CN102226157A

CN102226157A - 一株发酵乳杆菌及其应用

Info

Publication number: CN102226157A
Application number: CN2011101165718A
Authority: CN
Inventors: 谯仕彦; 宋青龙; 丁修良; 张海燕
Original assignee: BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY CENTER
Current assignee: BEIJING LONGKE FANGZHOU BIOLOGICAL ENGINEERING TECHNOLOGY CENTER
Priority date: 2011-05-06
Filing date: 2011-05-06
Publication date: 2011-10-26
Anticipated expiration: 2031-05-06
Also published as: CN102226157B

Abstract

本发明公开了一株发酵乳杆菌及其应用。该发酵乳杆菌为Lactobacillus fermentumHAFI5007，2011年3月11日在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4648。本发明的发酵乳杆菌主要作为动物的饲料添加剂，提高猪营养物质消化率，改善胃肠道微生物菌系组成、肠道粘液蛋白表达以及肠道粘膜免疫功能，改善机体的抗氧化防御系统，缓解氧化应激造成的氧化损伤，改善提高猪的生产性能。

Description

一株发酵乳杆菌及其应用

技术领域

本发明涉及一株发酵乳杆菌及其应用，属于生物技术领域。

背景技术

饲料中添加抗生素能够抵抗疾病，促进动物的生长，加快集约化畜牧业的发展。但是随着人们生活水平的提高和对健康程度的不断重视，抗生素添加剂在给人们带来巨大的经济利益的同时其负面效应逐渐显现，最典型的特征就是抗生素引起的耐药性，内源性感染、二重感染以及食品中残留，这些将对养殖业、饲料工业和动物带来严重威胁，进而通过食物链危机人类健康。因此，禁止抗生素添加剂在畜牧业中使用的呼声越来越高，研究和开发新的抗生素替代品的工作迫在眉睫。

近年来，益生菌因其安全、绿色无污染且对动物生长具有显著作用而被作为抗生素替代品的首要选择。乳酸杆菌是益生菌中的主要菌种，它是动物消化道栖生微生物，在防治胃肠道感染、调节免疫功能和调节肠道的微生物菌群平衡中具有较好作用，如能够促进仔猪增重、降低猪肠道的pH值、改善血液生化指标，增强消化道内酶活性及降低肠道大肠杆菌数等，使用乳酸杆菌益生素可以调整胃肠道微生态平衡，所以乳酸杆菌是一种很有前途的益生素生产菌种。美国FDA和AAFCO在1989年公布的安全微生物品种共43种，其中乳酸杆菌占12种，中华人民共和国农业部2011年公布允许使用的19种饲用微生物中有6种是乳酸杆菌。在美国，益生素工业上应用的产品57％含有乳酸杆菌属。大连医学院康白等开发研制的乳酶生，是一种乳酸杆菌的干燥制剂，保存期间稳定性好，每克产品含活乳酸杆菌约10⁷个，仔猪每日口服3-4克可以有效治疗腹泻。

乳酸杆菌除了能提高动物的生产性能以外，还能提高动物的抗病力，赵庶吏等(2004)研究发现生物菌对致病性大肠杆菌有很强的抵抗作用，使仔猪下痢和发病率降低87.4％，治疗效果非常显著。Peran等(2006)研究发现发酵乳杆菌通过释放谷胱甘肽及调节细胞因子(如TNF-α)和诱导型一氧化氮合酶的表达，来防止鼠结肠炎的发生。

乳酸菌类产品的开发利用已成为饲料工业一个活跃领域，但也存在一些亟待解决的问题如产品质量不稳定、活菌数量不够、消化率低和成本高等。因此，培养繁殖力强、耐受能力强、产生较高消化酶的菌种以生产出产量高、质量稳定、在体温范围内具有较高活性的乳酸杆菌类产品，以提高其利用率，同时改进工艺、降低生产成本、提高产品的市场竞争力以及对于畜牧业的发展和人类的健康都非常有意义。

发明内容

本发明的一个目的是提供一株发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007。

本发明所提供的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007，在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)保藏，保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4648。该发酵乳杆菌具有抗逆性强、抗杂菌能力强和益生特性。

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007具有以下生物学特性：

(1)在pH2.0处理6小时之后的存活率为78.6％；

(2)在75℃水浴中加热15min后的存活率为45.5％；

(3)室温下放置1个月后的存活率为78.9％；

(4)接种在肉汤培养基于37℃，5％CO₂的培养箱中培养24小时达到最高生长浓度为10¹¹cfu/ml(图1)。

本发明的另一个目的是提供一种发酵乳杆菌菌剂。该菌剂能够替代现有的饲用抗生素，并具有抗病、促生长的作用。

本发明所提供的发酵乳杆菌菌剂，其活性成分为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007。

所述菌剂具有下述至少一种用途：

1)清除动物自由基的产品；

2)缓解动物氧化应激的产品；

3)增强动物机体抗氧化能力的产品；

4)制备调解动物肠内微生态平衡的产品；

5)增强动物肠道黏膜屏障的产品；

6)调节动物粘膜免疫功能的产品；

7)促进动物生长的产品。

上述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007或菌剂可用于制备大肠杆菌抑制剂。

所述大肠杆菌抑制剂中的大肠杆菌具体可为大肠杆菌K88、大肠杆菌K99、大肠杆菌K987P。

所述自由基为下述三种自由基中的至少一种：羟基自由基、超氧阴离子自由基、1，1-二苯基苦基苯肼自由基。

所述缓解动物氧化应激体现为下述1)-3)中至少一种：1)提高动物肌肉、肝脏和/或血浆中抗氧化酶的活性；2)降低动物丙二醛的含量；3)增强动物抑制自由基产生的能力。

所述增强动物肠道黏膜屏障体现为改善动物肠道菌群组成和/或促进动物肠道粘液蛋白的表达。

所述调节动物粘膜免疫功能体现为下述1)-3)中至少一种：1)增加动物外周血T淋巴细胞CD4⁺淋巴细胞亚群的比例；2)促进回肠中TNF-α基因的表达；3)促进回肠中IFN-γ基因的表达。

所述肠道粘液蛋白为MUC2。

所述菌剂具体可由发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007和保护剂混合后，冷冻干燥，制成发酵乳杆菌干燥制剂，所述的保护剂为脱脂奶粉、麦芽糊精、稻壳粉、麦麸中的一种或多种。

本发明所述发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007或所述菌可以作为添加剂用于动物饲料，其中的动物包括但不限于猪、羊、牛、鸡等各种动物。该饲料具有与抗生素饲料类似的功能，但无抗生素饲料的副作用。

本发明的发酵乳杆菌及其发酵乳杆菌菌剂主要作为动物的饲料添加剂，其可以替代现有动物日粮中的抗生素，调节动物肠内微生态平衡，清除体内的自由基，提高抗氧化能力，从而具有增强非特异性免疫功能来预防疾病的作用，同时还可以提供营养因子、促进营养物的消化吸收、促进动物生长和提高饲料转化率、提高断奶仔猪的生产性能。

本发明的发酵乳杆菌及其发酵乳杆菌菌剂对防治动物消化系统疾病起到保健作用，同时对幼年动物可刺激其胃肠道发育，所以将之作为饲料添加剂应用在饲料中能起到抗病促生长的作用。同时，本发明的发酵乳杆菌及其发酵乳杆菌菌剂无耐药性和药物在动物产品中残留从而对人类的健康产生潜在的危害的可能，是一种有前途的绿色饲料添加剂。

下面结合具体实施例详细描述本发明，所述实施例用于理解而不是限制本发明。

保藏说明

菌种名称：发酵乳杆菌

拉丁名：Lactobacillus fermentum

菌株编号：HAFI5007

保藏机构：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心

保藏机构简称：CGMCC

地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号

保藏日期：2011年3月11日

保藏中心登记入册编号：CGMCC No.4648

附图说明

图1为发酵乳杆菌生长曲线。

图2为平皿挖沟法测定乳酸杆菌培养物对大肠杆菌的抑制。

图3为发酵乳杆菌在过氧化氢存在时的存活能力。

图4为发酵乳杆菌对羟自由基的清除能力。

图5为发酵乳杆菌对超氧阴离子的清除能力。

图6为发酵乳杆菌对DPPH的清除能力。

图7为发酵乳杆菌对断奶仔猪肠道粘液蛋白的影响(标尺：200μm)(10×20)。

ACE分别是对照组的十二指肠、空肠和回肠，BDF分别是发酵乳杆菌组的十二指肠、空肠和回肠，粘液蛋白(如深棕色颗粒或团块)。

图8为发酵乳杆菌对断奶仔猪肠道组织形态的影响(标尺：200μm)(10×20)。

ACE分别是对照组的十二指肠、空肠和回肠，BDF分别是发酵乳杆菌组的十二指肠、空肠和回肠。

具体实施方式

本发明的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007，可先接种于Rogosa SL琼脂的Hungates滚管培养基中进行培养，得到的种子培养物再接种于Rogosa SL肉汤厌氧培养基里进行培养。

其中所述的琼脂培养基为适合发酵乳杆菌培养的任何培养基，本领域技术人员都知晓何种培养基适合发酵乳杆菌培养。然而可以优选为Rogosa SL琼脂的Hungates滚管培养基，这里所述的Rogosa SL琼脂的Hungates滚管培养基理解为以在Rogosa SL完全选择性培养基的基础上，适当修改的适合发酵乳杆菌培养的培养基。所述适合发酵乳杆菌培养的培养基可以为现有技术任何适合发酵乳杆菌培养的培养基，这为本领域技术人员所知晓，但是仍可进一步优选培养基的配方为：胰蛋白胨1～20g，牛肉膏1～20g，酵母浸粉1～15g，葡萄糖1～20g，阿拉伯糖1～15g，蔗糖1～15g，醋酸钠5～25g，枸橼酸钠1～10g，磷酸二氢钾1～15g，七水硫酸镁0.1～1.5g，四水硫酸锰0.1～1.5g，硫酸亚铁0.01～0.10g，吐温-800.1～2.0mL，琼脂5～20g，蒸馏水100～2500mL；优选为胰蛋白胨5～15g，牛肉膏5-15g，酵母浸粉3～10g，葡萄糖5～15g，阿拉伯糖3～10g，蔗糖3～10g，醋酸钠10～20g，枸橼酸钠1～5g，磷酸二氢钾1～10g，七水硫酸镁0.1～1g，四水硫酸锰0.1～1g，硫酸亚铁0.01～0.05g，吐温-80 0.5～1.5mL，琼脂10～15g，蒸馏水500～2000mL；更优选为胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸钠15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，硫酸亚铁0.03g，吐温-80 1mL，琼脂13g，蒸馏水1000mL。

其中的液体培养基为适合发酵乳杆菌培养的任何培养基，本领域技术人员也知晓这种液体培养基，其中可优选肉汤厌氧培养基，这里所述的肉汤厌氧培养基理解为在普通肉汤厌氧培养基的基础上，适当修改的培养基，所述适当修改的培养基可以为现有技术任何适合发酵乳杆菌培养的培养基，这为本领域技术人员所知晓，优选Rogosa SL肉汤厌氧培养基，其中培养基的配方为胰蛋白胨5～15g，牛肉膏1～20g，酵母浸粉3～10g，葡萄糖5～15g，阿拉伯糖3～10g，蔗糖3～10g，醋酸钠10～20g，枸橼酸钠1～5g，磷酸二氢钾1～10g，七水硫酸镁0.1～1g，四水硫酸锰0.1～1g，硫酸亚铁0.01～0.05g，吐温-800.5～1.5mL，蒸馏水500～2000mL；更优选为胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸钠15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，硫酸亚铁0.03g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL。

应用上述培养基，本领域技术人员一般都知晓具体培养过程，这里优选为上述Rogosa SL琼脂培养基的Hungates滚管中培养，优选在培养箱中，37℃下，培养15～72小时；其中的发酵乳杆菌扩大培养优选在Rogosa SL肉汤厌氧培养基中，37℃下培养15～80小时。

前面所述的保护剂为本领域技术人员通常使用的能够作为发酵乳杆菌菌剂的保护剂，本发明优选所述载体为为脱脂奶粉、麦芽糊精、稻壳粉、麸皮的一种或多种，优选为脱脂奶粉，其发酵乳杆菌菌液与脱脂奶粉按照重量体积比1～8∶0.1～2体积比混合，优选为3～5∶0.5～1。

本发明含有发酵乳杆菌的动物饲料，其特征在于，该发酵乳杆菌饲料在提高动物抗氧化和免疫力中的作用。所述动物为家禽和家畜。

本发明的动物饲料包括：常用动物饲料和本发明的发酵乳杆菌菌剂。其中发酵乳杆菌菌剂的含量至少为0.001％，优选为0.001～3％，更优选0.01％～2％，最优选0.05％～0.2％。主要研究该配合饲料在提高动物抗氧化和免疫力中的作用。所述动物为家禽和家畜。本发明的发酵乳杆菌菌剂可以同目前市面上任何常用动物饲料进行配合，即本发明所述动物饲料保护范围不为配合的常用动物饲料种类所限制。。

然而其中的常用动物饲料可优选为日粮，进一步优选为猪用日粮、鸡用日粮、反刍动物用日粮和水产动物用日粮。对于不同的动物，其日粮的配方各不相同，但是，现有技术中公开的任何日粮都可以作为本发明的动物饲料，其配方都是该领域的公知常识。

下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

下述实施例2～6中的发酵乳杆菌如无特殊说明，均指发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648

实施例1、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007的分离鉴定

本发明的发酵乳杆菌是从猪胃肠道粘膜中提取、分离、筛选、纯化得到的。

(一)发酵乳杆菌的分离与纯化

1.1试验材料

取健康仔猪胃肠道粘膜5cm²(胃、十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠)，在灭菌杯中，用无菌生理盐水冲洗粘膜上的食糜，将粘膜浸入装有15mL HEPES缓冲液的烧杯中，用镊子来回摇动粘膜5min后，得到上清液。

1.2培养基

1.2.1 Rogosa SL琼脂的培养基

胰蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母浸粉5g，葡萄糖10g，阿拉伯糖5g，蔗糖5g，醋酸钠15g，枸橼酸钠2g，磷酸二氢钾6g，七水硫酸镁0.58g，四水硫酸锰0.25g，硫酸亚铁0.03g，吐温-80 1mL，琼脂13g，蒸馏水1000mL，用醋酸调节pH至5.0。

1.2.2Rogosa SL肉汤厌氧培养基

配方同1.2.1，不添加琼脂，蒸馏水1000mL，用醋酸调节pH至5.0。用新配制的0.1％忍天青溶液作氧指示剂，趁热分装入Hungates管，冲CO₂至无色，迅速封口。121℃高压蒸汽灭菌5min。

1.3菌株的分离培养

用无菌注射器吸取0.2mL上清液注入装有Rogosa SL琼脂的Hungates滚管中，用手轻轻滚动使上清液均匀分布在管中琼脂表面。放入5％CO₂培养箱，37℃培养72h之后，在生物安全柜里无菌操作将白色针尖大小的菌落用针头挑取转移到厌氧无菌Rogosa肉汤里进行培养，观察肉汤是否变浑浊，有浑浊的放置4℃冰箱贮藏备用。

1.4革兰氏染色

用无菌注射器吸取少量Rogosa SL肉汤培养物，滴在载玻片上，在酒精灯火焰上轻轻烘干固定。滴加结晶紫染色液，染1min，水洗；滴加革兰氏碘液媒染，作用1min，水洗；滴加丙酮乙醇混合液(丙酮∶95％乙醇＝3∶7)脱色30s，水洗；滴加沙黄染色液复染1min，水洗，待干，在普通光学显微镜上观察，菌体成红色为阴性，紫色的为阳性。呈革兰氏阳性形态一致的杆菌，进一步进行接触酶试验。

1.5接触酶试验

作Rogosa SL斜面培养基，取培养物约0.2mL注入装有Rogosa SL培养基斜面，5％CO₂培养箱，37℃培养24h，长出菌落后，将3％过氧化氢溶液滴加到菌落上，若没有气泡产生说明是阴性，若有气泡产生说明是阳性。通过Rogosa SL厌氧培养的培养物经革兰氏染色阳性和接触酶试验阴性可初步认为是乳酸杆菌属(Lactobacillus)。

2结果与讨论

本试验从健康仔猪胃肠道粘膜中利用经过盐酸校正后Rogosa SL完全选择性培养基筛选出5907株乳酸杆菌株。将仔猪胃肠道粘膜在HEPES缓冲液中摇动5min，用无菌注射器吸取0.2mL上清液装入含Rogosa SL琼脂的滚管中培养24h，再挑去白色菌落在厌氧无菌RogosaSL肉汤里进行培养。经过革兰氏染色和接触酶试验，证明乳酸杆菌是健康仔猪胃肠道的优势菌群，说明经盐酸校正的Rogosa SL培养基适合分离胃肠道粘膜乳酸杆菌。

菌种的筛选是及其烦琐的过程。大多数乳酸菌的选育过程是从消化道上皮分离益生菌，这样便可以获得具有良好定植效果的菌种。

(二)发酵乳杆菌的抗逆性选育

1.1培养基

1.1.1Rogosa SL肉汤培养基

同(一)中的1.2.2。

1.1.2厌氧斜面培养基

同(一)中的1.2.1。

1.2耐酸性能选育

制备含pH3.0和pH2.5的Rogosa SL肉汤培养基，分别接种已培养24h的胃乳酸杆菌和肠乳酸杆菌，接种量1％，于37℃培养24h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐酸。从接种开始和第8h用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释至10^-5后，取0.3mL稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，平皿放置在37℃，5％CO₂培养箱中，培养24h，计算存活率。然后镜检看是否染菌。能够生长的菌株的最初分离样品保存在-80℃冰箱备用。

1.3耐胆盐性能选育

制备含猪胆盐0.3％的厌氧斜面培养基，接种已培养24h的菌株，接种量1％，于28℃培养24h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐胆盐。然后镜检看是否染菌。能够生长的菌株的最初分离样品保存在-80℃冰箱备用。

1.4耐高铜性能选育

制备含有250mg/kg五水硫酸铜的肉汤厌氧培养基，接种已培养24h的菌培养物，接种量1％，于28℃培养12～72h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐高铜。然后镜检看是否染菌。能够生长的菌株的最初分离样品保存在-80℃冰箱备用。

1.5耐高锌性能选育

制备含有1％氧化锌的肉汤厌氧培养基，接种已培养24h的菌培养物，接种量1％，于28℃培养12～72h后观察。如果培养基变的浑浊，说明该菌株耐高锌。然后镜检看是否染菌。能够生长的菌株的最初分离样品保存在-80℃冰箱备用。

2.结果与讨论

2.1耐酸性能选育

通过耐酸性能选育，有513株乳酸杆菌可以在pH2.1的Rogosa SL培养基中生长繁殖，淘汰率为30％。这说明胃肠道的大多数乳酸杆菌耐酸性能较好，有70％可以在仔猪的胃肠道中进行繁殖。乳酸杆菌一般通过定植在消化道上皮发生益生特性。因此，如果菌种对胃酸没有耐受性很难对动物的生产性能产生良好的作用。

2.2耐胆盐性能选育

将通过耐酸性能选育的513株乳酸杆菌进行耐胆盐性能选育，有103株乳酸杆菌可以在含胆盐0.3％的Rogosa SL培养基中生长繁殖，淘汰率为79.92％。研究表明，胆盐是肠乳酸杆菌在动物胃肠道内遇到的比胃酸更不利的因素。Chou和Weimer(1999)研究发现用胆盐选择性驯化乳酸杆菌对胆盐的耐受力是有效的，经过几代胆盐驯化之后得到的乳酸杆菌耐胆盐的能力比亲代乳酸杆菌强，乳酸杆菌容易对胆盐性能产生耐受性，且具有一定的遗传性，选育出耐胆盐的发酵乳杆菌在生产中具有重要的意义。

2.3耐高铜性能选育

将通过耐胆盐性能选育的103株乳酸杆菌进行耐高铜性能选育，有87株乳酸杆菌可以在含250mg/kg五水硫酸铜的Rogosa SL培养基中生长繁殖，淘汰率为15.53％。证明该乳酸杆菌具有较强的耐高铜特性。由于高铜日粮具有促生长的作用，是目前我国比较普遍使用的日粮，因此选择具有耐高铜的发酵乳杆菌是极其必要的。

2.4耐高锌性能选育

将通过耐高铜性能选育的87株乳酸杆菌进行耐高锌性能选育，有76株乳酸杆菌可以在含1％氧化锌的Rogosa SL培养基中生长繁殖，淘汰率为12.64％。高锌具有防止腹泻、促进生长的作用，因此在我国利用氧化锌来配制仔猪饲料，尤其是生产断奶仔猪饲料的厂家很多。因此选育出耐高锌的发酵乳杆菌也是必要的。

3小结

通过本试验获得76株来源于仔猪胃肠道粘膜，对消化道内环境有一定抵抗能力的乳酸杆菌菌株，这为以后的选种工作打下了基础。

(三)发酵乳杆菌的益生特性选育

1.1发酵乳杆菌代谢产物抑制大肠杆菌能力的选育

大肠杆菌(K88、K99和987P)购自中国兽药监察所。K88在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为：CMCC44742，K99在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为：CMCC44820，987P在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为：CMCC44317。

乳酸杆菌：76株耐酸、耐胆盐、耐高铜、耐高锌的肠乳酸杆菌。

培养基：麦康凯(MacConkay)培养基(购自北京天坛生物制品般份有限公司)。

在Hungates管里加MRS肉汤(蛋白胨，10g；牛肉浸膏，10g；酵母浸粉，5g；磷酸氢二钾，2g；枸椽酸二铵，2g；葡萄糖，20g；七水硫酸镁，0.58g；四水硫酸锰，0.25g；醋酸钠，5g；蒸馏水，1000mL)约15mL，充二氧化碳，制成无菌厌氧MRS肉汤。每个管中分别接种从健康仔猪胃肠道分离到的76株抗逆性强的肠乳酸杆菌，乳酸杆菌经18h培养后按1％接种于肉汤中，在37℃培养箱里培养24h后，置4℃冰箱保存备用。

抑制大肠杆菌试验：制作麦康凯培养基，加热溶解后在121℃高压灭菌15min后，无菌倾倒平皿。用记号笔在平皿底部划线将平皿分成三个平行的区域，每个区域用接种棒划线接种大肠杆菌培养液(4.0×10⁸CFU/mL)于培养基表面，然后在距平皿中线约3cm的地方挖一宽为0.5cm的沟，沟与接种划线垂直，用热接种棒补底，如图2所示。分别用不同的乳酸杆菌培养物将沟填满(不能溢出)，置普通培养箱37℃培养18h后，观察出现大肠杆菌菌落的位置，大肠杆菌的菌落为红色，测定离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离。每个乳酸杆菌作两个平行样，以平均值表示结果。

1.2乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养抑制作用选育

大肠杆菌(K88、K99和987P)来源与1.1节同。

乳酸杆菌：16株肠代谢产物对大肠杆菌具有较强抑制作用的乳酸杆菌。

大肠杆菌的检测培养基：麦康凯(MacConkay)培养基与1.1节同。

乳酸杆菌接种于厌氧无菌MRS肉汤中，37℃培养24h后，置4℃冰箱保存备用。

1.2.1不同浓度乳酸杆菌对大肠杆菌的抑制

随机选择一株乳酸杆菌，取5mL培养物(8.2×10⁹CFU/mL)分别与5、10、15mL营养肉汤混合，制成3个含不同乳酸杆菌培养物浓度的营养肉汤，接种大肠杆菌，接种量为培养液的5％，置37℃，5％CO₂培养箱培养4、8和18h后，分别用无菌注射器取出培养液，培养液经梯度稀释成10^-2～10^-5后，每个稀释度作4个平行样，取0.3mL稀释液，用“L”棒均匀涂布于麦康凯琼脂平板上，置于37℃，普通培养箱培养18h，取菌落数在50～150个的平皿计数，以平均值表示结果，计算每毫升培养液中大肠杆菌的数量。

1.2.2含1/4乳酸杆菌的营养肉汤中乳酸杆菌与大肠杆菌的数量关系

取5mL乳酸杆菌培养物(10⁸CFU/mL)与15mL营养肉汤混合，接种24h大肠杆菌培养物，接种量为培养液的10％(10⁷CFU/mL)，起始混合液中乳酸杆菌的数量为大肠杆菌的10倍，用0.1N NaOH溶液调节培养液的pH为7.0，置37℃培养箱培养24h后，分别用无菌注射器取出培养液，培养液经梯度稀释至10^-5，10^-6，10^-7后，取0.3mL稀释液用“L”棒均匀涂布于MRS琼脂培养基上，每个梯度的培养液作3个平行样，MRS琼脂培养基(pH5.4)置 37℃、5％CO₂培养箱培养18h，取菌落数在50～150个的平皿计数，以平均值表示乳酸杆菌的数量，计算每毫升培养液中乳酸杆菌的数量。培养24h后直接用无菌注射器取1mL培养液经梯度稀释至10^-2后，取0.3mL稀释液置于麦康凯琼脂上，用“L”棒均匀涂布，每个管做3个平行样，将平板置于37℃，普通培养箱培养18h，计算每个平板的大肠杆菌菌落数，以平均值表示结果。

2结果与讨论

2.1乳酸杆菌代谢产物抑制大肠杆菌的选育

乳酸杆菌代谢产物抑制大肠杆菌的效果以离小沟最近的大肠杆菌菌落与小沟的距离为指标，距离越大，说明抑菌效果越好。本试验所采用的平皿挖沟法是对经典的平皿挖孔法的改进，基本原理是放置在沟中的抗菌物质能渗透过琼脂来抑制大肠杆菌，随着离沟距离的增大，能渗透过去的抗菌物质的浓度就越小。大肠杆菌菌落与小沟的距离越大，说明乳酸杆菌代谢产物所含抗菌物质的抑菌能力越强。用平皿挖沟法在同一平皿可以同时测定乳酸杆菌代谢产物对3株大肠杆菌的抑制作用，而用平皿挖孔法在同一平皿只能测定对一株大肠杆菌的抑制作用。16株肠乳酸杆菌的抑菌距离在0.7～3.1cm之间，进一步研究它们与大肠杆菌混合培养的数量关系。

2.2乳酸杆菌与大肠杆菌体外培养的数量关系

2.2.1不同比例乳酸杆菌培养物与大肠杆菌在混合培养条件下的数量关系

结果见表1。

表1营养肉汤中含不同比例乳酸杆菌培养液对大肠杆菌的抑制作用(单位：CFU/mL)

2.2.2乳酸杆菌与大肠杆菌在混合培养条件下的数量关系

表2乳酸杆菌和大肠杆菌混合培养的数量关系(单位：CFU/mL)

说明：I代表从肠中分离得到的乳酸杆菌。

从表2中可以看出，不同浓度的乳酸杆菌与大肠杆菌混合培养时对大肠杆菌的抑制作用相似，说明25％的乳酸杆菌抑制大肠杆菌的试验是足够的。不同乳酸杆菌与大肠杆菌在含25％乳酸杆菌培养物的营养肉汤中与大肠杆菌混合培养的数量关系见表2。从表中可见RI021对三种血清型大肠杆菌都有很强的抑制作用。HAFI5007和AI2021对三种血清型大肠杆菌具有相对较强的抑菌能力。体外试管培养时不同微生物间的数量关系可以作为反映微生物在体内相互作用的一种指标。

3小结

根据抑菌试验和菌种分离部位，筛选出HAFI5007(结肠)作为益生菌的生产菌种。这株菌种经中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)鉴定为发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，保藏中心登记入册编号为CGMCC No.4648。HAFI5007细胞为杆状，革兰氏染色阳性，其它生物学特性如表21所示。

表21HAFI5007的生物学特性

该发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)，是乳杆菌属的一种。

实施例2、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648的生物学特性的研究

1.1生长曲线

MRS肉汤：蛋白胨，10g；牛肉浸膏，10g；酵母浸粉，5g；磷酸氢二钾，2g；枸椽酸二铵，2g；葡萄糖，20g；七水硫酸镁，0.58g；四水硫酸锰，0.25g；醋酸钠，5g；蒸馏水，1000mL，在500mL锥形瓶里装300mL MRS肉汤。按1％接种量接种发酵乳杆菌培养物，在前24h每隔1h，24h之后在第28、32、36、40、44、48h取样，取1mL培养液进行梯度稀释后，在10^-2～10^-6稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO₂的培养箱中，培养24h，取平皿中的菌落数50～150的稀释度作为计算用，每个梯度做3个平行样，以平均值表示结果。每毫升细菌浓度以对数值表示。

1.2耐酸存活率

MRS肉汤配方同实施例2中1.1，用冰醋酸调节pH至5.4，再用浓盐酸将pH调节至2.0。置于Hungates滚管中，每个管装20mL肉汤，制成厌氧无菌肉汤。凉下来后每管中加1mL发酵乳杆菌16h的培养物，在开始时、2h、4h、6h和8h分别取样，测定存活率。用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释后，在10^-4～10^-7稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO₂的培养箱中，培养24h，取平皿中的菌落数50～150的平皿计数，以平均值表示结果。

存活率的计算公式为：

S_酸＝n_x/n₀

S_酸为经过pH2.0处理后不同时间的发酵乳杆菌存活率；n₀为pH2.0处理前每毫升活菌数；n_x为pH2.0处理2、4、6、8h后每毫升活菌数。

1.3耐热存活率

MRS肉汤配方同实施例2中1.1，调节pH为6.7，置于Hungates滚管中，每个管装20mL肉汤，制成厌氧无菌肉汤。每管中加1mL发酵乳杆菌培养16h后的培养物，放置在37℃培养箱中16h后，取样进行活菌计数培养，同时将Hungates管迅速放置在75℃水浴中加热15min，取样进行活菌计数。用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释后，在10^-4～10^-7稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO₂培养箱中，培养24h，取平皿中的菌落数为50～150的平皿计数，以平均值表示结果。

存活率的计算公式为：

S_热＝n₁/n₀；

S_热为经过75℃处理后的发酵乳杆菌存活率；n₀为加热处理前每毫升活菌数；n₁为加热处理15min后每毫升活菌数。

1.4贮藏存活率

MRS肉汤配方同实施例2中1.1，调节pH为6.7，置于Hungates滚管中，每个管放置20mL的MRS肉汤，制成厌氧无菌肉汤后，每管中加1mL发酵乳杆菌培养16h的培养物，放置在37℃培养箱中16h后，取样1mL进行活菌计数。室温下放置1个月后，取样1mL进行活菌计数培养。计数方法用无菌注射器取出1mL进行梯度稀释后，在10^-4～10^-7稀释度取0.3mL稀释液在MRS琼脂(pH5.2)上均匀涂布，每个梯度做3个平行样，平皿放置在37℃，5％CO₂的培养箱中，培养24h，取菌落数为50～150个的平皿计数，以平均值表示结果。

存活率的计算公式为：

S_贮＝n₁/n₀

S_贮为经过1个月贮藏后的发酵乳杆菌存活率；n₀为贮藏前每毫升活菌数；n₁为贮藏1个月后每毫升活菌数。

2结果与讨论

2.1发酵乳杆菌生长曲线

生长曲线主要反映一种微生物的生长特性，微生物的生长一般经历延迟期、对数生长期、稳定期和衰亡期四个阶段，这是一种典型的生长曲线模型。延迟期是微生物对新的生长环境的适应过程，在这一过程中，微生物表现为数量不变或下降，对其自身的大分子和小分子的组成进行调整，同时也会产生特定的物质如酶等来适应新的环境。对数生长期是微生物对新的环境适应之后，生长繁殖速度呈几何级数的阶段，是数量增长最快的一个阶段，表现为菌体数量和重量的增加。但是到了对数期的末期，由于菌体生长代谢对营养物质的消耗和有毒产物的积累，细菌的生长繁殖速率下降。稳定期是细菌生长速率与死亡速率趋于平衡的阶段。衰亡期细菌数量明显下降。测定生长曲线对于确定合适的发酵时间具有重要作用。

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648的生长曲线如图1所示，从图1可见，发酵乳杆菌的浓度在第1h有所下降，经过2h之后从10⁵个数量级迅速上升，到第24h菌体浓度达到最高值，但从第28h，细菌的数量级开始缓慢下降到10¹¹数量级以下，其原因是培养基营养物质浓度下降和有害代谢产物增加引起菌体自溶死亡增加，生长繁殖的菌体数量比死亡的菌体数量更多，导致总的活菌数量减少。从生长曲线可以看出，发酵乳杆菌的最佳收获期以是在培养后20～26h，一者培养时间较短，二者收获的菌体数量较多。在这一段时间收获菌体，可以减少获得单位活菌的成本，从图中可以看出活菌数维持在10¹¹数量级达8h左右，而维持在10¹⁰数量级达30h左右。

2.2发酵乳杆菌耐酸存活率

发酵乳杆菌经pH2.0处理不同时间的菌体浓度见表3。

表3pH2.0处理不同时间对发酵乳杆菌活菌浓度的影响(单位：CFU/mL)

从表3可见，在pH2.0处理的前6h，发酵乳杆菌的数量下降缓慢，存活率从95.2％下降到78.6％，而且在第4h和第6h之间，活菌数基本没有变化，维持在80％左右，发酵乳杆菌是一株分离自仔猪结肠粘膜的菌种，这个存活率对于其耐过胃酸的抑制作用或杀灭作用应是较为理想的，也表明该菌株可以有足够数量的活菌数通过胃的不利环境。该发酵乳杆菌耐酸存活率均高于王传彬等(1997)测定的动物源乳酸杆菌的存活率。

由于胃的排空时间在猪个体间存在差异，在计算综合抗逆存活率时，以pH2.0处理6h后的存活率较为合适。

2.3发酵乳杆菌耐热存活率

发酵乳杆菌经过75℃处理15min之后的存活率达到45.5％。一般仔猪饲料的制粒温度为70℃～85℃之间，耐高温之后存活率低也是乳酸杆菌作为饲料添加剂的主要限制性因素之一，根据Fuller(1989)的研究，乳酸杆菌经过75℃处理10min之后基本上没有活菌。从耐热存活率看，本试验选育的发酵乳杆菌可以耐受制粒时的高温，作为饲料添加剂将会有较好的前途。

2.4发酵乳杆菌耐贮藏存活率

经过一个月的贮藏之后，发酵乳杆菌存活率为78.9％。

实施例3、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648对自由基的清除能力

1.1发酵乳杆菌的培养

MRS肉汤配方同实施例2中1.1，用冰醋酸调节pH至5.4，混合后装进厌氧管，每管装10mL肉汤，趁热充1.5％CO₂ 1min，封口，高压灭菌。发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007CGMCC No.4648经24h培养后按1％接种于MRS中，接种后再培养20h。3,000rpm离心15min，收集菌体。将离心后的菌体用灭菌的生理盐水洗涤3次，重新悬浮于生理盐水中，调整菌数至10⁶、10⁷、10⁸和10⁹CFU/mL。

1.2发酵乳杆菌对过氧化氢耐受能力的测定

参考Kullisaar等(2002)的方法。将浓度为10⁹CFU/mL的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648细胞悬浮液接种到1.0mmol/L的过氧化氢中，37℃培养48h。其间每隔30min取一次，滚管，然后计数。平行测定3次，取平均值。

1.3发酵乳杆菌对羟自由基清除能力的测定

参考张天博和宁喜斌(2007)的方法。取浓度为0.75mmol/L邻二氮菲1mL于试管中，依次加入磷酸盐缓冲液(pH值为7.4)2mL，蒸馏水1mL，充分混匀后，加入浓度为0.75mmol/L的硫酸亚铁1mL，混匀，加质量分数为0.12％的过氧化氢1mL，37℃水浴90min，然后于536nm处测其吸光度，为Ap；用1mL蒸馏水代替1mL过氧化氢，为Ab；用不同浓度的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648细胞悬浮液代替1mL的蒸馏水，为As。平行测定3次，取平均值。按下式计算清除率：

对羟自由基的清除率(％)＝(As-Ap)/(Ab-Ap)×100

1.4发酵乳杆菌对超氧阴离子清除能力的测定

采用邻苯三酚自氧化法测定(Zhao等，2003)。于具塞试管中加入pH值为8.20的Tris-HCl缓冲液(含0.1mmol/L乙二胺四乙酸二钠)3mL，再加入1mL不同浓度的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648细胞悬浮液(空白管以1mL水代替)，充分混匀并于25℃保温25min。然后加入40μL45mmol/L邻苯三酚溶液，迅速混匀，在325nm下每隔30s读取吸光度，反应时间为5min。平行测定3次，取平均值。按下式计算清除率：

对超氧阴离子的清除率(％)＝(ΔAo-ΔA)/ΔAo×100

式中：ΔA和ΔAo分别为加入样品和水后的邻苯三酚自氧化速率，即每分钟吸光度的平均变化率。

1.5发酵乳杆菌对1，1-二苯基苦基苯肼(1，1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)清除能力的测定

参照Lin和Chang(2000)的方法。取不同浓度的发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648细胞悬浮液1mL，加入浓度为0.2mmol/L的DPPH·无水乙醇溶液2mL，混匀后在室温下避光反应30min，并在6,000rpm下离心10min，取上清液在517nm下测定吸光度Ai，平行测定3次，取平均值。空白组以等体积无水乙醇代替DPPH·无水乙醇溶液，对照组以等体积蒸馏水代替样品溶液，并以等体积蒸馏水和无水乙醇混合液空白调零。按下式计算清除率：

对DPPH的清除率(％)＝[1-(Ai-Aj)]/Ao×100

式中：Ao为对照组吸光度；Ai为样品组吸光度；Aj为空白组吸光度。

2结果与讨论

2.1发酵乳杆菌对过氧化氢的耐受能力

过氧化氢是一种弱的氧化剂，但具有很好的扩散性，因此半衰期很长。由于这两个基本特性，过氧化氢本身就能造成氧化损伤，或者作为羟自由基的前体物质造成氧化损伤。本试验测定了发酵乳杆菌活细胞在浓度为1.0mmol/L的过氧化氢溶液中的存活情况，结果见图3。从图3可以看出，240min后，发酵乳杆菌仍能保持91.14％的活力，菌的浓度下降不到一个对数期，说明该菌在过氧化氢溶液中有较强的存活能力。

2.2发酵乳杆菌对羟基自由基的清除能力

ROS自由基中，羟基自由基是最有活性的，在金属离子(如铜离子或铁离子)存在的条件下，超氧阴离子和过氧化氢能生成羟基自由基。羟基自由基是一种氧化性很强的自由基，会对生物细胞大分子造成损伤而影响细胞的正常功能。因此，对羟基自由基的清除能力是抗氧化性能的一个主要指标。不同浓度发酵乳杆菌对羟基自由基的清除能力的结果如图4所示。从图4可以看出：发酵乳杆菌浓度为10⁶和10⁹CFU/mL时，对羟基自由基的清除能力分别为7.35％和91.84％，且存在着剂量依赖关系。

2.3发酵乳杆菌对超氧阴离子自由基的清除能力

超氧阴离子自由基是分子氧的一价电子还原形式，是其它ROS(如过氧化氢、羟基自由基和单线态氧等)的前体物。这些物质存在与生物大分子反应的潜能，同时可诱导组织的氧化损伤。本试验中，发酵乳杆菌对超氧阴离子的清除能力通过对邻苯三酚自氧化的抑制能力来评价。不同浓度发酵乳杆菌对超氧阴离子自由基清除能力的结果如图5所示。从图5可以看出：随着发酵乳杆菌浓度的升高，清除超氧阴离子自由基的能力也逐渐升高，与清除羟基自由基的趋势相同。当浓度为10⁶和10⁹CFU/mL时，对超氧阴离子自由基的清除能力分别为12.86％和80.56％。

2.4发酵乳杆菌对DPPH的清除能力

DPPH是一种人工合成的稳定自由基，在可见光区有特征吸收，比色测定简便、快速，同时DPPH半衰期较长，使此分析方法保持了良好的重现性。尽管DPPH并非人体内实际产生的自由基，但是对DPPH的抑制能力仍能有效地评价抗氧化剂的活性，因此，该法广泛用于自由基清除剂的筛选研究。DPPH自由基是评价复合物抗氧化能力的有效试剂。不同浓度的发酵乳杆菌对DPPH的清除能力结果见图6。从图6可以看出：随着发酵乳杆菌浓度的升高，对DPPH的清除能力也逐渐升高。当浓度分别为10⁶和10⁹CFU/mL时，对DPPH的清除能力分别为64.26％和87.89％。

3小结

发酵乳杆菌在体外能够清除自由基，且随着浓度的升高清除能力逐渐增加，发酵乳杆菌对自由基的清除能力存在剂量依赖关系。

实施例4、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648对健康和氧化应激状态下断奶仔猪机体氧化还原状态的影响

1.1发酵乳杆菌的培养

MRS的配制同实施例2中1.1。将发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCCNo.4648按1％接种量接种到MRS培养基中，在37℃条件下培养20h。

1.2试验动物与试验日粮

试验选用24头28日龄断奶的二元杂交(长白×大白)阉公猪，平均体重为7.19±0.22kg。根据体重相近的原则随机分为4个处理，每个处理6个重复，每个重复1头猪。试验期为21d。基础日粮根据中华人民共和国农业部颁布的猪饲养标准(2004)配制，所有试验日粮均为粉料。日粮组成及营养水平见表4。

1.3饲养管理

试验在中国农业大学单胃动物营养代谢室进行。全封闭式猪舍，舍内温度、通风强度、湿度、二氧化碳和氨浓度自动控制，猪舍温度恒定为26～28℃。代谢笼个体饲养，猪笼大小为1.25×0.55×0.80m³，漏缝喷塑地板。室内每天通风2h，保持猪舍氨气浓度不超过20mg/m³。每天08:00和17:00进行饲喂，所有仔猪自由采食和饮水，每天清扫猪舍，保持清洁卫生。按常规管理程序进行驱虫和免疫。

1.4试验设计和样品采集

采用2×2因子试验设计：发酵乳杆菌水平(0和10⁹CFU/mL)和氧化应激(腹腔注射diquat(敌草快)10mg/kg体重和生理盐水)。各处理组分别为：对照组(I组)、应激组(II组)、口服发酵乳杆菌组(III组)和应激+口服发酵乳杆菌组(IV组)。整个试验期，III组和IV组的仔猪一直口服发酵乳杆菌20mL/天(菌液浓度为10⁸CFU/mL)，另外两组不口服发酵乳杆菌。第8d晨饲后，所有仔猪称重。然后II组和IV组腹腔注射diquat 10mg/kg体重(+diquat)，I组和III组注射等量的生理盐水(-diquat)。并于注射后0.5、1.5、3.5、7.5和14.5h采血，分离血浆。试验结束时，所有仔猪前腔静脉采血后屠宰。剖开仔猪腹腔后，取出一部分肝脏和背最长肌，置于液氮中冷冻后，在-70℃冰箱中保存，以测定抗氧化酶活性和丙二醛(MDA)的含量以及抑制自由基产生的能力。

表4生长试验的基础日粮组成和营养水平

注：¹.粗蛋白、赖氨酸、蛋氨酸、胱氨酸、苏氨酸、钙和磷为实测值。

².每公斤预混料提供：维生素A，11,000IU；维生素D3，1503IU；维生素E，44.1IU；维生素K，4.0mg；核黄素，5.22mg；泛酸，20.0mg；烟酸，26.0mg；维生素B12，0.01mg；锰，35.0mg；铁，100.0mg；锌，90.0mg；铜，16.5mg；碘，0.30mg；硒，0.30mg。

1.5测定指标和方法

(1)生产性能

于试验第1、8和21d早晨，将猪个体空腹称重，试验期间准确记录给料量和剩料量，用于统计平均日增重(ADG)、平均日采食量(ADFI)和饲料增重比(F/G)。

(2)血浆中激素的测定

皮质醇和肾上腺素：采用猪的ELISA试剂盒(美国ADL公司中国代理商上海卓康生物科技有限公司，CH7896)测定，测定过程完全按照试剂盒说明书的步骤进行操作。

(3)血浆中营养物质代谢产物的测定

血糖：采用中生北控生物科技股份有限公司生产的试剂盒(060601)，用自动生化分析仪测定。

血浆中的游离脂肪酸：采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒测定(A042)，测定过程完全按照试剂盒说明书的步骤进行操作。

(4)血浆中氧化损伤指标的测定

蛋白质的氧化损伤：采用Levine等(1990)的2，4-二硝基苯肼(DNPH)比色法。在100μL的血浆中加入400μL的10mmol/L DNPH(用2mol/L HCl溶解)，并设一组空白对照，即不含DNPH的2mol/L HCl溶液。将各个反应体系置于黑暗中放置1h，每隔10～15min漩涡1次。反应完毕后，加入500μL 20％的三氯乙酸(TCA)溶液来沉淀蛋白质腙衍生物，在4℃下12,000g离心15min，弃上清。得到的沉淀用1mL乙醇和乙酸乙脂混合物(V/V＝1∶1)洗涤3次，每次放置10min，离心5min。最后的沉淀用1mL 6mol/L的盐酸胍溶解，37℃水浴25min。12,000g离心15min，取上清液。在紫外可见分光光度计370nm下测定其吸光值。羰基浓度用摩尔消光系数22,000L/(mol·cm)来计算。羰基含量用每毫克蛋白中含有的羰基的纳摩尔数来表示。

脂质过氧化物(丙二醛)的测定：采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒(A003)测定，测定过程完全按照试剂盒说明书的步骤进行操作。

(5)抗氧化指标的测定

超氧化物歧化酶(SOD)、还原型谷胱甘肽(GSH)、谷胱甘肽过氧化物酶(GSH-Px)、抑制超氧阴离子产生的能力(AISP)和抑制羟基自由基产生的能力(AIHP)：采用南京建成生物工程研究所生产的试剂盒(A001)测定，测定过程完全按照试剂盒说明书的步骤进行操作。

1.6统计分析

采用SAS 8.2的一般线性模型(GLM)进行两因子方差分析，模型主效应包括发酵乳杆菌的水平(0和10⁹CFU/mL)和氧化应激(腹腔注射diquat 10mg/kg体重和生理盐水)以及二者之间的互作。各指标以重复为统计单位。P＜0.05作为差异显著性判断标准。

2结果与讨论

2.1发酵乳杆菌对健康和氧化应激前后断奶仔猪生产性能的影响

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648对试验2～3wks及全期健康和氧化应激状态下断奶仔猪生产性能的影响见表5。主效应统计分析的结果表明：与注射生理盐水组相比，腹腔注射diquat显著降低了试验第2～3wks断奶仔猪的ADG(P＜0.01)和ADFI(P＜0.05)，增加了F/G(P＜0.05)。从整个试验期来看，有同样的效果。这说明腹腔注射diquat严重影响了断奶仔猪的生产性能。从表5可以看出：与未口服发酵乳杆菌组相比，口服发酵乳杆菌组第2～3wks断奶仔猪的ADFI增加了(P＝0.05)，整个试验期的ADG(P＜0.05)和ADFI(P＜0.05)得到了显著提高。这表明口服发酵乳杆菌有利于缓解生长抑制和提高氧化应激状态下断奶仔猪的饲料转化率，这意味着饲料中添加发酵乳杆菌的重要性。Lock和Wilks(2001)报道，diquat主要影响胃肠道微生物代谢。宿主微生物在养分的消化吸收过程中起重要的作用，添加发酵乳杆菌能改善胃肠道微生态平衡，提高机体对养分的利用，最终提高断奶仔猪的生产性能。

2.2发酵乳杆菌对健康和氧化应激状态下断奶仔猪血浆中激素的影响

肾上腺包括肾上腺皮质和肾上腺髓质。肾上腺皮质激素分为三类：即糖皮质激素、盐皮质激素和性激素。在应激反应中，除垂体-肾上腺皮质系统外，交感-肾上腺髓质系统反应也明显增加。发酵乳杆菌HAFI5007对健康和氧化应激状态下断奶仔猪血浆中激素的影响见表6。由表6可以看出血浆中皮质醇(P＜0.01)和肾上腺素的浓度(P＜0.01)显著增加了，且在注射后1.5～3.5h达到最高峰。这表明腹腔注射diquat造成了断奶仔猪的应激。口服发酵乳杆菌对激素水平没有显著影响。

2.3发酵乳杆菌对健康和氧化应激状态下断奶仔猪血浆中氧化损伤的影响

当ROS的产生过多，超过了机体的抗氧化防御体系，会导致生物大分子的氧化损伤，包括DNA和蛋白质的氧化损伤以及脂质过氧化。发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007CGMCC No.4648对健康和氧化应激状态下断奶仔猪血浆中氧化损伤的影响见表7。主效应分析结果表明：与注射生理盐水组相比，腹腔注射diquat增加了0.5h以后各时间点血浆中的羰基含量(P＜0.05)；血浆中的MDA含量在腹腔注射diquat后各个时间点均显著增加了(P＜0.05)。这些结果说明断奶仔猪的氧化应激模型成功建立了，且造成了蛋白质的氧化损伤和脂质过氧化物含量的升高。与未口服发酵乳杆菌组相比，口服发酵乳杆菌使14.5h时血浆中MDA的含量降低了7.58％(P＜0.05)，对其他时间点的羰基和MDA的含量影响不显著。

2.4发酵乳杆菌对健康和氧化应激状态下断奶仔猪血浆中代谢产物的影响

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648对健康和氧化应激状态下断奶仔猪血浆中代谢产物的影响见表8。从表8中我们可以看出：腹腔注射diquat增加了0.5h后各个时间点血糖的含量(P＜0.05)，同时提高了血浆中游离脂肪酸的含量(P＜0.01)。口服发酵乳杆菌并不能改善这种状态。腹腔注射diquat造成了断奶仔猪的氧化应激，使皮质醇和肾上腺素的分泌增加。皮质醇可以促使糖原异生，血糖升高，同时能促进脂肪分解，使血中脂肪酸浓度升高。肾上腺素分泌的增加能提高血糖和血浆脂肪酸水平，使葡萄糖和脂肪酸氧化过程增强，增加组织的耗氧量，提高基础代谢率，以适应应激状态下对能量的需要。这很好地解释了本试验中血糖和血浆脂肪酸含量的升高。

2.5发酵乳杆菌HAFI5007对健康和氧化应激状态下断奶仔猪肝脏、肌肉和血浆中抗氧化指标的影响

发酵乳杆菌HAFI5007对健康和氧化应激状态下断奶仔猪肝脏、肌肉和血浆中抗氧化指标的影响见表9、10和11。主效应分析结果发现：腹腔注射diquat降低了肝脏、肌肉和血浆中抗氧化酶的活性(P＜0.05)，增加了MDA的含量(P＜0.05)，同时抑制自由基产生的能力也下降了(P＜0.05)。口服发酵乳杆菌HAFI5007显著增加了肝脏中SOD的活性(P＜0.01)和GSH的含量(P＜0.01)，降低了MDA的含量(P＜0.05)。同时，提高了肌肉中SOD和GSH-Px的活性(P＜0.01)，降低了MDA的含量(P＜0.05)，且抑制自由基产生的能力也增强了(P＜0.05)。另外，口服发酵乳杆菌还提高了血浆中SOD的活性和GSH的含量(P＜0.05)。还原型谷胱甘肽(GSH)在GSH-Px的作用下会生成氧化型谷胱甘肽(GSSG)。本试验结果证实发酵乳杆菌在体内具有很好的抗氧化作用。

3小结

腹腔注射diquat造成了断奶仔猪的氧化应激，发酵乳杆菌可以通过提高肌肉、肝脏和血浆中抗氧化酶的活性、降低MDA的含量以及增强抑制自由基产生的能力来缓解仔猪的氧化应激，从而保护机体的抗氧化防御体系。

表5发酵乳杆菌对健康和氢化应激状态下断奶仔猪生产性能的影响

注：¹SEM：平均标准误；²L.F.：发酵乳杆菌；³D.：敌草快；⁴-：不添加；⁵+：添加。

表6发酵乳杆菌对健康和氧化应激状态下断奶仔猪血浆中激素的影响

表7发酵乳杆菌HAFI5007对健康和氧化应激状态下断奶仔猪血浆中氧化损伤的影响

表8发酵乳杆菌HAFI5007对健康和氧化应激状态下断奶仔猪血浆中代谢产物的影响

表9发酵乳杆菌HFAI5007对健康和氧化应激状态下断奶仔猪肝脏中抗氧化指标的影响

表10发酵乳杆菌HAFI5007对健康和氧化应激状态下断奶仔猪肌肉中抗氧化指标的影响

表11发酵乳杆菌HAFI5007对健康和氧化应激状态下断奶仔猪血浆中抗氧化指标的影响

实施例5、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648对断奶仔猪肠道组织形态、食糜微生物区系及粘膜粘液蛋白的影响

1.1发酵乳杆菌的制备

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648菌液的制备同实施例3。

1.2试验动物、试验日粮与试验设计

试验采用12头21日龄断奶的二元杂交(长白×大白)阉公猪，平均体重在5.98±0.37kg。根据体重相近的原则随机分为2个处理，每个处理6个重复，代谢笼个体饲养。试验开始前7d为适应期，以保证仔猪能够充分适应粉状饲料，正式试验期10d。处理组6头仔猪每天口服20mL发酵乳杆菌(10⁸cfu/mL)，对照组6头仔猪饮用自来水作为对照。试验期10d，试验结束时各组猪全部进行前腔静脉放血屠宰，剖开仔猪腹腔，小肠去除淋巴结放平，整段小肠按17％、83％和100％分为三段，分别为十二指肠、空肠和回肠。无菌取十二指肠、空肠、回肠、盲肠和结肠各5～10cm，用手术线两端结扎，放置在-70℃冰箱中，用于测定其中内容物的微生物菌群。在每段的中间采集两个5cm片段(表示十二指肠、空肠和回肠中段)并分别贮存于10％中性福尔马林缓冲液和Carnoy固定液中。10％中性福尔马林缓冲液固定的组织用于测定绒毛高度、隐窝深度和绒毛宽度，计算绒毛高度和隐窝深度的比例。Carnoy固定液固定的组织用于免疫组化分析粘液蛋白的分布。在每段的中间取5cm样品用于粘膜取样。所有粘膜样品放入液氮中冷冻，之后在-70℃冻存备用。试验所用日粮同实施例4的基础日粮。

1.3饲养管理

饲养管理同实施例4。

1.4肠道粘膜粘液层厚度的测定

仔猪宰杀后每个肠段各取1cm放入10g/L的阿利辛蓝(Alican blue)染色液(阿利辛蓝10.0g，蔗糖5.4g，无水乙酸钠4.1g用蒸馏水定容至1L，并调pH值为5.8)中，室温孵育2h后取出染色肠组织放入250mmol/L的蔗糖溶液中除去附着的多余染料，然后取出肠组织放入10g/L的多库脂钠溶液中室温过夜，以便完全萃取出肠道粘膜中的染料，然后5000rpm离心10min，上清液用分光光度计在620nm处比色，以10g/L的多库脂钠溶液调零，所测得吸光度在阿利辛蓝标准溶液标准曲线找相对应的值，结果表示为mg AB/cm²。

1.5肠绒毛形态分析和观察

采用酒精脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，切成6μm切片，HE染色(苏木素染核，伊红染胞质)，然后在每个部位组织切片上，选5个典型视野(绒毛完整、走向平直)用真彩图像分析软件采集图像并量取绒毛高度、隐窝深度和绒毛宽度。同时用免疫组化的方法观察肠道粘液蛋白的分布。

1.6微生物指标的检测

无菌称取不同部位胃肠道食糜约1g，溶解于99mL无菌生理盐水，在装无菌生理盐水的瓶子里放置5～8粒小玻璃珠。然后再进行逐级10倍稀释，直到10^-7，在10^-3～10^-5每个稀释度，取0.3mL稀释液于相应的滚管培养基中进行乳酸杆菌和厌氧菌培养。在10^-2～10^-5每个稀释度，取0.3mL稀释液于相应的平板培养基中进行大肠杆菌和好氧菌的培养。微生物培养用选择性培养基，大肠杆菌培养基用伊红美蓝(EMB)培养基(胰蛋白胨，10g；乳糖，10g；磷酸氢二钾，2g；琼脂，13g；伊红-Y，0.4g；美蓝，0.065g；蒸馏水，1000mL；pH 7.1～7.3)，乳酸杆菌用Rogosa SL琼脂培养基(培养基配方同实施例1；用醋酸调节pH至5.2)。好氧菌和厌氧菌用好氧菌和厌氧菌培养基(酪胨，15g；葡萄糖，5g；L-半胱氨酸，0.5g；硫乙醇酸钠，0.5g；酵母浸粉，5g；氯化钠，2.5g；0.1％刃天青，1mL；琼脂，13g；蒸馏水，1000mL；Ph 7.1)。厌氧菌和乳酸杆菌培养基制作成Hungates滚管，好氧菌和大肠杆菌用平板培养法。Hungates管和培养基平皿放置在37℃培养箱，培养48h后计数。每个稀释度做三个平板或滚管，以50～150个菌落的平板或滚管的稀释度作计数用。

1.7肠道粘膜层粘液蛋白表达量的检测分析

1.7.1动物组织总RNA的提取和质量检测

称取50～80mg肝脏或小肠粘膜或胃底腺组织于玻璃研磨器中，研磨充分，转入1.5mL的Eppendof管，然后严格按照Qiagen RNeasy Micro Kit RNA提取试剂盒步骤操作提取。

用组织中的总RNA溶解液5μL作为模板，反应体系为50μL进行反转录。反转录的试验步骤是：在0.2mL Eppendof管中，依次加入2.0μL dNTPs，2.0μL Oligo-dT18，6.0μL模板RNA，75℃温育变性5min，取出立即置冰上冷却1min。然后每管按顺序加入10.0μL 5×M-MLV反转录酶反应缓冲液，2.0μL RNasin，2.0μL M-MLV反转录酶，再加入用0.1％DEPC处理的灭菌超纯水补足体积至50μL，混匀。用PCR仪37℃温育2h，然后95℃灭活5min，之后立刻置于-20℃保存备用。

1.7.2实时荧光定量PCR

定量PCR反应体系如表12。其中，MUC2的PCR引物为(P15’-GTCAGCACCCAACACTAC AG-3’，P25’-GATCTTCTGCATGTTCCCAA-3’)，β-actin的PCR引物为(P15’-TGCGGGACATCAAGGAGAAG-3’，P25’-AGTTGAAGGTGGTCTCGTGG-3’)。扩增根据普通PCR的退火温度，设置温度梯度，确定最佳退火温度，即PCR反应效率最高的温度。通过融解曲线分析，选择合适的读板温度。各基因cDNA的最优定量PCR反应程序如下：(1)50℃2min，去除上一个反应的污染；(2)95℃预变性5min；(3)94℃变性30s；(4)58℃(MUC2)或64℃(β-actin)退火30s；(5)72℃延伸30s；(6)读板MUC281.6℃，β-actin 83℃，循环33次；(7)72℃延伸5min；(8)65℃到95℃生成融解曲线。反应结束后，样品保存于-20℃备用。

表12MUC2和β-actin cDNA的定量PCR反应体系(10μL)

1.7.3定量PCR反应标准曲线的制作

取普通PCR反应产物1μL，用灭菌超纯水稀释100倍后，再逐级稀释至10⁸倍，使得PCR产物的浓度为原来浓度的10^-2～10^-8，以稀释后的PCR产物为模板，按照定量PCR反应体系和反应条件进行PCR扩增。MUC2基因的标准曲线为Y＝-0.29X+9.62；r²＝0.994，线性范围是Ct为0～32。β-actin基因的标准曲线为Y＝-0.28X+8.07；r²＝0.995，线性范围是Ct为0～32.5。X为Ct，Y为起始拷贝数的对数值1g。

2统计分析

所有测定结果均以平均值和SEM(平均标准误)表示，显著性统计采用SAS 9.0的一般线性模型(GLM)进行统计分析，差异显著时采用Duncan’s多重比较。在发酵乳杆菌与对照和复合乳酸杆菌及复合乳酸杆菌与对照比较时采用正交比较统计分析。P＜0.05作为差异显著性判断标准。

3结果与讨论

3.1.发酵乳杆菌对断奶仔猪肠道粘液层厚度的影响

断奶仔猪口服发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648后对肠道粘膜粘附层粘液厚度没有产生显著的影响。断奶仔猪肠道粘附粘液层厚度变化范围为2.23～3.37mg AB/cm²(表13)。

表13发酵乳杆菌对仔猪肠道粘液层厚度的影响(单位：mgAB/cm²)

	对照组	发酵乳杆菌组	SEM	P值
					十二指肠	2.34	2.53	0.31	0.78
空肠	2.65	2.57	0.24	0.87
					回肠	2.23	2.81	0.29	0.34
结肠	3.37	3.01	0.27	0.55

3.2发酵乳杆菌对断奶仔猪肠道粘液蛋白基因(MUC2)表达及肠道粘液蛋白含量的影响

发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648对断奶仔猪肠道粘液蛋白基因表达的影响见表14。由表14可以看出断奶仔猪口服发酵乳杆菌后能促进断奶仔猪回肠粘液蛋白基因MUC2的表达。本试验中断奶仔猪连续口服10d发酵乳杆菌能促进回肠粘液蛋白MUC2基因的表达，而对其它肠段没有产生明显的影响。这可能与本菌株分离来源及其对不同肠段的粘附定植能力有关，本试验所用发酵乳杆菌是从健康仔猪回肠分离获得并且在体外的粘附筛选中表现出粘附力强于其它乳酸杆菌尤其是对回肠粘液的粘附能力。

表14发酵乳杆菌对仔猪肠道粘液蛋白基因表达的影响(1g起始拷贝数)

	对照组	发酵乳杆菌组	SEM	P值
					十二指肠	0.17	0.21	0.02	0.26
空肠	8.89	8.46	1.55	0.89
					回肠	3.36	6.71	0.80	0.02

图7免疫组化的结果表明粘液蛋白主要分布在肠道特异的杯状细胞里面，发酵乳杆菌组杯状细胞数量和杯状细胞中所含的粘液蛋白也明显高于对照组。

3.3发酵乳杆菌对断奶仔猪肠道组织形态的影响

光学显微镜观察，每一个小肠横切面上都有7～8个皱襞，每个皱襞有十几根肠绒毛。从整体来看，发酵乳杆菌组仔猪的小肠粘膜组织结构均比对照组的更为完整，层次分明，肠粘膜表面的纹状缘结构清晰，肠绒毛排列整齐。肠粘膜上皮细胞排列紧密，形态结构规则，染色清晰(图8)。表15表明：断奶仔猪口服发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648后对各肠段的绒毛长度和隐窝深度没有产生明显的影响，仅对回肠的绒毛长度与隐窝深度的比值产生显著影响(P＜0.05)。小肠的绒毛长度、粘膜厚度和绒毛表面积都是衡量小肠消化吸收功能的重要指标。绒毛长度和粘膜厚度增加可使小肠吸收面积扩大，有利于营养物质的吸收。

3.4发酵乳杆菌对断奶仔猪消化道食糜微生物菌群的影响

由表16可以看出，乳酸杆菌和厌氧菌数量在回肠显著高于对照组(P＜0.05)，而在其它肠段乳酸杆菌和厌氧菌的数量都有高于对照组的趋势(P＜0.1)。发酵乳杆菌组显著降低空肠和结肠的大肠杆菌数量(P＜0.05)。这表明发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007CGMCC No.4648能够提高消化道多数部位食糜中乳酸杆菌和厌氧菌的数量，改变肠道微生物的菌群结构。

4小结

仔猪口服发酵乳杆菌能改善仔猪肠道消化道菌群的结构组成，促进局部肠段的粘液蛋白表达，调节了肠道的屏障功能。

表15发酵乳杆菌对断奶仔猪肠道组织形态的影响

表16发酵乳杆菌对仔猪肠道内容物微生物菌群的影响(单位：1g^cfu/g湿重)

实施例6、发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCC No.4648对不同生理条件下仔猪粘膜免疫功能的影响

1发酵乳杆菌和大肠杆菌的制备

本实施例所用的发酵乳杆菌是发酵乳杆菌(Lactobacillus fermentum)HAFI5007 CGMCCNo.4648。本实施例所用的大肠杆菌是大肠杆菌(E.coli K88)购自中国兽药监察所。E.coli K88在中国医学细菌保藏管理中心的保藏号为：CMCC44742。

MRS肉汤培养基配置同实施例2。

LB液体培养基：胰蛋白胨10g，酵母提取物5g，NaCl 10g，水溶解后，用NaOH调pH至7.0，加水定容至1L，高压蒸汽灭菌20min，4℃储存备用。大肠杆菌按1％接种后37℃振荡培养16h。

2试验动物、试验日粮、试验设计与样品采集

试验采用24头21日龄断奶的二元杂交(长白×大白)阉公猪，平均体重在6.07±0.63kg。体重相近的原则随机分为4个处理，每个处理6个重复，在代谢笼内单笼个体饲养。试验开始前7d为适应期，以保证仔猪能够充分适应粉状饲料。经过1wk的预饲使其适应试验环境后，依照其体重相近的原则随机分4个处理，每个处理6个重复，每个重复1头猪，试验期10d。前两个不攻毒处理的健康仔猪中，一个处理每天上午喂料前每头猪口服20mL发酵乳杆菌(10⁸cfu/mL)，另一处理为空白对照组；后两个处理为大肠杆菌攻毒组，两个处理所有猪在试验第1d各口服20mL 10⁸cfu/mL大肠杆菌(E.coli K88)，其中一个处理从攻毒后第2d每天喂料前各猪口服20mL发酵乳杆菌(10⁸cfu/mL)。试验基础日粮同实施例4。

试验结束时用预冻的肝素真空抗凝和不抗凝采血管(Greiner bio-one)前腔静脉采血10 mL。不抗凝的血清管3500rpm，4℃离心20min，分离血清，-70℃冻存备用。抗凝血用流式细胞仪分析外周血的淋巴细胞亚群分布。所有仔猪采血结束后，将猪进行前腔静脉放血屠宰，打开腹腔后，迅速刮取小肠粘膜。整段小肠按17％、83％和100％分为三段，分别为十二指肠、空肠和回肠。在每段的中间取5cm样品用于粘膜取样。所有粘膜样品放入液氮中冷冻，之后在-70℃冻存备用。

3饲养管理

饲养管理同实施例4。

4肠道组织总RNA的提取和质量检测

肠道组织的RNA提取、质量检测及后续的反转录同实施例5。

5TNF-c、IFN-γ和β-actin基因引物设计与普通PCR反应条件的确定(表17)

表17TNF-α、IFN-γ和β-actin基因引物序列

6实时定量荧光PCR

6.1反应体系与程序

定量PCR反应体系同实施例5。根据普通PCR的退火温度，设置温度梯度，确定最佳退火温度，即PCR反应效率最高的温度。通过融解曲线分析，选择合适的读板温度。各基因cDNA的最优定量PCR反应程序如下：(1)50℃2min，去除上一个反应的污染；(2)95℃预变性5min；(3)94℃变性30s；(4)60℃(TNF-α)或58℃(IFN-γ)或64℃(β-actin)退火30s；(5)72℃延伸30s；(6)读板TNF-α82℃，IFN-γ81.6℃，β-actin 83℃，循环33次；(7)72℃延伸5min；(8)65℃到95℃生成融解曲线。反应结束后，样品保存于-20℃备用。

6.2定量PCR反应标准曲线的制作

制作方法同实施例5，其中，TNF-α基因的标准曲线为Y＝-0.28X+9.60；r²＝0.994，线性范围是Ct为0～32.5；IFN-γ基因的标准曲线为Y＝-0.26X+8.95；r²＝0.996，线性范围是Ct为0～31.5；β-actin基因的标准曲线为Y＝-0.28X+8.07；r²＝0.995，线性范围是Ct为0～32.5；X为Ct，Y为起始拷贝数的对数值1g。

7血液指标的测定

7.1外周血T细胞CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞亚群分析

血液CD4⁺与CD8⁺淋巴细胞亚群含量采用流式细胞仪测定。以鼠抗猪-CD4IgG2b(Southern Bictechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL，美国)为PE-荧光标记，鼠抗猪-CD8αIgG2a(Southern Bictechnology Associates，Inc.，Birmingham，AL，美国)为FITC-荧光标记。

7.2血清细胞因子的测定

血清细胞因子IL-2、IL-6、TNF-α和IFN-γ含量采用ELISA试剂盒严格按照说明书步骤测定(Biosource，美国)。

8统计方法

采用SAS 9.0的GLM模型进行两因子方差分析。模型主效应包括发酵乳杆菌和疾病状态(大肠杆菌攻毒)以及二者的互作。同时对各处理进行ANOVA方差分析和Duncan氏多重比较。以P＜0.05为显著性标准。

9结果与讨论

9.1发酵乳杆菌对外周血T淋巴细胞CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞亚群

仔猪口服发酵乳杆菌对外周血T淋巴细胞CD4⁺、CD8⁺淋巴细胞亚群的影响见表18。仔猪口服发酵乳杆菌显著促进外周血CD4⁺淋巴细胞亚群比例(P＜0.05)，但对CD8⁺淋巴细胞亚群比例和CD4⁺/CD8⁺没有产生显著影响。仔猪受一次大肠杆菌攻毒对外周血T淋巴细胞亚群比例和CD4⁺/CD8⁺没有产生显著影响。大肠杆菌和发酵乳杆菌对外周血T淋巴细胞没有显著的交互作用。CD4⁺和CD8⁺作为辅助因子，是参与主要组织相容性复合物(MHC)限制的T细胞活化的辅助分子，可促进T细胞与抗原呈递细胞(APC)或细胞毒性T细胞(CTL)的相互作用。CD4⁺/CD8⁺的比率变化常用作衡量免疫系统强弱的参数

9.2发酵乳杆菌对血清细胞因子含量

仔猪口服发酵乳杆菌对断奶仔猪血清细胞因子的影响见表19。仔猪口服发酵乳杆菌或仔猪大肠杆菌感染后口服发酵乳杆菌对血清细胞因子没有产生显著影响。细胞因子浓度及其表达水平常用来评价宿主对病原微生物和食物抗原的作用强弱，而且已经发现在人和试验动物模型里是一个非常有价值的评价指标。Baken等(2006)等报道Wistar WU鼠连续8d口服Lactobacillus casei Shirota，对血清中IFN-γ也没产生显著影响跟本试验结果相一致。

9.3发酵乳杆菌对小肠TNF-α和IFN-γ基因表达的影响

TNF-α和IFN-γ是由激活效应淋巴细胞分泌，并能激活相关淋巴细胞参与免疫功能调节。近来的研究发现TNF-α和IFN-γ在炎症发生时免疫细胞之间的交互作用中发挥重要作用，因此肠道粘膜上细胞因子的水平常用来评价局部粘膜免疫功能。采用RT-PCR方法检测各处理仔猪肠道粘膜细胞因子表达的变化，各肠段的相对表达结果见表20。仔猪口服发酵乳杆菌显著增加回肠TNF-α和IFN-γ的表达(P＜0.05)，十二指肠和空肠未见有显著的变化。仔猪攻毒大肠杆菌后促进空肠TNF-α和整个小肠IFN-γ的表达(P＜0.05)。

10小结

本试验所用的发酵乳杆菌能增加外周血T淋巴细胞CD4⁺淋巴细胞亚群的比例，促进回肠TNF-α和IFN-γ基因的表达，对不同生理状态仔猪粘膜免疫功能有一定的调节作用。

表18发酵乳杆菌对大肠杆菌攻毒仔猪淋巴细胞亚群的影响

表19发酵乳杆菌对大肠杆菌攻毒仔猪血清细胞因子的影响

表20发酵乳杆菌对大肠杆菌攻毒仔猪肠粘膜免疫细胞因子表达的影响