CN104694559A - 一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的dna片段及表达方法 - Google Patents

Abstract

本发明属于生物基因工程领域，提供了一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶DNA片段及表达方法。本发明是利用基因合成手段直接获得鸡蛋清溶菌酶的基因，经过酶切、连接等操作后将基因导入到真核表达载体pPIC9K中，并转化到毕赤酵母GS115中进行高拷贝重组子的筛选，然后通过甲醇诱导实现重组鸡蛋清溶菌酶在胞外的高效表达。本方法不受原材料来源的限制，不仅能增加该溶菌酶基因的拷贝数，提高酶的表达量和活性，还简化了后期分离纯化工艺，实现了鸡蛋清溶菌酶的大批量工业化生产。其产品具有稳定、纯净、生物活性高的特点，可广泛应用于制药、饲料等多个领域。

Description

一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的DNA片段及表达方法

技术领域

本发明属于生物基因工程领域，是一种利用毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶DNA片段及表达方法。

背景技术

饲料中大量添加亚治疗量的抗生素和促生长剂，造成了动物耐药性的产生。由于这种多抗性、顽固病菌的出现，使传统抗生素面临巨大挑战。面对未来，必须开拓全新路径，从自然界中寻求具有抗菌消炎、增强免疫力的活性物质作为替代品已成为人们日益关心的问题。我国著名的微生物学专家魏曦说过：“光辉的抗生素之后的时代将是光辉的生态制剂时代”。溶菌酶是被认为替代抗生素的最有前途的产品。

溶菌酶(lysozyme)又称脆壁质酶或N-乙酰壁质聚糖水解酶，能降解细菌细胞壁中N-乙酞胞壁酸和N-乙酞氨基葡糖之间的β-1，4糖苷键，从而破坏细胞壁，使得细菌由于渗透溶解而死亡。对溶菌酶的研究首先是从尼科辽(Nicolle)1907年发表枯草芽孢杆菌溶解因子的报告开始的。两年后，拉希琴科(Laschtscbenko)指出，鸡蛋清有强抑菌作用，是酶作用的结果。1922年，弗来明(Fleming)发现人的鼻涕、唾液、眼泪也有强力的溶菌活性，因其具有溶菌作用，被命名为溶菌酶。溶菌酶广泛存在于动物、植物和微生物中，在动物体内主要存在于唾液、组织液和鸡蛋清中，而在蛋清中溶菌酶约占总蛋白的3.5％，是目前溶菌酶制剂的主要来源之一。作为一种天然的抗菌剂，溶菌酶无毒、无害、安全性高，故在食品领域受到广泛关注。

根据溶菌酶氨基酸序列和底物的差异，可以将溶菌酶大致分为3种类型：c型(鸡蛋清溶菌酶)、g型(鹅蛋清溶菌酶)和噬菌体溶菌酶。迄今为止，生产上应用最多的是鸡蛋清溶菌酶(hen egg white lsozyme)。鸡蛋清中溶菌酶的含量很丰富，约占蛋清总蛋白的3.4％-3.5％，作为溶菌酶类的典型代表，是结构了解最清楚的溶菌酶之一。它含有129个氨基酸，分子量约为14,300Da，鸡蛋清溶菌酶具有的广谱抗性使其在食品和医学等领域早已得到广泛地应用。溶菌酶制剂能有效防止球虫病，饲喂小麦基础日粮的鸡，添加和不添加酶对球虫病的应激呈现不同的反应，对照组鸡生长被抑制52.5％，而加酶组为30.5％，而且损伤系数要好得多。此外，溶菌酶还能改变肠道微生物群，增加肠道有益菌，使肠道内的胺、甲酚等有害物减少，增加机体抗病力，提高动物的生产性能。在不用任何抗生素情况下，于肉鸡饲料中添加饲用溶菌酶制剂，可促进鸡体的健康，增加体重和饲料报酬，减少死亡。饲用溶菌酶可以促进饲料中营养物质的消化、吸收，提高饲料的消化率，最大限度地提高饲料原料的利用率。

目前，我国主要采用蛋厂鸡蛋壳中残留的鸡蛋清为原料来生产鸡蛋清溶菌酶，其中相关的报道很多，有直接结晶法、亲和色谱法、离子交换法、沉淀法、双水相萃取、超滤法等。各种方法优缺点不一，产品的质量和生产成本也有所不同。溶菌酶制备材料相当有限、来源极其困难，因原料来源受限和分离纯化成本较高限制了其应用，无法进行工业化生产，难于满足越来越大的市场需求，因此寻找其他廉价的生产鸡蛋清溶菌酶的途径是非常有意义的，近年来人们正研究利用分子生物技术构建基因工程菌，通过发酵手段生产溶菌酶，将是提高溶菌酶产量，降低成本的有效手段之一。

发明内容

本发明的目的正是为了克服传统方法的不足，而提供一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，本方法利用基因合成技术直接获得鸡蛋清溶菌酶的cDNA序列，应用真核毕赤酵母表达系统，构建含有相关基因的重组毕赤酵母工程菌株，在甲醇的诱导下实现鸡蛋清溶菌酶在胞外的高效表达。此方法不受原材料来源的限制，不仅能增加该溶菌酶基因的拷贝数，提高酶的表达量和活性，还简化了后期分离纯化工艺，实现了鸡蛋清溶菌酶的大批量工业化生产。

本发明解决其技术问题：

一种DNA序列，其中编码鸡蛋清溶菌酶信号肽的DNA段是根据毕赤酵母密码子偏爱性优化合成，优化后的DNA序列如序列表1所示；

上述利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，具体方法包括以下几个步骤：

(1)获取鸡蛋清溶菌酶基因lyz：根据Gene Bank中已发表的编码具有鸡蛋清溶菌酶蛋白活性的多肽氨基酸序列，合成了鸡蛋清溶菌酶的cDNA序列，并根据毕赤酵母表达宿主进行了密码子的优化，多肽氨基酸序列如序列表2所示；

(2)重组质粒的构建：用酶切连接的方法分别将上述目的基因lyz与表达载体pPIC9K相连，得到携带目的基因的重组表达载体pPIC9K-lyz，并进行双酶切验证；

(3)基因工程菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株GS115中，得到含有重组质粒的基因工程菌株；

(4)高拷贝重组子的筛选和鉴定：利用G418(氨基糖苷类抗生素)浓度梯度进行高拷贝重组子的筛选，再用菌落PCR方法进一步筛选及鉴定高拷贝抗性菌株；

(5)重组鸡蛋清溶菌酶的高效表达：利用甲醇诱导重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶。

优选的，上述一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，所用的真核表达载体是毕赤酵母表达载体pPIC9K，表达宿主细胞是毕赤酵母GS115菌株。

优选的，上述一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，所述步骤(2)中基因工程菌株的构建方法中所用的内切酶为EcoRⅠ和NotⅠ，50μL酶切体系为：

优选的，上述一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，所述步骤(2)中基因工程菌株的构建方法中所10μL连接体系为：

优选的，一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，所述步骤(4)中重组工程菌株GS115/pPIC9K-lyz的筛选步骤为：

将重组pPIC9k-lyz质粒经SacⅠ酶切线性化后，用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内，通过0-4.0mg/mL G418(氨基糖苷类抗生素)压力筛选4mg/mLG418的转化子被筛出，经PCR检测鸡蛋清溶菌酶基因稳定整合到毕赤酵母菌染色体上，挑取拷贝数较高的转化子进行His⁺Mut⁺表型筛选，将最终筛选到的多拷贝转化子命名为GS115/pPIC9k-lyz，简称鸡蛋清溶菌酶基因工程菌。

优选的，一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，所述步骤(5)中重组鸡蛋清溶菌酶的高效表达工艺为：

取GS115/pPIC9K-lyz单菌落，将酵母菌株GS115/pPIC9K、重组酵母菌株GS115/pPIC9K-lyz单克隆分别接种至30mL YPD(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)培养基，27-32℃，180-220r/min培养18-24h，按10-12％的接种量分别接种至30mL BMGY培养基中，其pH 5.0-6.5，27-32℃，180-220r/min培养至OD₆₀₀＝2.0-6.0，室温，2500-4000r/min离心细胞5-10min。弃去上清液，用30mL的初始pH值为3.0-6.5的BMMY培养基重悬细胞沉淀，以0.5-3.0％甲醇，27-32℃，180-220r/min，诱导表达72-96h后。取诱导菌液1.0mL，4℃，12000r/min离心2-5min，将菌液上清保存于-20℃待用。将诱导的上清进行SDS-PAGE蛋白电泳鉴定。

优选的，一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，所用YPD培养基成分为10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，余量为蒸馏水；BMGY培养基成分为10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，pH 5.0-6.5的100mmol/LPBS缓冲液，13.4g/L YNB(酵母氮源碱)，4×10^-4g/L生物素，5g/L甘油，余量为蒸馏水；BMMY培养基成分为10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，pH3.0-6.5的100mmol/L PBS缓冲液，13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，5.0-30mL/L甲醇，余量为蒸馏水。

重组鸡蛋清溶菌酶的酶活力测定包括以下几个步骤：

①底物的制备

本实验所用底物是溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)，称取干酶粉15～20mg，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.5～1mL，在研钵内研磨3min，再加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量，使总体积约为50mL，使悬浮液于25±0.1℃时，在450nm的波长处测得的吸光度为0.70±0.005(临用前配制)。

②供试溶液的制备

取本品适量(相当于含溶菌酶约为10mg)，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量使溶解，稀释成每1mL中含溶菌酶50μg的溶液。

③操作方法

精密量取25±0.1℃的底物悬浮液3mL，置1cm比色皿中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数A<[0]>，然后精密量取25±0.1℃的供试品溶液0.15mL，加到上述比色皿中，迅速混匀，用秒表计时，至60s时再测定吸收度A；同时精密量取磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.15mL，同法操作，做为空白试验，测得零秒的读数A'<[0]>及60s的读数A'，以确保测定的准确度和精度，每个标准样和样品至少重复作3次。在25℃，pH值6.2时，在波长450nm处，每分钟引起吸收度下降0.001为一个酶活力单位。按下式计算：

式中W为测定液中供试品的重量，μg。

本发明的有益效果：

本发明以毕赤酵母表达系统为基础，运用基因工程重组技术构建基因工程菌株，应用基因合成获得相关酶基因，并应用分子生物学制药技术，将基因工程菌在甲醇的诱导下实现鸡蛋清溶菌酶在胞外的高效表达。此方法不受原材料来源的限制，不仅能增加该溶菌酶基因的拷贝数，提高酶的表达量和活性，还简化了后期分离纯化工艺，实现了鸡蛋清溶菌酶的大批量工业化生产。为大量、低价、工业化生产鸡蛋清溶菌酶提供了一条可行途径，不仅具有经济效益，还具有一定的社会效益。

附图说明

图1为本发明所用表达载体图谱；

图2为本发明的载体构建示意图；

图3为本发明pPIC9K-lyz重组表达质粒的酶切验证电泳图，其中：

M为DNA marker；1-4泳道为可能含有目的基因的重组子的酶切产物；5泳道为不含目的基因的质粒pPIC9K的酶切产物；

图4为本发明重组菌菌落PCR验证电泳图；

图5为本发明的重组毕赤酵母菌GS115/pPIC9K-lyz的SDS-PAGE蛋白表达电泳图，其中：

泳道M为低分子量蛋白Marker；泳道4为酵母菌株GS115/pPIC9K诱导后的发酵样品；泳道1-3为重组酵母菌株GS115/pPIC9K-lyz诱导后的发酵样品。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明所述技术方案作进一步的说明。

实施例1

本发明所涉及的利用基因工程重组菌发酵生产鸡蛋清溶菌酶的方法，是利用基因合成技术直接获得鸡蛋清溶菌酶的cDNA序列，构建包含目的基因lyz的重组表达载体，应用毕赤酵母表达系统，在甲醇诱导下实现鸡蛋清溶菌酶lyz基因在胞外的高效表达。本发明所用的目的基因是根据NCBI公布的鸡蛋清溶菌酶蛋白序列(ACCESSION NUMBER:GI345100466)合成的，本发明中所用载体为穿梭型质粒pPIC9K，重组载体的宿主细胞为毕赤酵母GS115。所构建的重组表达载体不仅包括编码酶的DNA序列，还具有表达该基因所需的控制元件。

具体构建方法的步骤如下：

1、获取鸡蛋清溶菌酶基因lyz

根据NCBI公布的编码鸡蛋清溶菌酶的氨基酸序列(ACCESSIONNUMBER:GI345100466)，按照毕赤酵母密码子偏爱性重新优化序列，替换稀有密码子，调节AT含量，使其可在毕赤酵母GS115中高效表达，然后将该优化的基因序列交给上海英潍捷基公司合成，合成后的序列克隆至pMD19-T载体。

2、重组质粒的构建

①利用小提试剂盒提取pPIC9K质粒用作连接酶基因的载体，载体图谱如图1所示。将合成得到的含有鸡蛋清溶菌酶lyz基因的菌株活化，利用小提试剂盒提取DH5α/pMD19-T-lyz的质粒，pMD19-T-lyz和pPIC9K质粒分别用限制性内切酶EcoRⅠ和NotⅠ进行双酶切，均选用50μL酶切体系：

②酶切后的载体和目的基因的连接，均选用10μL连接体系：

所得连接混合物采用DNA纯化试剂盒进行纯化，纯化后产物用于电转化法转化大肠杆菌DH5α。载体构建示意图如附图2所示。

3、基因工程菌株的构建：

制备大肠杆菌DH5α的感受态细胞，将感受态细胞置于冰上融化。在一管50μL的感受态中加入5μL上述纯化处理的连接产物，混匀后冰浴30min，42℃热击90s，冰浴2min，加入800μL LB培养液，混匀后转入1.5mL离心管中，于37℃，180r/min慢摇1h。按每个平板100μL涂布到含氨苄青霉素(100μg/mL)的LA平板上，37℃倒置培养过夜16h)。平板上长出了10个白色单菌落，从中挑取4个单菌落，接种于含氨苄青霉素(100μg/mL)液体LB培养基中，于37℃培养16h，然后小量提取重组质粒，同时用EcoRⅠ和NotⅠ双酶切重组质粒，结果如附图3所示，共出现三个阳性菌落，1、2、3泳道得到了与目的基因同等大小的目的片段，将鉴定正确的重组质粒命名为pPIC9K-lyz。

制备毕赤酵母GS115的感受态细胞，将SacⅠ酶切重组表达质粒pPIC9K-lyz的线性化质粒(5μg)与80μL感受态细胞混合后转移到冰预冷的0.2cm电击杯中，冰浴5min，电击转化(2.5KV，5ms)酵母感受态细胞，立即向电击杯中加入1mL冰冷的1mol/L山梨醇，混匀后，以每板300μL菌液涂布到MD平板上，30℃培养至长出阳性重组子。

4、高拷贝重组子的筛选和鉴定

将上一步筛选到的在MD平板上生长良好的菌落用牙签点种至含G418终浓度依次为0，0.5，2.0，3.0和4.0mg/mL的YPD的抗性平板各一块，30℃培养2d，随着G418浓度的增加，平板上长出的克隆数逐渐减少，当G418浓度达到4.0mg/mL时只得到8株单克隆，将筛选得到抗最高浓度(4.0mg/mL)G418的重组毕赤酵母命名为GS115/pPIC9K-lyz。将这8只单克隆抗性菌株接入YPD液体培养基中培养，分别用载体引物(α-Factor，3′-AOX)进行菌落PCR验证。PCR检测结果附图4所示。

从图中可以看出，1、4、5号的目的条带浓度比2，3，6，7，8号的高，在同样的生长条件和PCR模版用量一致的情况下，出现这种结果很可能是由于酵母整合目的基因拷贝数差异造成的。挑选1、4、5号克隆同时点种于酵母选择培养MD和MM平板的相应位置，30℃平板培养，筛选在MM平板上生长缓慢而在MD平板上生长良好的重组子作为最终的多拷贝转化子。两天后两块平板上长出的菌落同样大小，说明这三个菌落均为His⁺Mut⁺表型，Mut⁺表型利用甲醇的速度较快，表达速度也较快。

5、重组鸡蛋清溶菌酶的高效表达

取GS115/pPIC9K-lyz单菌落，将酵母菌株GS115/pPIC9K、重组酵母菌株GS115/pPIC9K-lyz单克隆分别接种至30mL YPD培养基，30℃，220r/min培养24h，按10％的接种量分别接种至30mL BMGY培养基中(pH 6.0)，30℃，220r/min培养至OD₆₀₀＝4.0，室温，4000r/min离心细胞5min。弃去上清液，用30mL的初始pH值为4.0的BMMY培养基重悬细胞沉淀，以2.0％甲醇，30℃，220r/min，诱导表达72h后。取诱导菌液1.0mL，4℃，12000r/min离心2min，将菌液上清保存于-20℃待用。将诱导的上清进行SDS-PAGE。电泳结果见附图5所示。

结果显示，1-3号泳道在14.3kDa处均有一条特异的条带，且与预期的鸡蛋清溶菌酶蛋白分子量大小相一致，而不含有目的基因的对照菌在14.3kDa处无明显的蛋白条带。表明经过甲醇的诱导.鸡蛋清溶菌酶基因在毕赤酵母菌株成功实现了分泌表达。

实施例2

重组鸡蛋清溶菌酶的酶活力测定：

①底物的制备

本实验所用底物是溶壁微球菌(Micrococcus lysodeikticus)，称取干酶粉20mg，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)1mL，在研钵内研磨3min，再加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量，使总体积约为50mL，使悬浮液于25±0.1℃时，在450nm的波长处测得的吸光度为0.70±0.005(临用前配制)。

②供试溶液的制备

取本品适量(相当于含溶菌酶约为10mg)，加磷酸盐缓冲液(pH6.2)适量使溶解，稀释成每1mL中含溶菌酶50μg的溶液。

③操作方法

精密量取25±0.1℃的底物悬浮液3mL，置1cm比色皿中，在450nm的波长处测定吸收度，作为零秒的读数A<[0]>，然后精密量取25±0.1℃的供试品溶液0.15mL，加到上述比色皿中，迅速混匀，用秒表计时，至60s时再测定吸收度A；同时精密量取磷酸盐缓冲液(pH6.2)0.15mL，同法操作，做为空白试验，测得零秒的读数A'<[0]>及60s的读数A'，以确保测定的准确度和精度，每个标准样和样品至少重复作3次。在25℃，pH值6.2时，在波长450nm处，每分钟引起吸收度下降0.001为一个酶活力单位。按下式计算：

式中W为测定液中供试品的重量，μg。

经测定本发明鸡蛋清溶菌酶酶活力达到1425U/mg。

实施例3

重组鸡蛋清溶菌酶的抑菌活性的测定：

LB培养基中加入2％琼脂，混合均匀，放入高压灭菌锅中，0.12MPa灭菌30min冷却至50℃，倒平板，每个平板加入约20mL培养基，水平放置，等待培养基凝固，平板表面的水膜挥发完全后，取稀释到菌数大约为5×10⁷cfu/mL的指示菌悬液100μL，涂布到平板上，把牛津杯轻轻地放到培养基表面，用镊子轻轻地挤压，使牛津杯和培养基完全吻合，吸取200μL目标溶菌酶液加入到牛津杯中，注意不可溢出，然后盖好平板，平放到4℃冰箱内过夜，转入培养箱中，35℃培养15h，测量抑菌圈。

选择造成禽类感染的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、魏氏梭菌指示菌这4种主要致病菌进行溶菌酶产品抑菌能力分析，用牛津杯法测定抑菌圈的大小。每组样品3个平行，每个平板内4株菌，同时以磷酸盐缓冲液作为对照。

选择造成禽类感染的4种主要致病菌进行抑菌能力分析，测定溶菌酶产品抑制大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、沙门氏菌、魏氏梭菌指示菌的能力，结果如表1所示，在滴加溶菌酶液的牛津杯周围形成直径为10mm～17mm的圆形抑菌圈，而含磷酸盐缓冲液的牛津杯周围无抑菌圈，说明本项目的溶菌酶具有一定的抑菌能力，在饲料养殖过程中可以起到重要的杀菌作用。其中，溶菌酶产品对金黄色葡萄球菌的抑菌效果最好，同时平板扩散实验还显示抑菌圈大小和酶活力呈正相关，溶菌酶活力越强抑菌效果越好。

表1重组鸡蛋清溶菌酶的抑菌能力验证(mm)

	溶菌酶L-1	溶菌酶L-2	溶菌酶L-3	磷酸盐缓冲液L-0
					大肠杆菌	11.86	11.57	11.75	0
金黄色葡萄球菌	16.02	16.83	16.75	0
					沙门氏菌	12.91	12.03	12.36	0
魏氏梭菌	13.82	13.67	13.11	0

上述参照实施例对该鸡蛋清溶菌酶及其制备方法进行的详细描述，是说明性的而不是限定性的，可按照所限定范围列举出若干个实施例，因此在不脱离本发明总体构思下的变化和修改，应属本发明的保护范围之内。

1编码具有鸡蛋清溶菌酶蛋白活性的多肽氨基酸序列

2鸡蛋清溶菌酶基因优化后的核苷酸序列

Claims (8)

1.一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的DNA序列，其特征是，其中编码鸡蛋清溶菌酶信号肽的DNA段是根据毕赤酵母密码子偏爱性优化合成，优化后的DNA序列如序列表1所示。

2.一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征是，包括以下几个步骤：

(1)获取鸡蛋清溶菌酶基因lyz：根据Gene Bank中已发表的编码具有鸡蛋清溶菌酶蛋白活性的多肽氨基酸序列，合成了鸡蛋清溶菌酶的cDNA序列，并根据毕赤酵母表达宿主进行了密码子的优化，多肽氨基酸序列如序列表2所示；

(2)重组质粒的构建：用酶切连接的方法分别将上述目的基因lyz与表达载体pPIC9K相连，得到携带目的基因的重组表达载体pPIC9K-lyz，并进行双酶切验证；

(3)基因工程菌株的构建：将上述验证正确的重组表达载体转化宿主菌株GS115中，得到含有重组质粒的基因工程菌株；

(4)高拷贝重组子的筛选和鉴定：利用氨基糖苷类抗生素G418浓度梯度进行高拷贝重组子的筛选，再用菌落PCR方法进一步筛选及鉴定高拷贝抗性菌株；

(5)重组鸡蛋清溶菌酶的高效表达：利用甲醇诱导重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶。

3.根据权利要求2所述的一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征在于：方法中所用的真核表达载体是毕赤酵母表达载体pPIC9K，表达宿主细胞是毕赤酵母GS115菌株。

4.根据权利要求2所述的一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征在于：基因工程菌株的构建方法中所用的内切酶为EcoRⅠ和NotⅠ，50μL酶切体系为：

5.根据权利要求2所述的一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征在于：基因工程菌株的构建方法中所10μL连接体系为：

6.根据权利要求2所述的一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征在于，重组工程菌株GS115/pPIC9K-lyz的筛选步骤为：

将重组pPIC9k-lyz质粒经SacⅠ酶切线性化后，用电穿孔法将其转入毕赤酵母细胞内，通过0-4.0mg/mL氨基糖苷类抗生素G418压力筛选4mg/mL G418的转化子被筛出，经PCR检测鸡蛋清溶菌酶基因稳定整合到毕赤酵母菌染色体上，挑取拷贝数高的转化子进行His⁺Mut⁺表型筛选，将最终筛选到的多拷贝转化子命名为GS115/pPIC9k-lyz，简称鸡蛋清溶菌酶基因工程菌。

7.根据权利要求2所述的一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征在于重组鸡蛋清溶菌酶的高效表达工艺为：

取GS115/pPIC9K-lyz单菌落，将酵母菌株GS115/pPIC9K、重组酵母菌株GS115/pPIC9K-lyz单克隆分别接种至30ml YPD培养基(酵母浸出粉胨葡萄糖培养基)，27-32℃，180-220r/min培养18-24h，按质量百分比10-12％的接种量分别接种至30ml BMGY培养基中，其pH 5.0-6.5，27-32℃，180-220r/min培养至OD₆₀₀＝2.0-6.0，室温，2500-4000r/min离心细胞5-10min；弃去上清液，用30ml初始pH值为3.0-6.5的BMMY培养基重悬细胞沉淀，以0.5-3.0％甲醇，27-32℃，180-220r/min，诱导表达72-96h后，取诱导菌液1.0mL，4℃，12000r/min离心2-5min，将菌液上清保存于-20℃待用，将诱导的上清进行SDS-PAGE蛋白电泳鉴定。

8.根据权利要求2所述的一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的方法，其特征在于，所用YPD培养基成分为10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，20g/L葡萄糖，余量为蒸馏水；BMGY培养基成分为10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，pH 5.0-6.5的100mmol/L PBS缓冲液，13.4g/L YNB(酵母氮源碱)，4×10^-4g/L生物素，5g/L甘油，余量为蒸馏水；BMMY培养基成分为10g/L酵母粉，20g/L蛋白胨，pH3.0-6.5的100mmol/L PBS缓冲液，13.4g/L YNB，4×10^-4g/L生物素，5.0-30mL/L甲醇，余量为蒸馏水。