CN109055227A - 基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂及其保藏方法 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种使用在基因工程菌菌种冻干保藏方法的保护剂及基因工程菌的菌种保藏方法，本技术方案使用食用菌的菌种发酵物作为菌种冻干保藏的保护剂，栽培物经过食用菌菌种发酵，例如香灰菌能够分解常态下不易分解的木质素和纤维素，并使有机物发酵分解，其发酵产物和降解物含有多种能够维持细胞膜结构的完整性、保护细胞蛋白质结构免受破坏的活性小分子，如小分子肽、低聚糖以及其他尚未发现具体化学组成的低分子量物质。经过方案的实施证明，添加了本方案保护剂的实验组与未添加本方案保护剂的对照组相比，实验组方案的技术效果明显更优，证明菌种发酵物在维持菌种存活率和生产性能方面具备优势。
Description
技术领域
本发明涉及菌种保藏领域，具体涉及一种使用在基因工程菌菌种冻干保藏方法的保护剂及基因工程菌的菌种保藏方法。
背景技术
在生物技术领域，基因工程菌的构建是将目的基因导入受体菌并使其表达，并分泌人们所需要的蛋白表达物。基因工程菌构建完成后，为保持其优良的生产性能，方便日后随时取用，需要将菌种进行适当的保藏。目前真空冷冻干燥法是保藏效果最好的方法之一，相对于其他保藏方法，可以很大程度地维持保藏菌种的稳定性和延长保藏时间。然而，将此方法应用于基因工程菌的保藏，需要克服很多困难，一是在基因工程菌中，重组质粒往往表现出不稳定性，易受外界不良因素影响，导致重组基因丢失而无法表达目的蛋白；二是细胞在冻干过程容易因冷冻造成细胞膜或蛋白质的结构被破坏，易受干燥而脱水死亡，导致冻干后菌种的存活率偏低，不利于实际生产应用。
发明内容
为解决上述技术问题，本发明提供了一种适于基因工程菌冻干保藏的方法及该方法所使用的保护剂。
所述保护剂的组成成分及以重量百分数计的含量为：菌种发酵物43%～67%，甘露醇1.4%～2.7%，人血清白蛋白0.2%～0.4%，余量为去离子水。
进一步地，所述保护剂的组成成分及以重量百分数计的含量为：菌种发酵物56%～64%，甘露醇1.8%～2.6%，人血清白蛋白0.25%～0.36%，余量为去离子水。
进一步地，所述菌种发酵物为产业上收割完银耳子实体后剩余的栽培物，其制备方法是将银耳收割后剩下的栽培物在60～70℃下于恒温干燥箱内烘干至无水状态，然后粉碎，粉碎至颗粒均可通过120～180目筛，即颗粒粒径为80微米～120微米，所得细粉即为所述菌种发酵物。所述银耳的栽培物为现有技术中常规使用的栽培物，例如棉籽壳、麸皮、玉米芯或大豆等。
进一步地，所述菌种发酵物还可采用香灰菌的纯培养物。具体做法是将香灰菌按培养物重量的0.4%～1.8%接种到培养物上，设置培养温度为22℃～28℃，发酵7～11天，收获发酵物。将发酵物在60～70℃下于恒温干燥箱内烘干至无水状态，然后粉碎，粉碎至颗粒均可通过120～180目筛，即颗粒粒径为80微米～120微米，此细粉即为所述菌种发酵物。所述栽培物同样为 银耳栽培领域常规使用的培养物。
本发明还提供了一种针对基因工程菌菌种保藏的方法，该方法首先使用LB培养基对基因工程菌进行洗涤和重悬，制成含有数量级为107～109CFU/mL浓度的基因工程菌的悬浮液，将菌悬液分装于无菌西林瓶中，再加入上述保护剂，保护剂用量为菌悬液体积的58%～84%，充分混合均匀后冻干，冻干结束后保存于10℃干燥环境下。
本发明的有益效果在于，使用食用菌的菌种发酵物作为菌种冻干保藏的保护剂，栽培物经过食用菌菌种发酵，例如香灰菌能够分解常态下不易分解的木质素和纤维素，并使有机物发酵分解，其发酵产物和降解物含有多种能够维持细胞膜结构的完整性、保护细胞蛋白质结构免受破坏的活性小分子，如小分子肽、低聚糖以及其他尚未发现具体化学组成的低分子量物质。小分子物质对阻止蛋白质二级结构的改变、冻干处理过程中及保藏期内蛋白质多肽链的伸展和聚集起着显著作用。另一方面，菌种发酵物的细粉及其所含的小分子物质容易结合水分子，并通过水合作用使溶液的黏性增加，弱化了水的结晶过程，使水分的升华变得缓慢，从而起到保护细胞的作用。
经过方案的实施证明，添加了本方案保护剂的实验组与未添加本方案保护剂的对照组在冻干菌种的存活率和生产性能上区别明显，实验组方案的技术效果明显更优，证明菌种发酵物在维持菌种存活率和生产性能方面具备优势。
具体实施方式
为了便于本领域技术人员理解，下面结合具体实施例对本发明作进一步详细的阐述。
实施例1
（1）构建基因工程菌
本方案使用的受体菌大肠杆菌BL21(DE3) 感受态细胞购自北京博迈德基因技术有限公司。向该感受态细胞导入重组质粒，所述重组质粒含有编码EGF蛋白的序列，经验证，目的基因导入并成功表达出EGF蛋白，表明成功构建基因工程菌。
（2）收集银耳栽培物、制备菌种发酵物
收集产业上收割完银耳子实体后剩余的栽培物，将栽培物进行烘干，在70℃下烘干至无水状态，然后粉碎，粉碎至颗粒均可通过180目筛，即颗粒粒径为80微米，得到菌种发酵物。
（3）配制保护剂
按重量百分数计称取上述菌种发酵物64%，甘露醇2.2%，人血清白蛋白0.3%，余量为去离子水，121℃高温蒸汽灭菌20min。
（4）基因工程菌扩大培养
使用LB培养基对步骤（1）构建的基因工程菌进行摇瓶培养，当菌浓度达到107～109CFU/mL时，终止培养，将培养液低速离心后弃去上清液，继续使用LB培养基重悬菌体，所得菌液用于冻干。经过稀释平板计数法检测，测得菌悬液的活菌浓度为6.7×107CFU/mL。
（5）制备冻干制剂、冻干
在无菌条件下，取无菌西林瓶，向其加入步骤（4）菌悬液2mL，再加入步骤（3）保护剂，充分混合均匀，加封橡胶塞后冻干 。保护剂的添加量为菌悬液体积的70%。将上述装有冻干制剂的西林瓶进行预冻，设置降温速率为5℃/min，冷却至-45℃，恒温预冻2h；预冻结束后开启真空泵进行抽真空，在真空度达到50pa时，维持此真空度并以2℃/30min的速率升温，样品升温至12℃时结束冻干过程。冻干结束后加封铝盖，于10℃下干燥保存。
（6）测定菌种存活率
首先测定冻干结束后冻干品的活菌数量，即保藏时间为0个月的活菌数量。测定时设置5个平行试验，测定结果取其平均值。其次，在经过特定的保藏期限后，将保藏6个月、12个月以及18个月的冻干品取出测定各自的活菌数量，上述3组每组同样做5个平行试验。测定方法是各称取1g冻干品，加入1mL无菌生理盐水对其进行复水，然后按照稀释平板计数法测定活菌数量。菌种存活率按式1计算。
式1：
其中，冻干前菌悬液的活菌浓度的数值在本实施例中为6.7×107CFU/mL，冻干制剂的菌悬液体积的数值为2mL。
（7）测定菌种的蛋白表达量
将步骤（4）得到的菌悬液、保藏0个月的冻干品、保藏6个月的冻干品、保藏12个月的冻干品以及保藏18个月的冻干品作为测定蛋白表达量的实验对象，控制菌种接种量、发酵条件等因素一致，得到的发酵液经过微孔过滤除菌及疏水层析后收集到EGF蛋白样品，测量所得蛋白样品的体积。取部分样品，使用NanoVue 紫外/可见光分光光度计测定蛋白质浓度。所得EGF蛋白样品的蛋白总量的计算如式2所示。
式2：
（8）结果分析
经过步骤（6）测定菌种存活率的实验结果如表格1所示，蛋白表达量测定结果如表格2所示。
表格1 菌种存活率
表格 2 蛋白表达量
从以上菌种存活率的实验结果看出，使用本实施例方案冻干制得的菌种能够保持较高的存活率，而且存活率在一定保藏期内能够维持较高的水平；从蛋白表达量的实验结果来看，虽然经过冻干后菌种的蛋白表达量稍有下降，但与未冻干前的菌种的蛋白表达量相差无几，菌种的蛋白表达能力几乎没有受到冷冻及干燥等因素的影响，生产性能基本上保持稳定。上述实验结果表明，本技术方案在其他因素依据现有技术进行常规设计的前提下，采用与现有技术方案不同的保护剂，可以获得理想的保藏菌种。
本技术方案的另一积极效果还在于，使用了产业上收割完银耳子实体后剩余的栽培物作为保护剂的成分之一，由于所述的栽培物被菌种分解利用后，不再含有较多的有机物，理论上对菌种的栽培不再有较大的利用价值，因此大部分栽培物作为肥料或者被丢弃，由此造成资源浪费，其潜在的利用价值难以被开发。而本技术方案利用了此栽培物，将其应用于菌种的保藏，并取得了有益的效果，实现废物利用，符合可持续发展的理念。
实施例2
（1）构建基因工程菌
实施例2方案使用的基因工程菌与实施例1使用的基因工程菌相同，不再赘述。
（2）香灰菌发酵、菌种发酵物制备
按重量百分数计称取香灰菌发酵培养基，其组成及含量为棉籽壳45%、麸皮28%、大豆粉13%、石膏1.6%，余量为水。将上述培养基高温灭菌后在无菌条件下接入香灰菌的纯菌种，接种量为培养基重量的0.5%。接种后置于26℃下恒温发酵培养，在第8天结束培养，收集发酵物。将发酵物进行烘干，在70℃下烘干至无水状态，然后粉碎，粉碎至颗粒均可通过180目筛，即颗粒粒径为80微米，得到菌种发酵物。
（3）配制保护剂
按重量百分数计称取步骤（2）菌种发酵物56%，甘露醇2.4%，人血清白蛋白0.36%，余量为去离子水，121℃高温蒸汽灭菌20min。
（4）基因工程菌扩大培养
使用LB培养基对步骤（1）构建的基因工程菌进行摇瓶培养，当菌浓度达到107～109CFU/mL时，终止培养，将培养液低速离心后弃去上清液，继续使用LB培养基重悬菌体，所得菌液用于冻干。经过稀释平板计数法检测，测得菌悬液的活菌浓度为3.1×108CFU/mL。
（5）制备冻干制剂、冻干
在无菌条件下，取无菌西林瓶，向其加入步骤（4）菌悬液2mL，再加入步骤（3）保护剂，充分混合均匀，加封橡胶塞后冻干 。保护剂的添加量为菌悬液体积的80%。将上述装有冻干制剂的西林瓶进行预冻，设置降温速率为5℃/min，冷却至-45℃，恒温预冻2h；预冻结束后开启真空泵进行抽真空，在真空度达到50pa时，维持此真空度并以2℃/30min的速率升温，样品升温至12℃时结束冻干过程。冻干结束后加封铝盖，于10℃下干燥保存。
（6）测定菌种存活率
测定菌种存活率的方法和流程与实施例1相同，同样以保藏时间为0个月、保藏时间为6个月、保藏时间为12个月以及保藏时间为18个月的冻干品作为测定菌种存活率的实验对象。测定结果如表格3所示。
（7）测定菌种的蛋白表达量
将步骤（4）得到的菌悬液、保藏0个月的冻干品、保藏6个月的冻干品、保藏12个月的冻干品以及保藏18个月的冻干品作为测定蛋白表达量的实验对象，控制菌种接种量、发酵条件等因素一致，得到的发酵液经过微孔过滤除菌及疏水层析后收集到EGF蛋白样品，测量所得蛋白样品的体积。取部分样品，使用NanoVue 紫外/可见光分光光度计测定蛋白质浓度。所得EGF蛋白样品的蛋白总量的计算方法与实施例1相同，不再赘述。菌种的蛋白表达量测定结果如表格4所示。
表格3 菌种存活率
表格 4 蛋白表达量
根据以上菌种存活率和蛋白表达量的测定结果，在与实施例1的对比下，实施例2的方案中使用了香灰菌发酵物作为保护剂成分，其带来的菌种保藏效果要好于实施例1，说明实施例2的方案相对于实施例1是更优的技术方案。
对照例
对照例使用与实施例1相同的基因工程菌，其步骤、流程和测定方法与实施例1均相同，制备冻干制剂所加入的菌种为同一菌种，即实施例1步骤（4）的菌种，二者菌种生长特性一致。唯一的区别在于保护剂的成分及含量，对照例方案所使用的保护剂为现有技术中常规使用的，其成分为脱脂乳16%，蔗糖3.5%，海藻糖7%，甘露醇2.2%，人血清白蛋白0.3%，余量为去离子水。保护剂的添加量同样为菌悬液体积的70%。经过与实施例1相同实施流程后，其菌种存活率与蛋白表达量的测定结果如表格5和表格6所示。
表格5 菌种存活率
需要说明的是，本对照例中，由于冻干品的含量较少，无法做到称取1g样品检测其活菌数量，因此，为保证数值准确，测定时直接在冻干品中加入生理盐水进行复水后检测，从而得到上述菌种存活率。
表格6 蛋白表达量
通过以上菌种存活率与蛋白表达量的测定结果可以看出，对照例方案使用蔗糖、脱脂乳等普通保护剂，对于提高基因工程菌菌种冻干保藏效果不显著。与实施例1相比，对照例方案的冻干品在经历一段保藏时间后其菌种存活率下降的趋势较明显，其蛋白表达能力也无法维持较高的水平。以上结果表明，与现有的常规保护剂相比，菌种发酵物在菌种冻干保藏过程中在维持菌种存活率和生产性能方面更具优势。
需要说明的是，上述方案仅仅列举了银耳菌种栽培物、香灰菌发酵物作为保护剂成分之一的实施例，由于本发明的主旨思想主要还在于菌种发酵物富含多种能够维持细胞膜结构的完整性、保护细胞蛋白质结构免受破坏的小分子代谢物和分解物，而将菌种发酵物作为保护剂成分之一。因此，本发明技术方案还可使用其他菌种的发酵培养物，而不仅局限于银耳的栽培物。同样地，由于菌种发酵物包含的活性因子主要作用于细胞膜表面，以保证膜结构和蛋白质结构的完整性，因此本发明方案还可用于其他基因工程菌的菌种保藏，例如以DH5α-感受态细胞为受体的重组大肠杆菌的菌种保藏。本领域技术人员在本发明方案基础上所做出的任何简单替换而实现等同效果的，应当落入本发明的保护范围。
Claims (9)
1.一种用于基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂，其特征在于，含量以重量百分数计，其组成包括以下成分：菌种发酵物43%～67%，甘露醇1.4%～2.7%，人血清白蛋白0.2%～0.4%，余量为去离子水。
2.根据权利要求1所述的用于基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂，其特征在于，含量以重量百分数计，所述菌种发酵物为56%～64%，甘露醇1.8%～2.6%，人血清白蛋白0.25%～0.36%，余量为去离子水。
3.根据权利要求1所述的用于基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂，其特征在于，所述菌种发酵物为产业上收割完银耳子实体后剩余的栽培物经过烘干、粉碎后制得的细粉，其中，烘干过程是在60～70℃下于恒温干燥箱内烘干至无水状态，粉碎过程将所述栽培物粉碎至颗粒均可通过120～180目筛，即颗粒粒径为80微米～120微米。
4.根据权利要求1所述的用于基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂，其特征在于，所述菌种发酵物为培养物经过香灰菌发酵培养后进行烘干、粉碎后制得的细粉，其中，发酵培养天数为7～11天，烘干过程是在60～70℃下于恒温干燥箱内烘干至无水状态，粉碎过程将所述经过香灰菌发酵后的培养物粉碎至颗粒均可通过120～180目筛，即颗粒粒径为80微米～120微米。
5.根据权利要求4所述的用于基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂，其特征在于，所述菌种发酵物的制备是将香灰菌按培养物重量的0.4%～1.8%接种到培养物上，设置培养温度为22℃～28℃，发酵7～11天，收获香灰菌的菌种发酵物。
6.根据权利要求5所述的用于基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂，其特征在于，所述培养物的组成及其以重量百分数计的含量为棉籽壳45%、麸皮28%、大豆粉13%、石膏1.6%，余量为水。
7.一种基因工程菌菌种冻干保藏的方法，其特征在于，包括以下步骤：首先，使用LB培养基对基因工程菌进行洗涤和重悬，制成含有数量级为107～109CFU/mL浓度的基因工程菌的悬浮液；然后，将上述基因工程菌的菌悬液分装于无菌西林瓶中，再加入权利要求1至4任一项所述的用于基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂，保护剂用量为菌悬液体积的58%～84%，充分混合均匀后冻干，冻干结束后将冻干成品保存于10℃干燥环境下。
8.根据权利要求7所述的基因工程菌菌种冻干保藏的方法，其特征在于，所述基因工程菌为以BL21(DE3)感受态细胞为受体的重组大肠杆菌，并已导入含有编码EGF蛋白的序列的重组质粒。
9.根据权利要求7所述的基因工程菌菌种冻干保藏的方法，其特征在于，所述基因工程菌为以DH5α-感受态细胞为受体的重组大肠杆菌。
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