CN107794274A - 一种人源溶菌酶蛋白生产工艺 - Google Patents

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CN107794274A CN201711022926.0A CN201711022926A CN107794274A CN 107794274 A CN107794274 A CN 107794274A CN 201711022926 A CN201711022926 A CN 201711022926A CN 107794274 A CN107794274 A CN 107794274A
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Abstract

本发明涉及一种人源溶菌酶蛋白生产工艺。本发明是基于传统的人源溶菌酶6的核苷酸序列，进行密码子优化后，通过人工合成而获得的一种具有与传统人源溶菌酶6的核苷酸序列有28.4％差异的新的人源溶菌酶序列，但编码的蛋白序列完全一致，溶菌酶产量却有大幅提高，通过使用具有kanamycin抗性的酵母表达载体pPIC9K，可以使用遗传霉素来筛选，大大获得高表达菌株的几率。

Description

一种人源溶菌酶蛋白生产工艺
技术领域
本发明涉及基因工程领域，具体涉及一种人源溶菌酶蛋白生产工艺。
背景技术
溶菌酶(lysozyme)又称胞壁质酶(muramidase)或N-乙酰胞壁质聚糖水解酶(N-acetylmuramideglycanohydrlase)，是一种能水解致病菌中黏多糖的碱性酶。主要通过破坏细胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之间的β-1,4糖苷键，使细胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，导致细胞壁破裂内容物逸出而使细菌溶解。溶菌酶还可与带负电荷的病毒蛋白直接结合，与DNA、RNA、脱辅基蛋白形成复盐，使病毒失活。溶菌酶对革兰阳性菌、好氧性孢子形成菌、枯草杆菌、地衣型芽孢杆菌等都有抗菌作用，而对没有细胞壁的人体细胞不会产生不利影响。因此，适合于各种食品的防腐。另外，该酶还能杀死肠道腐败球菌，增加肠道抗感染力，同时还能促进婴儿肠道双歧乳酸杆菌增殖，促进乳酪蛋白凝乳利于消化，所以又是婴儿食品、饮料的良好添加剂。溶菌酶对人体完全无毒、无副作用，具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，是一种安全的天然防腐剂。在干酪的生产中，添加一定量的溶菌酶，可防止微生物污染而引起的酪酸发酵，以保证干酪的质量。新鲜的牛乳中含有少量的溶菌酶，每100mL约含13mg，而人乳中含有40mg/mL溶菌酶。若在鲜乳或奶粉中加入一定量的溶菌酶，不但有防腐保鲜剂的作用，而且可达到强化婴儿乳品的目的，有利于婴儿的健康。溶菌酶作为一种存在于人体正常体液及组织中的非特异性免疫因素，具有多种药理作用，它具有抗菌、抗病毒、抗肿瘤的功效，医用溶菌酶其适应症为出血、血尿、血痰和鼻炎等。溶菌酶具有破坏细菌细胞壁结构的功能，以此酶处理G+细菌得到原生质体，因此，溶菌酶是基因工程、细胞工程中细胞融合操作必不可少的工具酶。
中国专利CN105586327A公开了一种人源溶菌酶蛋白纯化方法，通过复合型阳离子交换介质分离纯化发酵液中人源溶菌酶的新工艺，得到较高的蛋白投入产出比，但是此种方法虽然能提高纯化效率，但是产量依然局限于宿主细胞的蛋白表达量，对于实际生产来说，并不能有多高的提升。中国专利 CN101979591B公开了一种以水稻为生物反应器生产人溶酶菌的方法，表达体系稳定，表达效率高，成本低，规模化生产容易，生物活性高，无病原菌污染，但是水稻作为载体，生产周期长，用于工业化大量生产效率极低，并不适合于生产。中国专利CN1206351C公开了一种溶菌酶蛋白生产工艺及其应用，通过将序列连接于载体，转入酵母细胞中进行表达筛选分离纯化获得溶菌酶蛋白，其使用的载体是pPIC9，该载体不具有在酵母菌中筛选的抗性标记，只能通过营养筛选，筛选效率低；产量也较低。
发明内容
为了解决现有人源溶菌酶蛋白筛选效率低，产量低下的问题，我们提出了一种人源溶菌酶蛋白生产工艺。
本发明是通过以下技术方案实现的：
为实现上述目的，本发明提供一种人源溶菌酶蛋白生产工艺，生产工艺包括以下步骤：
(1)将SeqIDNo:1所示核苷酸序列通过人工合成获得；根据酵母细胞对密码子的偏好性，我们对传统的人源溶菌酶序列进行了优化，将其中某些在酵母细胞中使用频率较低的编码密码子替换成在酵母细胞中使用频率较高的编码密码子。传统人源溶菌酶的核苷酸序列以及优化后的溶菌酶核苷酸序列如下：
传统溶菌酶成熟蛋白核苷酸序列：
AAGGTCTTTGAAAGGTGTGAGTTGGCCAGAACTCTGAAAAGATTGGGAATGGATGGCTACAGGGGAATCAGCCTAGCAAA CTGGATGTGTTTGGCCAAATGGGAGAGTGGTTACAACACACGAGCTACAAACTACAATGCTGGAGACAGAAGCACTGATT ATGGGATATTTCAGATCAATAGCCGCTACTGGTGTAATGATGGCAAAACCCCAGGAGCAGTTAATGCCTGTCATTTATCC TGCAGTGCTTTGCTGCAAGATAACATCGCTGATGCTGTAGCTTGTGCAAAGAGGGTTGTCCGTGATCCACAAGGCATTAG AGCATGGGTGGCATGGAGAAATCGTTGTCAAAACAGAGATGTCCGTCAGTATGTTCAAGGTTGTGGAGTGTAA
本发明优化后的溶菌酶成熟蛋白核苷酸序列：
AAAGTTTTCGAACGTTGTGAATTGGCCAGAACTTTGAAGAGATTGGGTATGGACGGTTACCGTGGTATCTCTTTGGCTAA CTGGATGTGTTTGGCCAAGTGGGAATCTGGTTACAACACTAGAGCTACTAACTACAACGCCGGTGACCGTTCTACTGACT ACGGTATCTTCCAAATTAACTCTAGATACTGGTGTAACGACGGTAAGACTCCAGGCGCCGTTAACGCCTGTCACTTGTCT TGTTCTGCTTTGTTGCAAGACAACATCGCTGACGCCGTTGCCTGTGCTAAACGCGTCGTTCGTGACCCACAAGGTATCCG CGCTTGGGTCGCTTGGCGTAACCGTTGTCAAAACCGCGACGTCCGTCAATACGTTCAAGGTTGTGGTGTCTAA
其他优化过的溶菌酶成熟蛋白序列：
AAGGTCTTCGAGAGATGTGAGTTGGCTAGAACCTTGAAGAGACTTGGTATGGACGGTTACAGAGGTATTTCCTTGGCTAA TTGGATGTGCTTGGCTAAGTGGGAGTCTGGCTACAATACCAGAGCTACTAACTACAACGCTGGTGACAGATCCACTGACT ACGGTATTTTCCAGATCAATTCCCGTTACTGGTGCAACGACGGTAAGACCCCAGGCGCTGTCAATGCTTGTCACTTGTCC TGTTCCGCTTTGCTGCAAGACAATATCGCTGACGCCGTCGCCTGTGCCAAGAGAGTTGTTAGAGACCCACAAGGTATTAG AGCTTGGGTCGCTTGGAGAAATAGATGTCAAAATAGAGACGTTAGACAATACGTCCAAGGTTGCGGTGTCTAG
然后采取人工合成的方法合成优化的溶菌酶序列，合成的序列如下：
其中，虚线框部分为pPIC9K载体上的序列，框中的序列分别为XhoI 和EcoRI酶切位点。
(2)合成后的序列通过平端连接克隆至pGH载体中，该质粒记为 pGH-LYC；
(3)用XhoI和EcoRI分别酶切pGH-LYC和pPIC9K，将切下的LYC 片段与pPIC9K通过T4连接酶相连，连接产物转化DH5α感受态细胞；
(4)经菌落PCR鉴定为阳性的克隆，提取质粒，即获得pPIC9K-LYC 质粒；
(5)将pPIC9K-LYC质粒转入宿主细胞，筛选出表达人源溶菌酶蛋白的重组细胞；
(6)高密度培养上述重组细胞；
(7)通过分离出具有人源溶菌酶活性的蛋白，并制成冻干粉；
(8)冻干粉长期保存于-80℃冰箱，短期保存于-20℃冰箱。
优选地，上述SeqIDNo:1为能编码具有人源溶菌酶活性蛋白的DNA分子。溶菌酶成熟蛋白的氨基酸序列如下(SeqIDNo:2)：
KVFERCELARTLKRLGMDGYRGISLANWMCLAKWESGYNTRATNYNAGDRSTDYGIFQINSRYWCNDGKTPGAVNACHLSCSALLQDNIADAVACAKRVVRDPQGIRAWVAWRNRCQNRDVRQYVQGCG V
优选地，上述步骤(4)中通过卡那霉素抗性筛选重组细胞。新一代的酵母表达载体pPIC9K，在酵母菌中具有kanamycin抗性，可以使用遗传霉素来筛选，大大获得高表达菌株的几率。
优选地，上述步骤(5)中的宿主细胞为甲醇酵母。
优选地，上述甲醇酵母为毕赤酵母GS115。具有醇氧化酶AOX1基因启动子，这是目前最强，调控机理最严格的启动子之一；表达效率高,其表达的外源蛋白可占总表达蛋白的90％以上,有利于目的蛋白的分离纯化；在简单合成培养基中可实现高密度培养；表达质粒能在基因组的特定位点以单拷贝或多拷贝的形式稳定整合；由于该酵母可以以甲醇为唯一碳源和能源,而绝大多数微生物并不能以甲醇为碳源,可以减少污染。
与现有技术相比，本发明的有益效果在于：
(1)本发明中使用的是新一代的酵母表达载体pPIC9K，在酵母菌中具有kanamycin抗性，可以使用遗传霉素来筛选，大大获得高表达菌株的几率。
(2)用本发明新的优化的序列表达的溶菌酶蛋白产量要高于传统序列表达的溶菌酶产量。
附图说明
图1为三种人源溶菌酶蛋白的DNA序列对比；
图中：OptimizedLYC为本发明的序列，2005LYC为2005年公开的人源溶菌酶蛋白的DNA序列，classicLYC为传统人源溶菌酶蛋白的DNA序列
图2为pPIC9K的质粒结构图；
图3为pPIC9K的PAOX1和多克隆位点；
图4为SDS-PAGE凝胶电泳检测发酵罐上清0-86小时各时间点的蛋白表达量；
图5为不同时间点取样的溶菌酶上清的比活力。
具体实施方式
下面结合实施例，更具体地说明本发明的内容。应当理解，本发明的实施并不局限于下面的实施例，对本发明所做的任何形式上的变通或改变都落入本发明保护范围；且下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
实施例1：
一种人源溶菌酶蛋白生产工艺，生产工艺包括以下步骤：
(1)将SeqIDNo:1所示核苷酸序列通过人工合成获得；首先设计优化核苷酸序列，设计序列如下：
AAAGTTTTCGAACGTTGTGAATTGGCCAGAACTTTGAAGAGATTGGGTATGGACGGTTACCGTGGTATCTCTTTGGCTAA CTGGATGTGTTTGGCCAAGTGGGAATCTGGTTACAACACTAGAGCTACTAACTACAACGCCGGTGACCGTTCTACTGACT ACGGTATCTTCCAAATTAACTCTAGATACTGGTGTAACGACGGTAAGACTCCAGGCGCCGTTAACGCCTGTCACTTGTCT TGTTCTGCTTTGTTGCAAGACAACATCGCTGACGCCGTTGCCTGTGCTAAACGCGTCGTTCGTGACCCACAAGGTATCCG CGCTTGGGTCGCTTGGCGTAACCGTTGTCAAAACCGCGACGTCCGTCAATACGTTCAAGGTTGTGGTGTCTAA
将其与传统方法的核苷酸序列及其他相关专利核苷酸序列进行比对，比对结果参阅图1，将其中某些在酵母细胞中使用频率较低的编码密码子替换成在酵母细胞中使用频率较高的编码密码子，与传统人源溶菌酶的核苷酸序列有28.4％差异，但编码的蛋白序列完全一致。然后采取人工合成的方法合成优化的溶菌酶序列，合成的序列如下：
参阅图2及上述序列，虚线框部分为pPIC9K载体上的序列，框中的序列分别为XhoI和EcoRI酶切位点。
(2)合成后的序列通过平端连接克隆至pGH载体中，该质粒记为 pGH-LYC(序列的合成并平端克隆至pGH载体上的工作由上海捷瑞生物工程有限公司)；参阅图3；
(3)用XhoI和EcoRI分别酶切pGH-LYC和pPIC9K，将切下的LYC 片段与pPIC9K通过T4连接酶相连，连接产物转化DH5α感受态细胞。
(4)经菌落PCR鉴定为阳性的克隆，提取质粒，即获得pPIC9K-LYC 质粒；
(5)将pPIC9K-LYC质粒转入宿主细胞，筛选出表达人源溶菌酶蛋白的重组细胞；宿主细胞为带有卡那霉素抗性的酵母细胞，通过遗传霉素筛选，直接获得重组细胞；
(6)高密度培养上述重组细胞；
(7)通过分离出具有人源溶菌酶活性的蛋白，并制成冻干粉；
(8)冻干粉长期保存于-80℃冰箱，短期保存于-20℃冰箱。
重组人源溶菌酶的表达
参阅图4，收集发酵罐上清0-86小时各时间点的发酵样品，通过 SDS-PAGE凝胶电泳检测各时期蛋白表达量，步骤如下：
(A)利用12％的分离胶进行SDS-PAGE进行电泳；
(B)配制12％的分离胶(10mL)；
30％丙烯酰胺溶液 4.0mL
1.5MTris/HCl(Ph8.8) 2.5mL
H2O 3.3mL
10％SDS 0.1mL
10％过硫酸铵 0.1mL
TEMED 8.0μL
混匀，用注射器缓慢在两玻璃板之间加入分离胶溶液，留出浓缩胶的空间(与顶部距离约2.5cm)，以无水乙醇封胶，室温放置使其完全聚合(约 30min)；
(C)倒掉无水乙醇，超净工作台放置10-15min，使其完全挥发；
(D)5％浓缩胶配制(10mL)
30％丙烯酰胺溶液 1.7mL
1MTris/HCl(Ph6.8) 1.25mL
H2O 6.8mL
10％SDS 0.1mL
10％过硫酸铵 0.1mL
TEMED 8.0μL
混匀，用注射器缓慢在两玻璃板之间加入浓缩胶溶液至顶端，小心插入梳子，室温放置使其完全聚合(约30min)；
(E)聚合完全后，轻轻拔出梳子，放入电泳设备，准备点样；
(F)点样：用10μL枪头进行点样，每个样品点2μL；
(G)电泳：额定电压80V30min，待溴酚蓝条带离开浓缩胶时调整额定电压为120V至电泳结束；
(H)染色及脱色：SDS-PAGE电泳结束后，小心取出凝胶，用去离子水清洗3-4遍，加入染色液染色2-3h(30rpm/min)，倒掉染色液，用去离子水漂洗3-4遍，加入脱水液脱色6-8h；
(I)成像：脱色结束后用Bio-rad成像系统成像拍照并保存图片。
(J)结果：Con是溶菌酶阳性对照，上样量1μg，其他为诱导0-86hrhLYC 发酵上清样品，上样量为2μl，M是蛋白分子量marker。
经与对照相比较，86h时表达的溶菌酶上清上样量约为2μl，则换算后的表达量约为1g/L，产量约为2005年公开的序列生产溶菌酶方法的3-4倍。
重组人溶菌酶蛋白活性测定
1、溶壁微球菌制备：
以1:100的比例接种种子菌液至50mL灭菌LB液体培养基中，于30℃摇床中培养18h。经8000g离心5min收集菌体，并采用10mLpH6.240.1mol/L 磷酸盐缓冲液洗涤菌体后再次离心收集菌体，重复洗涤2次，用pH6.240.1 mol/L磷酸盐缓冲液重悬菌体，调节菌体浓度，使450nm处吸光度值为 1.300±0.010。
2、溶菌酶活性测定
使用1cm光径4mL容量的比色皿，吸取2.5mL450nm处吸光度值为 1.300±0.010的菌悬液，并加入0.5mL不同时间点取样的溶菌酶上清液混匀立即计时，于25℃分别记录1min和2min时450nm处吸光度值A1和A2，并计算其差值的绝对值。检测前采用相应的缓冲液调零。酶活性单位定义：在25℃， 0.1mol/L磷酸盐缓冲液(pH6.2)中，以溶壁微球菌为底物，于450nm处每分钟使吸光度值下降0.001时所需的酶量。比活力单位为U/mg或U/mL。
计算公式为：
式中：△E450nm为450nm处每分钟吸光度变化，即∣A1-A2∣；Ew为0.5mL 检测用酶液中含有原始酶液的质量或体积，mg或g或mL；0.001为一个单位在每分钟内使吸光度下降0.001；EA为酶的比活力，单位为U/mg。
3、不同时间点取样的溶菌酶上清的比活力见下表：
时间 24 36 40 44 48 52 56 60
U/mL 34934.28 50465.4 38501.76 63120 53454.6 69126 89643.3 70069.8
时间 64 68 72 76 80 82 84 85
U/mL 88069.8 75608.4 74559.3 99272.7 105272.7 76510.5 108650.4 131265
时间 85.5 86 86.5 87 87.5 88 89 89.5
U/mL 142581.9 161490.9 151854.6 157930.2 167664.6 173035.2 160362 159480
表中数据整合后参阅图5，经分析，诱导后88h活性达到峰值，为 173035U/ml。按1g/L的表达量来算，则其比活为173035U/mg，与传统工艺生产相比有较大的提升。本发明相关序列如下：
序列表
<110> 杭州欧亘生物科技有限公司
<120> 一种人源溶菌酶蛋白生产工艺
<130> 2017.10.20
<141> 2017-10-27
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 393
<212> DNA
<213> Homo sapiens
<400> 1
aaagttttcg aacgttgtga attggccaga actttgaaga gattgggtat ggacggttac 60
cgtggtatct ctttggctaa ctggatgtgt ttggccaagt gggaatctgg ttacaacact 120
agagctacta actacaacgc cggtgaccgt tctactgact acggtatctt ccaaattaac 180
tctagatact ggtgtaacga cggtaagact ccaggcgccg ttaacgcctg tcacttgtct 240
tgttctgctt tgttgcaaga caacatcgct gacgccgttg cctgtgctaa acgcgtcgtt 300
cgtgacccac aaggtatccg cgcttgggtc gcttggcgta accgttgtca aaaccgcgac 360
gtccgtcaat acgttcaagg ttgtggtgtc taa 393
<210> 2
<211> 130
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 2
Lys Val Phe Glu Arg Cys Glu Leu Ala Arg Thr Leu Lys Arg Leu Gly
1 5 10 15
Met Asp Gly Tyr Arg Gly Ile Ser Leu Ala Asn Trp Met Cys Leu Ala
20 25 30
Lys Trp Glu Ser Gly Tyr Asn Thr Arg Ala Thr Asn Tyr Asn Ala Gly
35 40 45
Asp Arg Ser Thr Asp Tyr Gly Ile Phe Gln Ile Asn Ser Arg Tyr Trp
50 55 60
Cys Asn Asp Gly Lys Thr Pro Gly Ala Val Asn Ala Cys His Leu Ser
65 70 75 80
Cys Ser Ala Leu Leu Gln Asp Asn Ile Ala Asp Ala Val Ala Cys Ala
85 90 95
Lys Arg Val Val Arg Asp Pro Gln Gly Ile Arg Ala Trp Val Ala Trp
100 105 110
Arg Asn Arg Cys Gln Asn Arg Asp Val Arg Gln Tyr Val Gln Gly Cys
115 120 125
Gly Val
130

Claims (5)

1.一种人源溶菌酶蛋白生产工艺，其特征在于：生产工艺包括以下步骤：
(1)将Seq ID No:1所示核苷酸序列通过人工合成获得；
(2)合成后的序列通过平端连接克隆至pGH载体中，该质粒记为pGH-LYC；
(3)用Xho I和EcoR I分别酶切pGH-LYC和pPIC9K，将切下的LYC片段与pPIC9K通过T4连接酶相连，连接产物转化DH5α感受态细胞；
(4)经菌落PCR鉴定为阳性的克隆，提取质粒，即获得pPIC9K-LYC质粒；
(5)将pPIC9K-LYC质粒转入宿主细胞，筛选出表达人源溶菌酶蛋白的重组细胞；
(6)高密度培养上述重组细胞，；
(7)通过分离出具有人源溶菌酶活性的蛋白，并制成冻干粉；
(8)冻干粉长期保存于-80℃冰箱，短期保存于-20℃冰箱。
2.如权利要求1所述的一种人源溶菌酶蛋白生产工艺，其特征在于：所述Seq ID No:1为能编码具有人源溶菌酶活性蛋白的DNA分子。
3.如权利要求1所述的一种人源溶菌酶蛋白生产工艺，其特征在于：所述步骤(4)中通过卡那霉素抗性筛选重组细胞。
4.如权利要求1所述的一种人源溶菌酶蛋白生产工艺，其特征在于：所述步骤(5)中的宿主细胞为甲醇酵母。
5.如权利要求4所述的一种人源溶菌酶蛋白生产工艺，其特征在于：所述甲醇酵母为毕赤酵母GS115。
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Cited By (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109628431A (zh) * 2019-01-17 2019-04-16 湖北大学 一种人源溶菌酶编码基因及其在毕赤酵母中表达的方法和应用
CN110903991A (zh) * 2019-11-13 2020-03-24 浙江新银象生物工程有限公司 一种含高拷贝数人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及其应用
CN111206025A (zh) * 2020-02-28 2020-05-29 江南大学 一种比活提高的溶菌酶突变体

Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1325958A (zh) * 2000-05-26 2001-12-12 长春奇龙生物技术研究所 一种生产基因工程重组人溶菌酶的方法
CN1366044A (zh) * 2001-11-30 2002-08-28 复旦大学 一种溶菌酶蛋白生产工艺及其应用
CN101173260A (zh) * 2006-10-31 2008-05-07 刘德虎 高杀菌活力t4溶菌酶在酵母中的表达及生产方法
CN101831451A (zh) * 2010-04-22 2010-09-15 中国农业科学院生物技术研究所 通过重组多型汉逊酵母以组成型方式高效表达和生产t4溶菌酶的方法
CN101831452A (zh) * 2010-04-22 2010-09-15 中国农业科学院生物技术研究所 通过重组瑞氏木霉以诱导型方式高效表达和生产t4溶菌酶的方法
CN102433314A (zh) * 2012-01-10 2012-05-02 江苏大学 一种重组墨吉明对虾溶菌酶及其制备和应用
CN104694559A (zh) * 2015-02-16 2015-06-10 天津生机集团股份有限公司 一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的dna片段及表达方法
CN106148303A (zh) * 2014-11-18 2016-11-23 复旦大学 一种人源溶菌酶蛋白发酵方法

Patent Citations (8)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN1325958A (zh) * 2000-05-26 2001-12-12 长春奇龙生物技术研究所 一种生产基因工程重组人溶菌酶的方法
CN1366044A (zh) * 2001-11-30 2002-08-28 复旦大学 一种溶菌酶蛋白生产工艺及其应用
CN101173260A (zh) * 2006-10-31 2008-05-07 刘德虎 高杀菌活力t4溶菌酶在酵母中的表达及生产方法
CN101831451A (zh) * 2010-04-22 2010-09-15 中国农业科学院生物技术研究所 通过重组多型汉逊酵母以组成型方式高效表达和生产t4溶菌酶的方法
CN101831452A (zh) * 2010-04-22 2010-09-15 中国农业科学院生物技术研究所 通过重组瑞氏木霉以诱导型方式高效表达和生产t4溶菌酶的方法
CN102433314A (zh) * 2012-01-10 2012-05-02 江苏大学 一种重组墨吉明对虾溶菌酶及其制备和应用
CN106148303A (zh) * 2014-11-18 2016-11-23 复旦大学 一种人源溶菌酶蛋白发酵方法
CN104694559A (zh) * 2015-02-16 2015-06-10 天津生机集团股份有限公司 一种利用重组毕赤酵母高效表达鸡蛋清溶菌酶的dna片段及表达方法

Non-Patent Citations (6)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
AASS C等: ""Homo sapiens lysozyme (LYZ), mRNA"", 《GENBANK DATABSE》 *
MURAKI,M.等: ""Synthetic construct gene for human lysozyme, complete cds"", 《GENBANK DATABASE》 *
卫田田等: ""人LYC5 溶菌酶基因在毕赤酵母中的重组表达"", 《中国生物工程杂志》 *
张惠展编著: "《基因工程》", 31 January 2017, 华东理工大学出版社 *
李新新等: ""人源溶菌酶基因LYZL4 在毕赤酵母中的"", 《中国生物工程杂志》 *
王旻主编: "《生物工程》", 31 August 2015, 中国医药科技出版社 *

Cited By (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN109628431A (zh) * 2019-01-17 2019-04-16 湖北大学 一种人源溶菌酶编码基因及其在毕赤酵母中表达的方法和应用
CN109628431B (zh) * 2019-01-17 2022-08-09 湖北大学 一种人源溶菌酶编码基因及其在毕赤酵母中表达的方法和应用
CN110903991A (zh) * 2019-11-13 2020-03-24 浙江新银象生物工程有限公司 一种含高拷贝数人源溶菌酶基因的重组毕赤酵母工程菌及其应用
CN111206025A (zh) * 2020-02-28 2020-05-29 江南大学 一种比活提高的溶菌酶突变体
CN111206025B (zh) * 2020-02-28 2022-02-15 江南大学 一种比活提高的溶菌酶突变体

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