CN107254428A - 一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用 - Google Patents

一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用 Download PDF

Info

Publication number
CN107254428A
CN107254428A CN201710349299.5A CN201710349299A CN107254428A CN 107254428 A CN107254428 A CN 107254428A CN 201710349299 A CN201710349299 A CN 201710349299A CN 107254428 A CN107254428 A CN 107254428A
Authority
CN
China
Prior art keywords
expression
antifreeze peptide
lactic acid
acid bacteria
peptide
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201710349299.5A
Other languages
English (en)
Inventor
吴金鸿
张莉
罗静
金泉
谢凡
兰小红
王正武
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shanghai Jiaotong University
Original Assignee
Shanghai Jiaotong University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shanghai Jiaotong University filed Critical Shanghai Jiaotong University
Priority to CN201710349299.5A priority Critical patent/CN107254428A/zh
Publication of CN107254428A publication Critical patent/CN107254428A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K14/00—Peptides having more than 20 amino acids; Gastrins; Somatostatins; Melanotropins; Derivatives thereof
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/74—Vectors or expression systems specially adapted for prokaryotic hosts other than E. coli, e.g. Lactobacillus, Micromonospora

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Gastroenterology & Hepatology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Preparation Of Compounds By Using Micro-Organisms (AREA)

Abstract

本发明公开了一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用，具体的本发明公开了一种可以表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统的制备方法，首先将人工合成的抗冻肽编码基因构建于克隆载体上；获得的重组质粒，酶切后连接到带Nisin抗性基因nisr的表达载体，从而构建所述抗冻肽的表达质粒；转化至乳酸乳球菌感受态细胞，获得可以表达抗冻肽的所述食品级乳酸菌表达系统。本发明所构建的食品级基因工程菌对人体和环境安全系数高，可应用于医药、食品等诸多行业。

Description

一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用
技术领域
本发明属于生物与食品技术领域，具体地本发明设计一种可以表达抗冻肽的食品级乳酸菌的制备方法及其抗冻活性的表征，更具体地本发明涉及一种新型冷冻干燥保护剂抗冻肽在乳酸菌食品级表达系统上的构建和应用。
背景技术
抗冻肽(antifreeze peptide，AFP)是一些低温生物为适应极端寒冷环境而产生的一类多肽或糖肽。AFP具有特殊的抗冻活性，主要表现为：(1)能结合到冰晶表面并抑制冰晶进一步生长；(2)能以非依数形式降低溶液的冰点，使溶液的熔点和冰点之间出现差值，表现为热滞活性；(3)具有冰重结晶抑制效应。由于AFP特殊的抗冻作用可使零下低温环境下存活的生物避免受到细胞间形成冰晶引起的损伤或致死作用，因此近年来AFP的资源开发及其应用引起了广泛关注，并发现在冷冻食品加工与储藏、细胞保藏、抗冻农作物栽培、渔业养殖、器官移植和冷冻手术等领域开发中具有诱人的商业应用前景。
由于AFP具有重要的商业应用价值，因此近年来国际上对AFP研究引起日益广泛的关注。至今人们已经从鱼类、昆虫、植物、细菌、真菌中发现了数十种抗冻蛋白，并对其结构、功能和抗冻特性进行了全面和深入研究。但是，从天然低温生物中提取AFP的成本高得率低，影响了其应用价值。如何提高AFP产量降低其生产成本是实现AFP应用于冷冻食品加工需要解决的一个瓶颈问题。目前已经有相关研究在AFP结构和功能研究基础上，探索通过应用现代生物技术，采用化学合成和基因工程生物表达的方法进行AFP制备。但是化学合成和基因工程生物表达的AFP的某些安全性问题也不容质疑。化学合成产物中有毒有害痕量物质残留影响其安全性。利用基因工程菌，尤其是大肠杆菌是目前广泛采用的进行活性蛋白或多肽生物表达的宿主。但由于大肠杆菌是一种致病菌，而且其使用的抗生素标记会在人体肠道中发生生物移植，影响人体正常的免疫功能，因此作为大肠杆菌表达分泌的蛋白或多肽产物在食品工业中的应用由于安全性问题受到了限制。
发明内容
本发明的目的是提供一种可以表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统的制备方法及其具体应用。
为了达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：首先构建一种具有细胞低温保护活性的抗冻肽，然后采用分子调控手段，利用带Nisin抗性基因nisr的乳酸乳球菌食品级胞内表达载体pNZ8149构建表达该抗冻肽的重组质粒，通过电转化乳酸乳球菌NZ3900，表达抗冻肽，构建食品级基因工程菌，最后表征抗冻肽表达对乳酸乳球菌抗冻干胁迫性的影响。
本发明的第一方面，提供了一种可以表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统的制备方法，所述方法包括步骤：
1)将人工合成的抗冻肽编码基因构建于克隆载体上；
2)克隆并提取步骤1)获得的重组质粒，酶切后获得所述抗冻肽DNA序列；
3)将步骤2)获得的所述冻肽DNA序列连接到带Nisin抗性基因nisr的表达载体，从而构建所述抗冻肽的表达质粒；
4)将步骤3)获得的所述抗冻肽的表达质粒转化至乳酸乳球菌感受态细胞，利用Nisin抗性基因筛选表达所述抗冻肽的乳酸乳球菌，从而获得可以表达抗冻肽的所述食品级乳酸菌表达系统。
优选地，所述步骤1)中，所述抗冻肽编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。
优选地，所述步骤1)中，所述克隆载体为pUC57载体。
优选地，所述步骤3)中，所述表达载体为带Nisin抗性基因nisr的乳酸乳球菌表达载体pNZ8149。
优选地，所述步骤4)中，所述乳酸乳球菌感受态细胞为乳酸乳球菌表达菌株NZ3900的感受态细胞。
优选地，所述步骤4)中，通过转化平板筛选和确定阳性克隆菌株，然后挑选阳性克隆菌落，进行PCR鉴定和提取质粒测序，从而验证成功构建表达抗冻肽的所述食品级乳酸菌表达系统。
优选地，所述步骤4)中，PCR鉴定步骤中，PCR鉴定引物对如SEQ ID NO.2和SEQ IDNO.3所示。
本发明的第二方面，提供了一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统，所述表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统使用本发明第一方面所述的方法构建而得。
在另一优选例中，所述表达系统为乳酸乳球菌表达菌株NZ3900。
本发明的第三方面，提供了一种制备抗冻肽的的方法，所述方法使用本发明第二方面所述的表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统表达所述抗冻肽。
优选地，所述方法还包括步骤：利用Nisin作为诱导剂诱导所述表达食品级乳酸菌表达系统表达所述抗冻肽；更优选地，诱导Nisin浓度为20-50ng/ml(较佳地为25ng/ml)。
在另一优选例中，所述方法包括步骤：将本发明第二方面的表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统培养至对数生长初期，然后调节pH至5-6，加入诱导剂Nisin(浓度20-50ng/mL)，在30-40℃继续培养6h。
在本发明的一个优选地实施方式中，按照乳酸乳球菌密码子偏好性进行优化的抗冻肽核苷酸序列为：
ccatgggtTGTAAAGGTGCGGATGGAGCCCACGGAGTTAATGGGTGCCCTGGCACCGCTGGGGCTGCAGGCAGCGTAGGTGGGCCTGGATGCGACGGAGGCCACGGTGGTAATGGAGGCAACGGTAATCCGGGCTGTGCCGGTGGCGTCGGCGGTGCGGGAGGGGCGAGTGGCGGGACTGGAGTTGGGGGTCGAGGCGGCAAAGGTGGCTCGGGAACACCGAAAGGTGCGGACGGCGCGCCGGGCGCTCCTTGTAAGGGGGCCGACGGAGCACATGGTGTCAACGGATGTCCGGGGACTGCCGGCGCAGCAGGTTCTGTCGGAGGACCTGGCTGTGACGGTGGCCACGGCGGCAATGGAGGTAATGGGAATCCGGGTTGTGCAGGGGGAGTTGGCGGAGCGGGGGGCGCAAGCGGAGGAACAGGAGTAGGCGGCAGAGGAGGAAAAGGTGGCTCGGGAACGCCAAAAGGCGCTGATGGCGCCCCTGGTGCCCCGCATCATCATCATCATCACTAAGAGCTC(SEQ ID NO.1)
在本发明的一个优选地实施方式中，上游酶切位点NcoI，下游酶切位点SacI，基因合成构建于pUC57载体(克隆载体)上。
在本发明的一个优选地实施方式中，采用双酶切，连接，转化技术，构建上述基因的乳酸杆菌表达载体，载体选用含有NisinA启动子的pNZ8149。
在本发明的一个优选地实施方式中，通过电转化将重组载体转化乳酸乳球菌表达菌株NZ3900。
本发明所述的将重组载体转化乳酸乳球菌表达菌株NZ3900中，NZ3900感受态的制备包括以下步骤：
(1)取出-80℃冰箱保存甘油冻存管，转接到5mL G/L-SGM17B液体培养基,加0.5％葡萄糖，30℃静置培养24h；
(2)将上述5mL培养物转接到50mL G/L-SGM17B液体培养基,加0.5％葡萄糖，30℃静置培养24h；
(3)将上述50mL培养物转接到400mL G/L-SGM17B液体培养基,加0.5％葡萄糖，30℃静置培养约3h，直至OD600nm达到0.2；
(4)上述培养物，6000rpm，4℃离心20min，收集菌体；
(5)400mL缓冲液(0.5M sucrose,10％glycerol,高压灭菌)洗涤菌体，6000rpm，4℃离心5min，收集沉淀菌体；
(6)200mL缓冲液(0.5M sucrose,10％glycerol,50mM EDTA，高压灭菌)悬浮菌体，冰浴15min；6000rpm，4℃离心5min，沉淀收集菌体；
(7)100mL缓冲液(0.5M sucrose,10％glycerol,高压灭菌)洗涤菌体，6000rpm，4℃离心5min，沉淀收集菌体；
(8)4mL缓冲液(0.5M sucrose,10％glycerol,高压灭菌)重悬菌体；
(9)40μL一管分装到Ep管中，冰浴备用，或长期冻存于-80℃冰箱。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明所述的将重组载体转化乳酸乳球菌表达菌株NZ3900中，转化包括以下步骤：
(1)向NZ3900感受态细胞加入1μL目的DNA(pNZ8149与外源基因的连接产物)，转移至预冷的电转杯，继续冰浴5min；
(2)电击转化条件：2000V，25μF，200Ω，4.5-5ms；
(3)电击结束后，电转杯内加入1mL G/L-SGM17B液体培养基，20mM MgCl2+2mMCaCl2；
(4)电转杯冰浴5min，30℃静置培养1-1.5h；
(5)吸取100μL涂布Elliker琼脂平板，加入0.5％葡萄糖；
(6)30℃静置培养1-2天。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明所述的将重组载体转化乳酸乳球菌表达菌株NZ3900中，通过转化平板筛选和确定阳性克隆菌株，然后挑选阳性克隆菌落，进行PCR鉴定和提取质粒测序，验证表达抗冻肽的食品级乳酸菌构建成功。
在本发明的一个优选地实施方式中，利用Nisin作为诱导剂诱导表达重组菌株，通过镍亲和层析和SDS-PAGE纯化表达产物，并对其抗冻活性进行分析。
在本发明的一个优选地实施方式中，本发明提供了可以表达抗冻肽的食品级乳酸菌，重组菌株是以食品级选择标记取代了抗生素抗性标记载体，所构建的食品级基因工程菌对人体和环境安全系数高，可应用于医药、食品、化妆品等诸多行业。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
1.本发明是以食品级选择标记取代了抗生素抗性标记载体，所构建的食品级基因工程菌对人体和环境安全系数高，可应用于医药、食品等诸多行业。
2.通过本发明制备的基因工程菌，简化了乳酸菌表达质粒的传统构建方法，且该方法的可操作性强，也极大降低了生产成本。
3.本发明利用构建的食品级乳酸菌表达系统成功进行了一种抗冻肽的表达，提供了一种具体抗冻特性的新型食品级乳酸菌工程菌，提升了其抗冻干胁迫性，具有重要的应用价值。
附图说明
图1是阳性菌落和阴性菌落平板示意图(Elliker培养基)；
图2阳性克隆菌落PCR鉴定结果；
图3重组菌株表达目标蛋白的Western-Blot结果。10.Protein Marker；1’-9’.NZ3900空载菌对应条件下的Western-Blot结果。
具体实施方式
下面结合具体实施例，阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明详细条件的实验方法，通常按照常规条件如美国Sambrook.J等著《分子克隆实验室指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。除非另外说明，否则百分比和份数按重量计算。以下实施例中所用的实验材料和试剂如无特别说明均可从市售渠道获得。
乳酸乳球菌(Lactococcus lactis)是肠道有益菌，而且已完成其基因组序列分析，近年来以乳酸乳球菌为宿主的食品级表达系统研究及应用逐渐成为食品工业、生物制药和口服疫苗研究热点。与大肠杆菌、酵母等表达系统相比，食品级乳酸乳球菌表达系统具有以下优点：(1)为食品级微生物，遗传背景清楚且稳定安全，不产生内毒素，与酵母系统相比不会产生无活性蛋白；(2)已经开发了一系列适用的食品级标记基因，如乳链菌肽(Nisin)抗性基因nisr，取代各种抗生素抗性标记，避免了抗生素抗性基因在动物和人体内转移的生物性危害；(3)已经开发了一系列适用的食品级表达载体，如pND648、pFMN30、pLEB690、pLEB688载体；(4)表达过程中不会形成包涵体，表达效率高。同时，由于乳酸菌是可食用益生菌，作为发酵剂可直接应用于酸奶、泡菜、发酵香肠和豆瓣酱传统生产中，因此乳酸菌表达活性肽产物可以不用分离，直接作为食品添加剂应用于食品加工中，可以大大节约生物活性肽生产制备成本。
为了提高菌株质量、储藏的稳定性及应用性，乳酸菌一般制成冻干菌粉进行生产应用。然而在冷冻干燥过程，由于受到多种环境胁迫作用，如冻结(或低温)胁迫和干燥胁迫，引起乳酸菌细胞中的细胞膜通透性改变、磷脂膜由液晶态转变成凝胶态、膜脂肪酸组成改变、膜的流动性或完整性改变、调节生理活动的关键蛋白质或酶变性失活等，导致菌体细胞大量死亡。为了减少冷冻干燥损伤，最关键措施是添加得当的保护剂。研究报道的常用保护剂主要有小分子保护剂(如氨基酸、糖醇类、脂肪酸、低聚糖类和表面活性剂)和大分子保护剂(如多糖、蛋白质和多肽)两类。
本发明构建了一种可应用高活性重组抗冻肽制备的食品级乳酸乳球菌表达系统，为实现新型抗冻肽在冷冻食品加工以及高活性乳酸菌粉生产中应用开发一种新的技术途径和提供具有理论指导意义的科学依据。
实施例1
首先构建一种具有细胞低温保护活性的抗冻肽，对乳酸乳球菌密码子进行优化，最终获得优化后的最佳多核苷酸序列如下：
ccatgggtTGTAAAGGTGCGGATGGAGCCCACGGAGTTAATGGGTGCCCTGGCACCGCTGGGGCTGCAGGCAGCGTAGGTGGGCCTGGATGCGACGGAGGCCACGGTGGTAATGGAGGCAACGGTAATCCGGGCTGTGCCGGTGGCGTCGGCGGTGCGGGAGGGGCGAGTGGCGGGACTGGAGTTGGGGGTCGAGGCGGCAAAGGTGGCTCGGGAACACCGAAAGGTGCGGACGGCGCGCCGGGCGCTCCTTGTAAGGGGGCCGACGGAGCACATGGTGTCAACGGATGTCCGGGGACTGCCGGCGCAGCAGGTTCTGTCGGAGGACCTGGCTGTGACGGTGGCCACGGCGGCAATGGAGGTAATGGGAATCCGGGTTGTGCAGGGGGAGTTGGCGGAGCGGGGGGCGCAAGCGGAGGAACAGGAGTAGGCGGCAGAGGAGGAAAAGGTGGCTCGGGAACGCCAAAAGGCGCTGATGGCGCCCCTGGTGCCCCGCATCATCATCATCATCACTAAGAGCTC(SEQ ID NO.1)。
内切酶使用的为NcoI和SacI，基因合成构建于pUC57载体(购自南京金斯瑞生物科技有限公司)上。
采用双酶切，连接，转化技术，构建上述基因的乳酸杆菌表达载体，载体选用pNZ8149(购自Mobitec(Germany)公司)，酶切位点NcoI/SacI。
将重组载体转化乳酸乳球菌表达菌株NZ3900(购自Mobitec(Germany)公司)：
NZ3900感受态制备方法：
取出-80℃冰箱保存甘油冻存管，转接到5mL G/L-SGM17B液体培养基(加0.5％葡萄糖，需要单独灭菌)，30℃静置培养24h；
将上述5mL培养物转接到50mL G/L-SGM17B液体培养基(加0.5％葡萄糖，需要单独灭菌)，30℃静置培养24h；
(1)将上述50mL培养物转接到400mL G/L-SGM17B液体培养基(加0.5％葡萄糖，需要单独灭菌)，30℃静置培养约3h，直至OD600nm达到0.2；
(2)上述培养物，6000rpm，4℃离心20min，收集菌体；
(3)400mL缓冲液(0.5M sucrose,10％glycerol,高压灭菌)洗涤菌体，6000rpm，4℃离心5min，收集沉淀菌体；
(4)200mL缓冲液(0.5M sucrose,10％glycerol,50mM EDTA，高压灭菌)悬浮菌体，冰浴15min；6000rpm，4℃离心5min，沉淀收集菌体；
(5)100mL缓冲液(0.5M sucrose,10％glycerol,高压灭菌)洗涤菌体，6000rpm，4℃离心5min，沉淀收集菌体；
(6)4mL缓冲液(0.5M sucrose,10％glycerol,高压灭菌)重悬菌体；
(7)40μL一管分装到Ep管中，冰浴备用，也可以长期冻存于-80℃冰箱。
电转化条件和步骤：
(1)上述感受态细胞，加入1μL DNA(pNZ8149与外源基因的连接产物)，转移至预冷的电转杯，继续冰浴5min；
(2)电击转化条件：2000V，25μF，200Ω，4.5ms；
(3)电击结束后，电转杯内加入1mL G/L-SGM17B液体培养基(20mM MgCl2+2mMCaCl2)；
(4)电转杯冰浴5min，30℃静置培养1h；
(5)吸取100μL涂布Elliker琼脂平板(加入0.5％葡萄糖)；
(6)30℃静置培养30h。
因为pNZ8149质粒携带的lacF基因，表达的蛋白可以转化培养基中的溴甲酚紫，从而使得带有重组质粒的阳性菌落颜色变黄，所以通过转化平板筛选和确定阳性克隆菌株。
阳性菌落和阴性菌落平板结果见附图1.
挑选阳性克隆菌落，直接菌落PCR鉴定，鉴定引物序列如下：
8149F：TCTGAAGTTTGTTAGATACAAT(SEQ ID NO.2)
8149R：AAGCAACACGTGCTGTAATTTG(SEQ ID NO.3)
阳性菌落PCR鉴定结果见附图2。
对比阳性克隆菌落获得的PCR产物长度，SF-P和CS-P均为800bp左右，而空载体的PCR产物长度为300bp。
挑取阳性克隆菌落，使用M17培养基(加入0.5％葡萄糖)扩大培养，然后提取质粒送测序。测序结果发现阳性菌落质粒与目的基因密码子核苷酸序列一致，验证重组菌落构建成功。
实施例2抗冻肽的表达和纯化
按实施例1构建抗冻肽SF-P后，通过SDS-PAGE和Western-Blot优化SF-P的表达条件。
将SF-P重组菌株接种于含有0.5％葡萄糖的GM17液体培养基内，接种量为1％，30℃静置培养过夜，然后按1％(V/V)的接种量接种于新鲜的含0.5％葡萄糖的GM17液体培养基内，30℃静置培养2-3h至对数生长初期(OD值为0.4-0.5)，调节pH分别为4、5、6，加入诱导剂Nisin(浓度分别为25、50、100ng/mL)，分别在20、30、40℃继续静置培养6、12、24h，3000r/min，4℃，离心6min收集菌体。0.02mol/l PBS清洗，并用超声波细胞破壁仪破壁，12000r/min，4℃，10min离心，收集上清液。SDS-PAGE和Western-Blot鉴定最佳表达条件。使用同样条件培养空载菌株作为对照组。
经Nisin诱导表达重组菌株SF-P，本发明人发现pH(4、5、6)、诱导剂Nisin的浓度(25、50、100ng/mL)、温度(20、30、37℃)和培养时间(3、6、12h)对目的蛋白表达量有较大影响。本发明人对最佳表达条件进行了优化，部分优化实验的培养条件见表1。使用Western-Blot鉴定最佳表达条件。鉴定结果如图3所示。结果表明在pH＝6，诱导剂Nisin浓度为25ng/ml，温度为37℃，培养6h的条件下目标蛋白的表达量最高，表达量可以达到其它实验组的5-50倍。NZ3900空载菌作为对照组。Western-Blot鉴定发现目标蛋白表达的分子量约为15kDa，而NZ3900空载菌在15kDa位置未见明显条带。
表1
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 上海交通大学
<120> 一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用
<130> 01335-17077PIX
<160> 3
<170> PatentIn version 3.5
<210> 1
<211> 521
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 1
ccatgggttg taaaggtgcg gatggagccc acggagttaa tgggtgccct ggcaccgctg 60
gggctgcagg cagcgtaggt gggcctggat gcgacggagg ccacggtggt aatggaggca 120
acggtaatcc gggctgtgcc ggtggcgtcg gcggtgcggg aggggcgagt ggcgggactg 180
gagttggggg tcgaggcggc aaaggtggct cgggaacacc gaaaggtgcg gacggcgcgc 240
cgggcgctcc ttgtaagggg gccgacggag cacatggtgt caacggatgt ccggggactg 300
ccggcgcagc aggttctgtc ggaggacctg gctgtgacgg tggccacggc ggcaatggag 360
gtaatgggaa tccgggttgt gcagggggag ttggcggagc ggggggcgca agcggaggaa 420
caggagtagg cggcagagga ggaaaaggtg gctcgggaac gccaaaaggc gctgatggcg 480
cccctggtgc cccgcatcat catcatcatc actaagagct c 521
<210> 2
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 2
tctgaagttt gttagataca at 22
<210> 3
<211> 22
<212> DNA
<213> 人工序列
<400> 3
aagcaacacg tgctgtaatt tg 22

Claims (10)

1.一种可以表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统的制备方法，其特征在于，所述方法包括步骤：
1)将人工合成的抗冻肽编码基因构建于克隆载体上；
2)克隆并提取步骤1)获得的重组质粒，酶切后获得所述抗冻肽DNA序列；
3)将步骤2)获得的所述冻肽DNA序列连接到带Nisin抗性基因nisr的表达载体，从而构建所述抗冻肽的表达质粒；
4)将步骤3)获得的所述抗冻肽的表达质粒转化至乳酸乳球菌感受态细胞，利用Nisin抗性基因筛选表达所述抗冻肽的乳酸乳球菌，从而获得可以表达抗冻肽的所述食品级乳酸菌表达系统。
2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述抗冻肽编码基因序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤1)中，所述克隆载体为pUC57载体。
4.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤3)中，所述表达载体为带Nisin抗性基因nisr的乳酸乳球菌表达载体pNZ8149。
5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，所述乳酸乳球菌感受态细胞为乳酸乳球菌表达菌株NZ3900的感受态细胞。
6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，通过转化平板筛选和确定阳性克隆菌株，然后挑选阳性克隆菌落，进行PCR鉴定和提取质粒测序，从而验证成功构建表达抗冻肽的所述食品级乳酸菌表达系统。
7.如权利要求6所述的方法，其特征在于，所述步骤4)中，PCR鉴定步骤中，PCR鉴定引物对如SEQ ID NO.2和SEQ ID NO.3所示。
8.一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统，其特征在于，所述表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统使用权利要求1所述的方法构建而得。
9.一种制备抗冻肽的的方法，其特征在于，所述方法使用权利要求8所述的表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统表达所述抗冻肽。
10.如权利要求9所述的方法，其特征在于，所述方法还包括步骤：利用Nisin作为诱导剂诱导所述表达食品级乳酸菌表达系统表达所述抗冻肽。
CN201710349299.5A 2017-05-17 2017-05-17 一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用 Pending CN107254428A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710349299.5A CN107254428A (zh) 2017-05-17 2017-05-17 一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201710349299.5A CN107254428A (zh) 2017-05-17 2017-05-17 一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107254428A true CN107254428A (zh) 2017-10-17

Family

ID=60027326

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201710349299.5A Pending CN107254428A (zh) 2017-05-17 2017-05-17 一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107254428A (zh)

Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055227A (zh) * 2018-09-27 2018-12-21 广州市金因源生物技术有限公司 基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂及其保藏方法
CN110055257A (zh) * 2019-04-12 2019-07-26 上海交通大学 一种雪蚤抗冻蛋白sf-p的制备方法及其应用
CN110643561A (zh) * 2019-10-30 2020-01-03 上海市农业科学院 glms基因在乳酸菌生物安全性筛选标记中的应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101638665A (zh) * 2008-08-01 2010-02-03 王春凤 乳酸菌单质粒Nisin诱导表达载体的构建及使用方法

Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101638665A (zh) * 2008-08-01 2010-02-03 王春凤 乳酸菌单质粒Nisin诱导表达载体的构建及使用方法

Non-Patent Citations (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BRAD L. PENTELUTE 等: "X-ray Structure of Snow Flea Antifreeze Protein Determined by Racemic Crystallization of Synthetic Protein Enantiomers", 《J AM CHEM SOC.》 *
CHUAN-MEI YEH 等: "Production of a recombinant type 1 antifreeze protein analogue by L. lactis and its applications on frozen meat and frozen dough", 《JOURNAL OF AGRICULTURAL AND FOOD CHEMISTRY》 *
张莉 等: "重组抗冻肽在乳酸乳球菌中表达及其抗冻活性研究", 《食品与机械》 *

Cited By (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109055227A (zh) * 2018-09-27 2018-12-21 广州市金因源生物技术有限公司 基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂及其保藏方法
CN109055227B (zh) * 2018-09-27 2022-06-10 广州市金因源生物技术有限公司 基因工程菌菌种冻干保藏的保护剂及其保藏方法
CN110055257A (zh) * 2019-04-12 2019-07-26 上海交通大学 一种雪蚤抗冻蛋白sf-p的制备方法及其应用
CN110643561A (zh) * 2019-10-30 2020-01-03 上海市农业科学院 glms基因在乳酸菌生物安全性筛选标记中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN107502585A (zh) 一株高效合成聚‑γ‑谷氨酸的地衣芽孢杆菌工程菌
EP4276171A1 (en) Bacillus subtilis genetically engineered bacterium for producing tagatose and method for preparing tagatose
CN101948794A (zh) 产植物类黄酮合成相关酶的工程乳酸菌及其构建和应用
CN107254428A (zh) 一种表达抗冻肽的食品级乳酸菌表达系统构建及其应用
CN104694559A (zh) 一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的dna片段及表达方法
CN108220219B (zh) 一套植物乳杆菌食品级表达系统及其在异源蛋白表达中的应用
CN112813085A (zh) 焦磷酸酶基因的用途
CN107828806A (zh) 一种新型耐葡萄糖的β‑葡萄糖苷酶基因及其应用
CN102703368A (zh) 一种产角蛋白酶的基因工程菌及其应用
CN104726360A (zh) 一种大肠杆菌和乳酸杆菌穿梭载体的构建及应用
CN105861522A (zh) 一种抗菌肽Enterocin P 及其制备方法和应用
CN102220276B (zh) 一种产胆盐水解酶的基因工程菌及其构建方法和应用
CN101638665B (zh) 乳酸菌单质粒Nisin诱导表达载体的构建及使用方法
CN102382790A (zh) 一种高产过氧化氢酶的重组枯草芽孢杆菌及其构建方法和应用
CN112574980A (zh) 一种热稳定性和高酶活力的重组褐藻胶裂解酶及其应用
CN101654681A (zh) 一种乳酸菌食品级表达载体pMG36N及其制备方法
CN114703117B (zh) 一种重组枯草芽孢杆菌、其构建方法及一种重组胶原酶
CN106497958A (zh) 一种快速构建重组质粒的方法
CN116064360A (zh) 一种提高菌株冷冻干燥存活率的方法
CN107217064B (zh) 超氧化物歧化酶基因及其编码蛋白
CN102898512B (zh) 一种重组菌丝霉素及其制备方法和用途
CN109022406A (zh) 一种具有冷适应特性的褐藻胶裂解酶AlgA1及其应用
CN103911337A (zh) 高粘附性丁酸梭菌及其制备方法
CN111394293B (zh) 一株布鲁氏菌S2疫苗株Omp16基因条件性诱导缺失菌株、其构建方法及应用
CN108251546A (zh) 一种植物乳杆菌内源性信号肽的预测方法及其应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination