其中2 ml培养基，5000 r/min离心7min，取1ml上清液置于离心管中，加入9ml无水乙醇，振荡处理5 min，10000 r /min离心10min，取2 ml上清液加入2 ml P-Fe-S 试剂，冰浴混匀反应30 min，测OD550，计算培养基中胆固醇的初始含量。
然后，将鼠李糖乳杆菌YKSW的种子液接种至上述MRS培养基中，在37℃条件下培养24 h后，再次测定培养基中胆固醇的最终含量，计算鼠李糖乳杆菌YKSW对胆固醇的去除率。同时以鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552作为对照菌株，采用上述同样的操作，计算该菌对胆固醇的去除率。具体结果见表7。
胆固醇去除率=（初始含量－最终含量）/初始含量×100%。
表7鼠李糖乳杆菌YKSW对胆固醇的去除效果
菌 株 胆固醇去除率
鼠李糖乳杆菌YKSW 89.38%
对照菌鼠李糖乳杆菌CGMCC1.552 26.27%
从表7的结果可知，本发明提供的鼠李糖乳杆菌YKSW能高效去除胆固醇，去除率高达89.83%，显著高于对照菌株，取得了意料不到的技术效果。
实施例8 一种益生菌制剂及其制备方法
将水、脱脂奶粉、葡萄糖加入到配制罐中，搅拌溶解，定容，得到发酵培养基，其中各原料的含量分别为：脱脂奶粉80g/L、葡萄糖150g/L；95℃处理8～10min后，冷却至37～40℃。
按发酵量的10%将鼠李糖乳杆菌YKSW种子液接种于发酵培养基中，37℃培养24h，得发酵液；将发酵液在4℃，5000r/min 条件下离心10min，收集菌泥，用无菌生理盐水洗涤2次；将菌泥进行真空冷冻干燥，至含水量小于1%，并在低温条件下研磨成60目的粉末，即制得鼠李糖乳杆菌YKSW冻干粉，活菌数约为4.5×1010 CFU/g。
将鼠李糖乳杆菌YKSW冻干粉与低聚果糖、麦芽糊精和风味剂复配得到粉末状产品，即为益生菌制剂，其中各组分的质量百分比分别为：鼠李糖乳杆菌YKSW冻干粉50%、低聚果糖15%、麦芽糊精20%和风味剂15%。
实施例9 一种益生菌制剂及其制备方法
将水、脱脂奶粉、葡萄糖加入到配制罐中，搅拌溶解，定容，得到发酵培养基，其中各原料的含量分别为：脱脂奶粉120 g/L、葡萄糖70 g/L；95℃处理8～10min后，冷却至37～40℃。
按发酵量的8%将鼠李糖乳杆菌YKSW种子液接种于发酵培养基中，39℃培养20h，得发酵液；将发酵液在4℃，5000r/min 条件下离心10min，收集菌泥，用无菌生理盐水洗涤2次；将菌泥进行真空冷冻干燥，至含水量小于1%，并在低温条件下研磨成60目的粉末，即制得鼠李糖乳杆菌YKSW冻干粉，活菌数约为3.5×1010 CFU/g。
将鼠李糖乳杆菌YKSW冻干粉与低聚果糖、麦芽糊精和风味剂复配得到粉末状产品，即为益生菌制剂，其中各组分的质量百分比分别为：鼠李糖乳杆菌YKSW冻干粉75%、低聚果糖10%、麦芽糊精10%和风味剂5%。
实施例10 一种益生菌制剂及其制备方法
将水、脱脂奶粉、葡萄糖加入到配制罐中，搅拌溶解，定容，得到发酵培养基，其中各原料的含量分别为：脱脂奶粉100 g/L、葡萄糖100 g/L；95℃处理8～10min后，冷却至37～40℃。
按发酵量的5%将鼠李糖乳杆菌YKSW种子液接种于发酵培养基中，40℃培养18h，得发酵液；将发酵液在4℃，5000r/min 条件下离心10min，收集菌泥，用无菌生理盐水洗涤2次；将菌泥进行真空冷冻干燥，至含水量小于1%，并在低温条件下研磨成60目的粉末，即制得鼠李糖乳杆菌YKSW冻干粉，活菌数约为4.1×1010 CFU/g。
将鼠李糖乳杆菌YKSW冻干粉与低聚果糖、麦芽糊精和风味剂复配得到粉末状产品，即为益生菌制剂，其中各组分的质量百分比分别为：鼠李糖乳杆菌YKSW冻干粉60%、低聚果糖14%、麦芽糊精12%和风味剂14%。
实施例11 益生菌制剂对大鼠体内胆固醇的清除效果
11.1 实验材料
1、实验动物
5周龄SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，平均体重110.32±3.12 g，由浙江中医药大学动物实验研究中心提供。
2、饲料配方
基础饲料配方:麸皮26%，玉米20%，豆料20%，面粉20%，米粉10%，鱼粉2%，骨粉2%。
高脂饲料配方:基础饲料52%，猪油10%，蛋黄粉5%，蔗糖3.5%，豆粉5%,奶粉8%，干酪素5%，花生5%，麻油1%，食盐1%，维生素AD适量，胆固醇 3%，脱氧胆酸钠0.5%。
基础饲料与高脂饲料均委托新希望六和饲料股份有限公司生产。
3、益生菌制剂
将本发明实施例10制备得到的益生菌制剂加入蒸馏水充分溶解，配制成益生菌溶液，其中活菌量约为109CFU/mL。
为防止益生菌死亡而影响结果，益生菌溶液每次现用现配。
11.2 实验方法
1、分组
对照组：10只，基础饲料+生理盐水灌胃，模拟正常状态下生长的SD大鼠。
模型组：10只，高脂饲料+生理盐水灌胃，通过高脂饲料饲养诱发SD大鼠形成高脂血症模型。
益生菌干预组A：10只，高脂饲料+益生菌溶液灌胃（每天灌胃两次，体积0.1ml/次）。
益生菌干预组B：10只，高脂饲料+益生菌溶液灌胃（每天灌胃两次，体积0.2ml/次）
2、动物喂养
所有SD大鼠饲养于SPF级动物房。12h/12h光照/黑暗循环，自由摄食饮水，温度维持20-26℃，相对湿度40-70%。
先予适应性喂养1周，自由饮水，每天给予基础饲料 15g/只。第2周第1天称量体重并进行随机分组。
对照组给予普通饲料，模型组和益生菌干预组给予高脂饲料，各组均饲养6周，自由饮水、进食。
3、实验样本的采集与检测指标的测定
（1）血脂检测
采集6周末大鼠腹腔静脉血，室温放置30分钟左右，待凝固后，于4℃下，7000 g/min 离心10分钟，收集上层血清。
分别用试剂盒测定血清中胆固醇（TC）、甘油三酯(TG)、低密度脂蛋白(LDL-C)、高密度脂蛋白（HDL-C）指标。
（2）肝组织胆固醇和甘油三酯测定
取出冷藏的肝脏，切取并准确称量0.5g 置于干净研钵中，加入5 mL甲醇与氯仿混合液（体积比 2:1），充分研磨。完全磨碎后将研磨混合液转至刻度试管内，并用4.5 mL甲醇与氯仿混合液（体积比 2:1）冲洗研磨器，洗涤液一并转至刻度试管，将前后两次收集的匀浆混合液定容至10 mL，置于水浴锅 45℃温浴 1 小时，然后 8000 g，10 min，4℃离心收集上清液，取 30 μL，用试剂盒测定胆固醇和甘油三酯的质量浓度。
（3）大鼠粪便中胆固醇和胆汁酸含量测定
大鼠粪便用真空冷冻机将其冷冻干燥后，分别称取样品0.5 g，加入5 mL去离子水于研磨器中进行研磨，完全磨碎后4000 rpm离心l0 min，取上清液，用试剂盒测定胆固醇和总胆汁酸含量。
11.3 实验结果
1、血脂检测结果分析：
表8 各组大鼠血清中TC、TG、LDL-C、HDL-C水平（mmol/L）
分 组 胆固醇 甘油三酯 低密度脂蛋白 高密度脂蛋白
对照组 1.81±0.18 1.66±0.27 0.38±0.09 1.24±0.13
模型组 3.79±0.33 2.69±0.39 1.48±0.28 1.09±0.13
益生菌干预组A 2.05±0.21 1.76±0.24 0.53±0.25 1.00±0.15
益生菌干预组B 1.91±0.26 1.69±0.28 0.50±0.11 0.98±0.22
从表8的结果可知，与对照组相比，模型组大鼠血清中胆固醇和甘油三酯水平得到显著提高，说明高脂血症造模方法恰当有效，模型成功。
与模型组相比，灌胃益生菌制剂的干预组大鼠血清中胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平分别降低了45.9-49.6%，34.5-37.2%，64.2-66.2%，高密度脂蛋白水平无显著差异。从而说明，本发明提供的益生菌制剂能有效降低高脂血症SD大鼠血清中的胆固醇、甘油三酯和低密度脂蛋白水平，且灌胃剂量增加的情况下，效果更好。
2、肝组织胆固醇和甘油三酯测定结果：
表9 各组大鼠肝脏中胆固醇和甘油三酯的质量浓度（mg/g）
分 组 胆固醇（mg/g） 甘油三酯（mg/g）
对照组 7.81±0.58 1.46±0.78
模型组 24.79±1.33 41.52±0.89
益生菌干预组A 14.05±0.98 25.34±0.64
益生菌干预组B 11.88±0.56 20.49±0.82
从表9的数据可知，与对照组相比，模型组大鼠肝脏中的胆固醇和甘油三酯含量显著升高，差异具有显著性。与模型组相比，灌胃益生菌制剂的干预组大鼠肝组织中胆固醇与甘油三酯含量分别下降了43.3-52.1%、39.0-50.3%，效果非常显著。从而说明，本发明提供的益生菌制剂能有效降低大鼠肝脏中的胆固醇和甘油三酯含量，且灌胃剂量增加的情况下，效果更好。
3、粪便中胆固醇和游离胆汁酸含量测定结果分析：
表10 各组大鼠粪便中胆固醇、游离胆汁酸的质量浓度（mg/g）
分 组 胆固醇（mg/g） 游离胆汁酸（μmol/g）
对照组 11.08±0.35 8.46±1.22
模型组 24.33±1.18 18.12±0.39
益生菌干预组A 30.35±0.76 26.44±0.16
益生菌干预组B 36.23±0.86 38.69±1.22
从表10的数据可知，高脂饮食的三组大鼠随粪便排出的胆固醇量均高于对照组，差异具有显著性（p<0.05），说明高脂饮食所摄入的过量胆固醇不能被大鼠完全代谢而排出体外，从而增加了大鼠粪便中胆固醇的含量。
与模型组相比，灌胃益生菌制剂的干预组大鼠粪便中胆固醇和游离胆汁酸的含量分别提高了24.7-48.9%和45.9-113.5%。从而说明本发明提供的益生菌制剂能显著提高胆固醇的排除率，且灌胃剂量增加的情况下，效果更好。
综上，本发明提供的益生菌制剂能显著提高大鼠粪便中总胆汁酸和胆固醇的排泄量，降低血脂水平，改善机体的脂质代谢，取得了意料不到的技术效果。
序列表
<110> 内蒙古一康健康发展有限责任公司
<120> 一种具有清除胆固醇功能的益生菌制剂及其制备方法
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1427
<212> DNA
<213> 鼠李糖乳杆菌(Lactobacillus rhamnosus)
<400> 1
gctccctaaa agggttacgc caccggcttc gggtgttaca aactctcatg gtgtgacggg 60
cggtgtgtac aaggcccggg aacgtattca ccgcggcgtg ctgatccgcg attactagcg 120
attccgactt cgtgtaggcg agttgcagcc tacagtccga actgagaatg gctttaagag 180
attagcttga cctcgcggtc tcgcaattcg ttgtaccatc cattgtagca cgtgtgtagc 240
ccaggtcata aggggcatga tgatttgacg tcatccccac cttcctccgg tttgtcaccg 300
gcagtcttat tagagtgccc aactaaatgc tggcaactag tcataagggt tgcgctcgtt 360
gcgggactta acccaacatc tcacgaaacg agctgacgag aaccatacac cacctgtcat 420
tttgcccccg aaggggaaac ctgatctctc aggtgatcaa aagatgtcaa gacctggaaa 480
ggttcttcgc gttgcttcga attaaaccac atgctccacc gcttgtgcgg gcccccgtca 540
attcctttga gtttcaacct tgcggtcgta ctccccaggc ggaatgctta atgcgttagc 600
tgcggcaatg aagggcggaa accctccaac acctagcatt catcgtttac ggcatggact 660
accagggtat ctaatcctgt tcgctaacca tgctttcgag cctcagcgta agttacagac 720
cagacagccg ccttcgccac tggtgttctt ccatatatct acgcatttca ccgctacaca 780
tggagttcca ctgtcctctt ctgcactcaa gtttcccagt ttccgatgca cttcctcggt 840
taagccgagg gctttcacat cagacttaaa aaaccgcctt cgctcgcttt acgcccaata 900
aattcggata acgcttgcca cctacgtatt accgcggctg ctggcacgta gttagccgtg 960
gctttctggt tggataccgt cacgccgaca acagttactc tgccgaccat tcttctccaa 1020
caacagagtt ttacgacccg aaagccttct tcactcacgc ggcgttgctc catcagactt 1080
gcgtccattg tggaagattt cctactgctg cctcccgtag gagtttgggc cgtgtctcag 1140
tcccaatgtg gccgatcaac ctctcagttc ggctacgtat cattgccttg gtgagccgtt 1200
acctcaccaa ctagctaata cgccgcgggt ccatccaaaa gcgatagctt acgccatctt 1260
tcagccaaga accatgcggt tcttggattt atgcggtatt agcatctgtt tccaaatgtt 1320
atcccccact taagggcagg ttaaccacgt gttactcacc cgtccgccac tcgttcaaaa 1380
ttaaatcaag atgcaagcac ctttcaataa tcagaactcg ttcgact 1427

Claims (9)

1.一种益生菌制剂，其特征在于，所述的益生菌制剂包含鼠李糖乳杆菌冻干粉，所述鼠李糖乳杆菌的保藏号为CCTCC NO：M2022337。
2.如权利要求1所述的益生菌制剂，其特征在于，所述鼠李糖乳杆菌冻干粉的制备方法，具体步骤包括：
1）配制液体发酵培养基，灭菌；
2）按发酵量的5-10%接种鼠李糖乳杆菌种子液，37-40℃，发酵18-24h，得发酵液；
3）将发酵液在4℃，5000r/min 条件下离心10min，进行离心，收集菌泥；
4）将菌泥进行真空冷冻干燥，至含水量小于1%；
5）在低温条件下，将冻干的菌泥研磨成60目的粉末，即得鼠李糖乳杆菌冻干粉。
3.如权利要求2所述的益生菌制剂，其特征在于，所述的液体发酵培养基中各组分及其含量分别为：脱脂奶粉80-120 g/L、葡萄糖70-150 g/L。
4.如权利要求3所述的益生菌制剂，其特征在于，所述的液体发酵培养基中各组分及其含量分别为：脱脂奶粉80g/L、葡萄糖150g/L。
5.如权利要求1-4任一所述的益生菌制剂，其特征在于，所述的益生菌制剂还包括淀粉、羟丙纤维素、无水硫酸钙、麦芽糊精、低聚半乳糖、水苏糖、低聚果糖、乳粉、风味剂中的一种或多种的组合。
6.如权利要求5所述的益生菌制剂，其特征在于，所述的益生菌制剂还包括麦芽糊精、低聚果糖和风味剂。
7.如权利要求6所述的益生菌制剂，其特征在于，所述的益生菌制剂中各组分及其质量百分比为：鼠李糖乳杆菌冻干粉50-75%、低聚果糖10-15%、麦芽糊精10-20%和风味剂5-15%。
8.如权利要求7所述的益生菌制剂，其特征在于，所述的益生菌制剂中各组分及其质量百分比为：鼠李糖乳杆菌冻干粉60%、低聚果糖14%、麦芽糊精12%和风味剂14%。
9.权利要求1-8任一所述的益生菌制剂在制备具有清除胆固醇功能的制品中的应用。
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