CN106434433B - 一种新型发酵乳杆菌及其在乳酸菌饮料中的应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及微生物筛选与应用技术领域，具体提供了一株新型发酵乳杆菌。所述发酵乳杆菌保藏编号为CCTCC NO：M2016430。该菌株对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，尤其对幽门螺旋杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径高达23mm。所述发酵乳杆菌对胃酸和胆汁盐的耐受性强，且能在胃酸环境下实现有效增殖。所述发酵乳杆菌对胆固醇的去除率达到93.2%；在1.2 mmol/L H2O2中仍能保持98.5％的存活率；其发酵上清液和无细胞提取物对羟基自由基的清除率分别高达95.1%和90.4%。所述发酵乳杆菌可广泛应用于乳酸菌饮料的制备，能明显增加肠道有益菌的数量，改善胃肠道健康，提高机体免疫力，应用前景广阔。

Description

一种新型发酵乳杆菌及其在乳酸菌饮料中的应用
技术领域
本发明涉及微生物筛选技术领域，具体提供了一种新型发酵乳杆菌及其在乳酸菌饮料中的应用。
背景技术
益生菌的概念源于希腊语“对生命有益的细菌”，益生菌通常是定植于动物肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效的活性有益微生物(细菌或者酵母)的总称。FAO/WHO《食品益生菌评价指南》明确规定，食品用益生菌是指“服用一定数量后对人体健康有益的活的微生物”，益生菌的有效性与活菌数量和菌种本身的性能密切相关。在我国，益生菌又称微生态调节剂、益生素等，益生菌类保健食品明确规定“益生菌菌种必须是人体正常菌群的成员,可利用其活菌、死菌及其代谢产物”。目前,益生菌仍然以乳酸菌为主,在很多情况下益生菌就是指乳酸菌。乳酸菌是指能发酵糖，主要产生乳酸的一类细菌的总称。绝大多数乳酸菌为革兰氏阳性菌，不运动、无芽孢，不具有过氧化氢酶，兼性厌氧或专性厌氧，可以将各种糖分解成乳酸。
乳酸菌不仅可以提高食品的营养价值、改善食品风味、提高食品保藏性和附加值，而且，近年来乳酸菌的特殊生理活性和营养功能正日益引起人们的重视。大量研究表明，乳酸菌对人体具有多方面的保健作用，如调节机体胃肠道正常菌群、保持体内微生态平衡、提高食物消化率和生物价、改善便秘、降低胆固醇水平、改善肝功能、缓解乳糖不耐症、控制内毒素、抑制肠道内腐败菌生长繁殖和腐败产物的产生、制造营养物质、刺激组织发育，从而对机体的营养状态、生理功能、细胞感染、药物效应、毒性反应、免疫反应、肿瘤发生、衰老过程和突然的应急反应等产生作用。由此可见，乳酸菌的生理功能与机体的生命活动息息相关，如果乳酸菌停止生长，人类就很难健康生存。
筛选开发优良乳酸菌必须具备的几个标准：(1)必须有好的宿主来源，能刺激宿主本身固有益生菌的生长，本身及其代谢产物能够为宿主提供有益于健康的功能。(2)要有一定的生活力和足够的浓度。在使用和贮备期间，能够继续稳定地维持其活性。(3)必须具有黏附或生长在胃肠黏膜上的能力，能够在胃肠道内微生态环境中定植。(4)必须在宿主内主动争夺营养。(5)要有比较高的蛋白水解酶和β-半乳糖苷酶的活性。
乳酸菌是自古以来就被人类所认识的一大类菌，随着人们对其特殊生理功能和保健功能的进一步认识，乳酸菌日益得到人们的重视。目前对乳酸菌的研究已从过去的食品奶酪和发酵乳制品转移到与人体的关系上来，随着人们对乳酸菌生长规律、作用机理的深入了解及分子生物技术的飞速发展，筛选开发出更多优良的乳酸菌菌种意义重大。
发明内容
本发明的目的是提供一种新型发酵乳杆菌及其应用。所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)筛选自自然发酵的酸菜汁中，耐酸性强，抗菌作用明显，应用前景广阔。
本发明一方面提供了一种发酵乳杆菌KDB-8(Lactobacillus fermentum KDB-8)，已经于2016年8月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016430。
所述发酵乳杆菌在乳酸菌饮料中的应用。
一种乳酸菌饮料，是通过将上述发酵乳杆菌进行发酵制备的。
所述乳酸菌饮料中发酵乳杆菌的活菌数超过30亿/mL。
本发明还提供了上述乳酸菌饮料的制备方法，具体步骤包括：
(1)配制液体发酵培养基，灭菌；
(2)按发酵量的3-5％将发酵乳杆菌接种至液体发酵培养基中；
(3)发酵温度35～40℃，发酵时间为10～20小时；
(4)将发酵液进行无菌灌装，包装，即得乳酸菌饮料。
所述的液体发酵培养基中各组分及其质量体积比分别为：红糖6.5％、葡萄糖5％、乳清粉0.07％、土豆泥0.06％、K2HPO4 0.03％、KH2PO4 0.02％、MgSO4 0.03％。
所述的液体培养基的初始pH值为5.5-6.0。
进一步优选的，所述的发酵温度为37.5℃。
有益效果
本发明筛选到的发酵乳杆菌KDB-8对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，尤其对幽门螺旋杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径高达23mm。所述发酵乳杆菌对胃酸和胆汁盐的耐受性强，且能在胃酸环境下实现有效增殖。所述发酵乳杆菌KDB-8对胆固醇的去除率达到93.2％；在1.2mmol/L H2O2中仍能保持98.5％的存活率；其发酵上清液和无细胞提取物对羟基自由基的清除率分别高达95.1％和90.4％。所述发酵乳杆菌可广泛应用于乳酸菌饮料的制备，能明显增加肠道有益菌的数量，改善胃肠道健康，提高机体免疫力，应用前景广阔。
具体实施例
实施例1发酵乳杆菌KDB-8分离筛选及鉴定：
1、筛选样品
从沈阳苏家屯农村收集自然发酵的酸菜汁作为分离样品，所述酸菜汁外观无污染、味道纯正，发酵时间超过1年，过滤后备用。
2、乳酸菌初筛
取过滤后的酸菜汁5mL加入45mL无菌水，混匀，涂布于加0.5％碳酸钙的MRS平板上，37℃培养48h，分离培养有透明圈的菌株，获得42株乳酸菌。
3、抑菌型乳酸菌筛选
1)乳酸菌液制备：将初筛得到的32株乳酸菌分别接种于100mL MRS液体培养基中，37℃静置培养48h；
2)致病菌菌液制备：大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌(四种致病菌均由山东大学赠送)，将菌种接种于营养肉汤，37℃摇床培养过夜；
3)抑菌实验—双层平板，牛津杯法：每5mL灭菌营养琼脂培养基(50℃左右)加100μL致病菌菌液(菌量106数量级)，混匀后倾倒至营养琼脂平板做成双层平板，凝固后在培养基上放置牛津杯，向牛津杯中添加200μL培养好的乳酸菌菌液，待菌液扩散后放入37℃培养箱中培养20h，观察抑菌圈直径。
结果显示，初筛获得的乳酸菌中对大肠杆菌、沙门氏菌、金黄色葡萄球菌和幽门螺旋杆菌的抑菌圈直径均超过15mm的菌株共8株。进一步对其进行抗生素耐受筛选。经过两次删选，最终申请人从上述8株菌中筛选得到对幽门螺旋杆菌的生长抑制作用最强的乳酸菌，命名为KDB-8。
表1乳酸菌KDB-8对致病菌的抑制作用
致病菌 大肠杆菌 沙门氏菌 金黄色葡萄球菌 幽门螺旋杆菌
抑菌圈直径 21mm 20mm 20mm 23mm
由上表可以看出，本发明筛选出的乳酸菌KDB-8对大肠杆菌、沙门氏菌和金黄色葡萄球菌均有明显的抑制作用，尤其对幽门螺旋杆菌的抑制作用最强，抑菌圈直径达到23mm。
3、菌株鉴定
利用试剂盒提取上述乳酸菌KDB-8的基因组DNA，利用PCR技术扩增16S rRNA序列。将测序结果在GenBank核酸数据库中进行blast比对发现，乳酸菌KDB-8的16S rRNA序列与发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)的序列相似度高于99％。因此，确认其为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，命名为发酵乳杆菌KDB-8(Lactobacillus fermentumKDB-8)，并于2016年8月29日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO:M2016430。
实施例2发酵乳杆菌KDB-8耐酸、耐胆盐实验
1、耐胃酸性能检测方法：
取活化后的发酵乳杆菌KDB-8菌悬液40ml加入50ml离心管中，离心(5000g、5min)收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次后向离心管中加入40ml人工胃液(取稀盐酸16.4ml加水摇匀稀释至1000ml，用浓盐酸或10％的NaOH调整pH为2.0，于121℃灭菌30min，在无菌室以1g/100ml比例加胃蛋白酶)，37℃水浴培养2h，每隔30min摇匀一次，于0h和2h分别取样作活菌计数，以0h样品为对照，计算2h样品菌体的存活率，存活率＝(2h时的活菌数/0h时的活菌数)×100％。
2、耐胆汁盐性能检测方法：
取活化后的植物乳杆菌DY-1菌悬液40ml加入50ml离心管中，离心(5000g、5min)收集菌体，用PBS缓冲液洗涤两次后向离心管中加入40ml人工肠液(配制方法：取KH2PO4 6.8g，加蒸馏水500ml溶解，用0.4％(w/v)的NaOH溶液调节pH值至6.8，加水至1000ml，每100ml溶液中加0.3g禽胆盐，充分溶解后，于115℃灭菌15min。)，37℃水浴培养2h，每隔30min摇匀一次，于0h、2h分别取样作活菌计数，以0h样品为对照，计算2h样品菌体的存活率，存活率＝(2h时的活菌数/0h时的活菌数)×100％。
同时，以嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CGMCC1.1854和干酪乳杆菌(Lactobacillus casei)CGMCC1.2435作为对照，进行上述耐胃酸和耐胆汁盐性能检测。具体结果见表2。
表2发酵乳杆菌KDB-8耐胃酸、耐胆汁盐性能检测结果
从表2中的数据可以看出，与嗜酸乳杆菌CGMCC：1.1854和干酪乳杆菌CGMCC：1.2435相比，本发明筛选到的发酵乳杆菌KDB-8具有非常强的耐胃酸、耐胆汁盐能力，尤其是其在胃酸中的存活率高达196.22％，明显高于对照菌株，说明所述发酵乳杆菌KDB-8在胃酸中不但能够有效存活，而且还实现了明显的增殖，取得了意料不到的效果。
实施例3发酵乳杆菌KDB-8对胆固醇的去除效果
本实验参照Brashears等(1998)的方法，并略有改进。
将发酵乳杆菌KDB-8菌株活化后接种于MRS培养基，37℃培养过夜，作为种子液。
配制含5％(v/v)蛋黄液的MRS培养基，取其中2ml培养基，5000r/min离心7min，取1ml上清液置于离心管中，加入9ml无水乙醇，振荡处理5min，10000r/min离心10min，取2ml上清液加入2ml P-Fe-S试剂，冰浴混匀反应30min，测OD550，计算培养基中胆固醇的初始含量。
然后，将发酵乳杆菌KDB-8的种子液接种至上述MRS培养基中，在37℃条件下培养24h后，再次测定培养基中胆固醇的最终含量，计算发酵乳杆菌KDB-8对胆固醇的去除率。同时以嗜酸乳杆菌(Lactobacillus acidophilus)CGMCC：1.1854作为对照菌株，采用上述同样的操作，计算嗜酸乳杆菌对胆固醇的去除率。
胆固醇去除率＝(初始含量－最终含量)/初始含量×100％
结果显示：本发明筛选到的发酵乳杆菌KDB-8对MRS培养基中胆固醇的去除率达到93.2％；而对照菌株嗜酸乳杆菌对胆固醇去除率仅为19.8％。从而说明发酵乳杆菌KDB-8对胆固醇的去除效果较好。
实施例3发酵乳杆菌KDB-8体外抗氧化实验
将发酵乳杆菌KDB-8进行传代活化后，以5％(质量比)接种量接种于MRS液体培养基，37℃静置培养18h，3 000r/min，离心15min，分别收集发酵上清和菌体。
制备无细胞提取物：用pH值为7.4的磷酸缓冲溶液(PBS)洗涤菌体3次，重新悬浮于磷酸缓冲溶液中，调整菌数至109cfu/ml；然后超声波冰浴破碎菌体，10000r/min离心10min，上清液即为无细胞提取物。
3.1发酵乳杆菌KDB-8对过氧化氢的耐受能力
过氧化氢是一种弱的氧化剂，但具有很好的扩散性，因此半衰期很长。由于这两个基本特性，过氧化氢本身就能造成氧化损伤，或者作为羟自由基的前体物质造成氧化损伤。
将60mL的MRS培养基加入到灭过菌的三角瓶中，添加H2O2，使培养基中的起始H2O2浓度分别为0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2mmol/L。按照1％的比例接种上述发酵乳杆菌KDB-8到液体培养基中，37℃培养20h，测定600nm波长处的吸光度A600nm，以吸光度反映其菌体浓度的变化，确定菌株对H2O2耐受性。
实验结果显示，240min后，发酵乳杆菌KDB-8在1.2mmol/L H2O2中仍能保持98.5％的存活率，从而说明发酵乳杆菌KDB-8具有很强的抗氧化能力。
3.2发酵乳杆菌KDB-8对羟基自由基的清除能力
ROS自由基中，羟基自由基是最有活性的，在金属离子(如铜离子或铁离子)存在的条件下，超氧阴离子和过氧化氢能生成羟基自由基。羟基自由基是一种氧化性很强的自由基，会对生物细胞大分子造成损伤而影响细胞的正常功能。因此，对羟基自由基的清除能力是抗氧化性能的一个主要指标。
ESR法测定清除羟基自由基的能力：分别将50μL发酵乳杆菌KDB-8的发酵上清液和无细胞提取物各加入到50μL浓度为0.3mol/L的DMPO后，把反应的体系转入到密封的石英毛细管中，然后加50μL浓度为10mol/L的H2O2启动反应。反应2.5min后，通过ER 200D SRC ESR光谱仪分析。对照为0.05mol/L的磷酸盐缓冲溶液(pH 7.4)。样品对·OH的清除作用以清除率表示。
清除率＝(H0—H)/H0×100％
式中：H和H0分别表示样品与对照波谱信号强度，信号的相对强度用波谱信号的第二个峰值来表示。
结果显示：发酵乳杆菌KDB-8的发酵上清液和无细胞提取物对羟基自由基的清除率分别高达95.1％和90.4％，从而说明本发明提供的发酵乳杆菌KDB-8的发酵液上清液和无细胞提取物均具有较强的抗氧化能力，能有效清除羟基自由基，而且该菌株发酵上清液的清除效果要明显高于无细胞提取物，这说明发酵乳杆菌KDB-8生长期间的代谢产物对羟基自由基的清除发挥更重要的作用，抗氧化能力更强。
实施例4利用发酵乳杆菌KDB-8制备乳酸菌饮料
配制液体发酵培养基：在发酵罐中加入适量水，分别将红糖、葡萄糖、乳清粉、土豆泥、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4加入到罐中，搅拌溶解后定容。利用高温蒸汽控制发酵罐内压力0.09～0.10MPa，使温度控制在115℃～121℃，杀菌25～45min，结束后冷却降温至35～40℃，其中各成分的质量体积比最终分别为：红糖6.5％、葡萄糖5％、乳清粉0.07％、土豆泥0.06％、K2HPO4 0.03％、KH2PO4 0.02％、MgSO4 0.03％，培养基的初始pH值为5.5-6.0。
按发酵量的3-5％接种上述发酵乳杆菌KDB-8的种子液于发酵罐中，搅拌15min，充分混匀后关闭搅拌；控制发酵温度为35～40℃，发酵时间为10～20小时，冷水迅速降温至10℃以下，进行无菌灌装、包装，即得到乳酸菌饮料，其中发酵乳杆菌KDB-8活菌数超过30亿/mL。
实施例5乳酸菌饮料的效果评价
从健康人群中随机挑选成年男女各10名，收集其新鲜粪便检测其中的乳酸菌及双歧杆菌数平均为2.23×108CFU/g和8.54×109CFU/g。20名健康成年人每天食用本发明所述乳酸菌饮料50ml，一周后检测其新鲜粪便中乳酸菌及双歧杆菌数平均为9.87×109CFU/g和9.22×1011CFU/g。从结果看，食用该乳酸菌饮料能明显提高人体肠道内乳酸菌和双歧杆菌的数量，有效改善胃肠道健康，提高机体免疫力，取得了意料不到的技术效果。
此外，长期研究数据表明，每日饮用本发明提供的乳酸菌饮料，不仅能大幅增加肠道中益生菌的数量，改善胃肠道的消化与吸收功能，还能有效降低人体血液中胆固醇的含量，清除自由基，增强机体的免疫力，维护身体健康。
实施例6乳酸菌制剂的制备方法
配制液体发酵培养基：在发酵罐中加入适量水，分别将红糖、葡萄糖、乳清粉、土豆泥、K2HPO4、KH2PO4、MgSO4加入到罐中，搅拌溶解后定容。利用高温蒸汽控制发酵罐内压力0.09～0.10MPa，使温度控制在115℃～121℃，杀菌25～45min，结束后冷却降温至35～40℃，其中各成分的质量体积比最终分别为：红糖6.5％、葡萄糖5％、乳清粉0.07％、土豆泥0.06％、K2HPO4 0.03％、KH2PO4 0.02％、MgSO4 0.03％，培养基的初始pH值为5.5-6.0。
按发酵量的3-5％接种上述发酵乳杆菌KDB-8的种子液于发酵罐中，搅拌15min，充分混匀后关闭搅拌；控制发酵温度为35～40℃，发酵时间为10～20小时；将发酵液离心，真空冷冻干燥至含水量小于3％，即制得发酵乳杆菌KDB-8冻干粉。
称取1.0g发酵乳杆菌KDB-8与麦芽糊精、低聚果糖等量混合后制成胶囊剂，也可将发酵乳杆菌KDB-8冻干粉压碎成粉末状，并加入适量奶粉、低聚糖、麦芽糊精、风味剂等制成粉末状或片状产品，用于日常食用或作为保健品。
实施例7发酵乳杆菌KDB-8对慢性胃炎的治疗效果
挑选慢性胃炎患者100例,症状可见反酸,烧心,上腹痛等，经胃镜检查确诊为幽门螺旋杆菌(HP)阳性消化性溃疡。
采用SPSS17.0统计软件的随机数发生法产生试验病例随机号码，并进行完全随机样本分配，按1:1比例将符合标准的患者分为治疗组和对照组，各50例，治疗组中男26例，女24例；年龄25-43岁，对照组中男23例，女27例；年龄23-45岁，两组患者性别,年龄等一般资料比较，差异无统计学意义，具有可比性。
对照组患者予标准三联疗法：即雷贝拉唑钠肠溶片(四川迪康科技药业股份有限公司成都迪康制药公司)每次20mg，晨服，每日1次；阿莫西林胶囊(珠海联邦制药股份有限公司中山分公司)每次1.0g，饭后半小时服用，每日2次；克拉霉素片(江苏恒瑞医药股份有限公司)每次0.5g，饭后半小时服药，每日2次。治疗组加用本发明实施例4制得的发酵乳杆菌胶囊剂，每日2次。两组患者均服药2周。
疗效评价依据内镜检查和14C尿素呼气试验检查结果。痊愈：内镜下溃疡完全愈合5周围无红肿等炎症反应；显效：内镜下溃疡完全愈合，但周围仍有红肿等炎症反应；有效：内镜下溃疡面积较治疗前缩小超过1/2；无效：内镜下溃疡面积较治疗前缩小不足1/2；总有效＝痊愈+显效+有效。观察治疗期间幽门螺旋杆菌(HP)的根除及溃疡愈合情况。具体治疗结果见表3。
表3两组患者治疗效果比较
从表3的数据可以看出，与对照组相比，治疗组的有效率、溃疡愈合率和幽门螺旋杆菌根除率均得到明显提高，表明在标准三联疗法基础上加用本发明提供的发酵乳杆菌KDB-8，可明显提高临床疗效，促进溃疡愈合，并杀死幽门螺旋杆菌，效果显著，且治疗耐受性好，适合在临床上进行应用推广。

Claims (7)

1.一种发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)KDB-8，其特征在于，所述的发酵乳杆菌的保藏编号为CCTCC NO:M2016430。
2.权利要求1所述的发酵乳杆菌在乳酸菌饮料中的应用。
3.一种乳酸菌饮料，其特征在于，所述的乳酸菌饮料是通过将权利要求1所述的发酵乳杆菌进行发酵制备的。
4.权利要求3所述的乳酸菌饮料的制备方法，其特征在于，所述的制备方法包括：
(1)配制液体发酵培养基，灭菌；
(2)按发酵量的3-5％将权利要求1所述的发酵乳杆菌接种至液体发酵培养基中；
(3)发酵温度35～40℃，发酵时间为10～20小时；
(4)将发酵液进行无菌灌装，包装，即得乳酸菌饮料。
5.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的液体发酵培养基中各组分及其质量体积比分别为：红糖6.5％、葡萄糖5％、乳清粉0.07％、土豆泥0.06％、K2HPO4 0.03％、KH2PO4 0.02％、MgSO4 0.03％。
6.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的液体发酵培养基的初始pH值为5.5-6.0。
7.如权利要求4所述的制备方法，其特征在于，所述的发酵温度为37.5℃。
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