CN106467899B

CN106467899B - 一种高产果糖转移酶的黑曲霉菌株及其应用

Info

Publication number: CN106467899B
Application number: CN201510504595.9A
Authority: CN
Inventors: 王华明; 林艳梅
Original assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Current assignee: Tianjin Institute of Industrial Biotechnology of CAS
Priority date: 2015-08-17
Filing date: 2015-08-17
Publication date: 2020-05-05
Anticipated expiration: 2035-08-17
Also published as: CN106467899A

Abstract

本发明提供了一种黑曲霉突变株，其保藏编号为CCTCC NO:M2015485。本发明通过紫外诱变方法获得的黑曲霉突变菌FTLM，能够高效表达来源于黑曲霉的果糖转移酶，其发酵酶活高达455U/mL，比出发菌株提高了25%。而且，与出发菌株相比，该突变菌株的菌落较小、较密实，产孢子数量多，且菌丝分支多、短，菌丝生长更密集，更适合高密度发酵，能有效降低果糖转移酶的生产成本。

Description

一种高产果糖转移酶的黑曲霉菌株及其应用

技术领域

本发明属于酶基因工程技术和微生物诱变筛选技术领域，具体涉及一种高产果糖转移酶的黑曲霉菌株及其应用。

背景技术

低聚果糖(寡果糖或蔗果三糖族低聚糖)是通过β～1,2 糖苷键在蔗糖的果糖基上连接1～3个果糖基而形成的一系列果糖寡聚体。低聚果糖很难被人体消化道唾液酶和小肠消化酶水解，是一种低热量糖；能预防龋齿；低聚果糖能被双歧杆菌选择利用而促进其生长，增加肠内有益菌的生长，有效抑制有害菌的繁殖，提高免疫力，延缓衰老；低聚果糖还能改善脂质代谢，降低血脂和胆固醇；促进矿物质的吸收；利于维生素合成等作用。被广泛应用于食品、饲料和医药工业，是一种重要的保健型添加剂。

低聚果糖是利用微生物或植物中的果糖转移酶(EC2.4.1.9)催化蔗糖而合成的。植物来源的果糖基转移酶的催化活性比较弱，低聚果糖的产率相对也比较低，并且经常会因为季节而受到限制，而微生物产的果糖转移酶来源方便，不受季节限制，催化活性也比来自于植物中的酶高，并且还具有耐高温，耐高浓度的底物的特点，所以最具有工业生产意义。据文献报道，能够产生果糖转移酶的微生物包括曲霉(Aspergillus sp.)、青霉(Penicillium sp.)、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、节杆菌(Arthrobactersp.)、芽孢杆菌(Bacillus sp.)和酵母菌, 其中工业上应用最广泛的是黑曲霉来源的果糖基转移酶。

目前，低聚果糖生产的主要瓶颈是产率不高(40%～60%)，进而导致生产成本过高，价格居高不下。作为低聚果糖生产过程中的主要用酶，果糖转移酶成本的降低对于低聚果糖生产成本的降低非常关键。因此，如何大幅度提高果糖转移酶的活力成为研究的重点。

发明内容

本发明的目的是提供一种高产果糖转移酶的黑曲霉菌株及其应用。本发明首先构建了重组表达果糖转移酶的黑曲霉工程菌，然后通过紫外诱变的方法获得果糖转移酶表达量显著提升的黑曲霉突变菌，从而弥补现有技术的不足。

本发明一方面涉及一种黑曲霉工程菌，其携带有能表达果糖转移酶的表达载体。

所述果糖转移酶的氨基酸序列为SEQ ID NO：1，其编码核苷酸序列为SEQ ID NO：2。

本发明另一方面涉及一种黑曲霉突变株，为黑曲霉FTLM(Aspergillus nigerFTLM)，已于2015年8月13日保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015485。

本发明还涉及上述黑曲霉突变株在果糖转移酶生产中的应用。

本发明通过紫外诱变方法获得的黑曲霉突变菌FTLM，能够高效表达来源于黑曲霉的果糖转移酶，其发酵酶活高达455U/mL，比出发菌株提高了25%。而且，与出发菌株相比，该突变菌株的菌落较小、较密实，产孢子数量多，且菌丝分支多、短，菌丝生长更密集，更适合高密度发酵，能有效降低果糖转移酶的生产成本。

附图说明

图1为宿主菌黑曲霉G1与重组菌黑曲霉FTL发酵上清液SDS-PAGE电泳分析图，箭头所指处即为重组表达的果糖转移酶；

图2为突变株黑曲霉FTLM与出发菌株FTL菌落形态对比图；

图3为突变株黑曲霉FTLM与出发菌株FTL菌丝形态对比图。

具体实施方式

下面结合实例对本发明的方法做进一步说明。但实例仅限于说明，并不限于此。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常可按常规条件，如J.萨姆布鲁克（Sambrook）等编写的《分子克隆实验指南》中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件运行。

实施例1果糖转移酶基因的克隆

根据NCBI公开的黑曲霉果糖转移酶的氨基酸和DNA序列，设计引物：

上游引物：CCTTAATTAAATGAAGCTTCAAACGGCTTCCGTAC；

下游引物：TGCTCTAGATTAAGACTGACGATCCGGCCAAGCA；

以黑曲霉（Aspergillus niger）G1基因组为模板，利用上述引物进行PCR扩增，PCR条件：98℃ 30s；98℃ 10s，72℃ 60s，30个循环；72℃ 10min；4℃保持。胶回收PCR产物。经测序分析，所述PCR产物的核苷酸序列为SEQ ID NO：2，其编码的氨基酸序列为SEQ ID NO:1，为一种新的果糖转移酶。

实施例2、果糖转移酶基因重组载体的构建

将上述PCR产物用PacⅠ和XbaⅠ双酶切，经琼脂糖凝胶电泳，切胶回收酶切产物片段，与同样用PacⅠ和XbaⅠ双酶切并切胶回收的质粒pGm连接，转化感受态大肠杆菌（E.coli）DH5α后，用氨苄青霉素进行选择。为确保准确，对若干克隆进行测序(Invitrogen)，重组质粒命名为pGm- ftl。

其中的酶切及连接反应均参照表1。

实施例3 转化宿主菌黑曲霉及重组子的筛选鉴定

（1）在装有100ml CMA 培养基的摇瓶中接种新鲜的黑曲霉G1菌株孢子，在30℃、200rpm条件下培养12小时；

（2）将（1）中获得的菌体用4层无菌纱布过滤，先用无菌水冲洗3次，再用溶液 A冲洗3次；

（3）在无菌条件下，将清洗过的菌丝体转移到原生质体溶液中，并在30℃、200rpm温育2小时，显微镜观察监测原生质体化进展；

（4）用无菌Micra-Cloth将原生质体化反应滤入至两个50ml无菌的一次性离心管中，并将每管的体积用溶液B定容至45ml，4000 rpm离心10 min。弃上清；向管中加20 ml 溶液B，混匀，4000 rpm离心5 min，弃上清；再向管中加20 ml溶液B，混匀，4000 rpm离心5min，弃上清；

（5）加100 µl 溶液B重悬原生质体，原生质体的浓度应达到1×10⁷个/100μl。在冰上，将100μl原生质体溶液转移到预冷的15ml管中，每个转化反应一管。以不超过10μl的体积向管中加入10μg 实施例2构建的重组质粒pGm- ftl，并加入12.5 µl 溶液 C，温和混匀并在冰上温育20分钟；

（6）将MMSA上层培养基（每管8ml）熔化并保持在55℃。从冰中移出原生质体，向原生质体中加入1ml溶液C和2ml溶液B，并与一管MMSA上层培养基温和混匀，将混合液分别倒入三个amdS下层培养基平板中30℃恒温培养4-7天；

（7）将长出的转化子转接至admS二次验证培养基平板，30℃恒温培养，并进行菌落PCR验证，获得的阳性转化子经测序鉴定正确。

溶液A（每500ml）— 2.5ml 1M K₂HPO₄; 2.5ml 1M KH₂PO₄;48.156g无水MgSO₄(FW120.37)；加入dlH₂O至终体积500ml，pH 5.5。将溶液过滤灭菌并在室温下保存。

原生质体化溶液—将0.6g的β-D-葡聚糖酶（InterSpex ProductsInc,CA）或者450mgβ-D-葡聚糖酶和150mg Driselase（InterSpex Products，Inc.）溶解于40ml溶液A中，并将溶液过滤灭菌，0.2微米。

溶液B（每500ml）—5ml 1M Tris，pH 7.5；2.77g CaCl₂（FW 110.99）；109.32g山梨醇（FW 182.2；1.2 M）；加入dlH₂O至终体积500ml。将此溶液过滤灭菌并在室温下保存。

溶液C（每500mL）—250g PEG4000；2.77g CaCl₂；5ml 1M Tris，pH7.5；加入dlH₂O至终体积500ml。将此溶液过滤灭菌。

MMSA琼脂—将0.59g/L乙酰胺；3.4g/L CsCl；0.52g/L KCl；1.52g/L KH₂PO₄；218.5g/L D-山梨醇；1ml/L 痕量元素；10g/L琼脂（顶层琼脂中的低熔点琼脂糖）溶解于1LdlH₂O，高压灭菌。灭菌后，在无菌条件下加入10ml 50%葡萄糖和1.25ml 20% MgSO₄·7H₂O。

CMA（1升）= 20g无水葡萄糖；20g麦芽膏（Difco Brand Malt Extract），1g蛋白胨（Bacto Peptone）；20g琼脂（Bacto Agar）

实施例4 酶活检测与酶解产物分析

4.1 酶活检测

将实施例3获得的阳性转化子分别接种于液体发酵培养基中，30℃、200 rpm摇床培养5天，离心，取发酵上清液；分别进行果糖转移酶酶活检测。申请人将其中酶活水平最高的一个阳性转化子命名为黑曲霉FTL（Aspergillus niger FTL），并对其发酵上清液进行SDS-PAGE电泳检测。电泳结果如图1所示，箭头所指处的蛋白条带即为重组表达的果糖转移酶。

酶活测定方法：

取适当稀释的0.5ml发酵上清液与25%的蔗糖溶液（用pH5.0, 0.1M磷酸-柠檬酸盐缓冲液配制）2ml混合均匀，45℃下酶解1h，100℃煮沸15min终止酶解反应。果糖基转移酶活通过测定酶解过程中所释放出的葡萄糖（G）和还原糖（R）含量，按照下式计算酶解过程中所产生的果糖量（F）和被转移的果糖（F′）量。

F=R-G

F′=G-F=2G-R

在相同条件下，以加入失活酶液的蔗糖溶液作为对照。在上述条件下，以每分钟转移1μmol果糖所需的酶量为一个果糖转移酶活力单位。

4.2酶解产物分析

取适当稀释的黑曲霉FTL发酵上清液0.5ml与25%的蔗糖溶液（用pH5.0, 0.1M磷酸-柠檬酸盐缓冲液配制）2ml混合均匀，45℃下酶解1h，100℃煮沸15min终止酶解反应。取适量反应混合物进行产物HPLC分析。结果表明，黑曲霉FTL反应液中蔗糖含量大幅下降，蔗果三糖、蔗果四糖、葡萄糖和果糖的含量明显增加，且产物中首先出现的是蔗果四糖(GF3)，然后依次是蔗果三糖(GF2)，葡萄糖和果糖。上述结果表明本发明构建的黑曲霉FTL重组表达的果糖转移酶能将大部分蔗糖转化为低聚果糖、葡萄糖和果糖。

实施例5 出发菌株黑曲霉FTL的紫外诱变与筛选

以黑曲霉FTL作为出发菌株进行紫外诱变与筛选。

紫外诱变方法：

1、孢子悬液的制备：将黑曲霉FTL接种至斜面CMA培养基（20 g葡萄糖，20 g麦芽浸出物，1 g蛋白胨，15 g琼脂，加入dlH2O至终体积1000 mL，高压蒸气灭菌），30℃培养5d。加10mL的无菌生理盐水，将孢子洗下，通过带脱脂棉的漏斗过滤，置于装有玻璃珠的灭菌三角瓶中，震荡均匀，制成单孢子悬液，在光学显微镜下用血球计数仪计数后用无菌生理盐水将孢子悬液稀释到10⁶个/mL，即为待诱变处理的孢子悬液；

2、预热紫外灯30min；将10mL孢子悬液倒入无菌平皿(直径9cm)中，并将平皿置于距离44w紫外灯18cm的紫外诱变箱中；

3、紫外灯预热后，开始紫外诱变，打开皿盖，计时；在 0min，5min，10min，20min，30min分别吸取100μL孢子悬液，做系列梯度稀释；

4、诱变结束后，关闭紫外灯，利用红光灯源而非白光灯以避免光修复；将上述各点取出的孢子悬液做梯度稀释；每个稀释度取出100μL涂布筛选平板，在30℃培养箱中避光培养，每个样品做三个平行；

5、紫外诱变结果观察:

培养36小时后，观察菌落形态，并进行菌落计数，计算紫外诱变致死率。计算公式如下:

各个诱变时间平板上的菌落数按照三个平板的平均值来计算。

选择致死率在95%以上的时间点进行紫外诱变，诱变后用显微镜观察诱变菌的菌丝形态，选择菌丝多分支的菌落，分别划线接种于CMA固体培养基平板，待其长出黑色孢子后，用无菌水洗下，再接种于TSB发酵培养基中，发酵5天后，分别检测各株突变菌发酵上清液中的果糖转移酶酶活。将发酵酶活水平最高的一株突变菌命名为黑曲霉FTLM（Aspergillus niger FTLM）。

在相同的培养条件下，突变菌FTLM的菌落比出发菌更小、更密实（图2）；显微镜下观察发现，突变菌FTLM菌丝的分支多且短，菌丝生长更密集（图3），比出发菌更适合高密度发酵生产。

将宿主黑曲霉G1、出发菌株黑曲霉FTL和突变菌株FTLM的孢子悬浮液分别接种于25 mL TSB发酵培养基中，在30℃，200 rpm的条件下培养5d；所得发酵液用8层纱布过滤，滤液在14000×g条件下离心10 min，收集上清液；分别对上清液进行酶活测定。

酶活测定结果显示，在pH5.0，45℃条件下，出发菌株黑曲霉FTL的发酵上清液酶活仅为364U/mL，而所述突变菌株FTLM的酶活高达455U/mL，比出发菌提高了25%，而作为对照的宿主黑曲霉G1发酵上清液中果糖转移酶酶活力仅为15U/ml。从而说明，本发明通过紫外诱变获得的突变菌黑曲霉FTLM能高效重组表达果糖转移酶，且发酵酶活比出发菌提高了25%，取得了显著的技术进步。

申请人已于2015年8月13日将上述突变菌黑曲霉FTLM(Aspergillus niger FTLM)保藏于中国武汉武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2015485。

实施例6 果糖转移酶的应用实例

本发明所述黑曲霉突变菌FTLM重组表达的果糖转移酶可广泛应用于食品工业。采用上述果糖基转移酶催化底物蔗糖(700g/L)，45℃条件催化处理12h，采用HPLC 测定反应体系中低聚果糖的浓度。通过测定分析计算，确定低聚果糖的含量可达80％(w/w)。

SEQUENCE LISTING

<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所

<120> 一种高产果糖转移酶的黑曲霉菌株及其应用

<130>

<160> 2

<170> PatentIn version 3.5

<210> 1

<211> 628

<212> PRT

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 1

Met Lys Leu Gln Thr Ala Ser Val Leu Leu Gly Ser Ala Ala Ala Ala

1 5 10 15

Ser Pro Ser Met Gln Thr Arg Ala Ser Val Val Ile Asp Tyr Asn Val

20 25 30

Ala Pro Pro Asn Leu Ser Thr Leu Pro Asn Gly Ser Leu Phe Glu Thr

35 40 45

Trp Arg Pro Arg Ala His Val Leu Pro Pro Asn Gly Gln Ile Gly Asp

50 55 60

Pro Cys Leu His Tyr Thr Asp Pro Ser Thr Gly Leu Phe His Val Gly

65 70 75 80

Phe Leu His Asp Gly Ser Gly Ile Ser Ser Ala Thr Thr Asp Asp Leu

85 90 95

Ala Thr Tyr Lys Asp Leu Asn Gln Gly Asn Gln Val Ile Val Pro Gly

100 105 110

Gly Ile Asn Asp Pro Val Ala Val Phe Asp Gly Ser Val Ile Pro Ser

115 120 125

Gly Ile Asn Gly Leu Pro Thr Leu Leu Tyr Thr Ser Val Ser Phe Leu

130 135 140

Pro Ile His Trp Ser Ile Pro Tyr Thr Arg Gly Ser Glu Thr Gln Ser

145 150 155 160

Leu Ala Val Ser Ser Asp Gly Gly Ser Asn Phe Thr Lys Leu Asp Gln

165 170 175

Gly Pro Val Ile Pro Gly Pro Pro Phe Ala Tyr Asn Val Thr Ala Phe

180 185 190

Arg Asp Pro Tyr Val Phe Gln Asn Pro Thr Leu Asp Ser Leu Leu His

195 200 205

Ser Lys Asn Asn Thr Trp Tyr Thr Val Ile Ser Gly Gly Leu His Gly

210 215 220

Lys Gly Pro Ala Gln Phe Leu Tyr Arg Gln Tyr Asp Pro Asp Phe Gln

225 230 235 240

Tyr Trp Glu Phe Leu Gly Gln Trp Trp His Glu Pro Thr Asn Ser Thr

245 250 255

Trp Gly Asn Gly Thr Trp Ala Gly Arg Trp Ala Phe Asn Phe Glu Thr

260 265 270

Gly Asn Val Phe Ser Leu Asp Glu Tyr Gly Tyr Asn Pro His Gly Gln

275 280 285

Ile Phe Ser Thr Ile Gly Thr Glu Gly Ser Asp Gln Pro Val Val Pro

290 295 300

Gln Leu Thr Ser Ile His Asp Met Leu Trp Val Ser Gly Asn Val Ser

305 310 315 320

Arg Asn Gly Ser Val Ser Phe Thr Pro Asn Met Ala Gly Phe Leu Asp

325 330 335

Trp Gly Phe Ser Ser Tyr Ala Ala Ala Gly Lys Val Leu Pro Ser Thr

340 345 350

Ser Leu Pro Ser Thr Lys Ser Gly Ala Pro Asp Arg Phe Ile Ser Tyr

355 360 365

Val Trp Leu Ser Gly Asp Leu Phe Glu Gln Ala Glu Gly Phe Pro Thr

370 375 380

Asn Gln Gln Asn Trp Thr Gly Thr Leu Leu Leu Pro Arg Glu Leu Arg

385 390 395 400

Val Leu Tyr Ile Pro Asn Val Val Asp Asn Ala Leu Ala Arg Glu Ser

405 410 415

Gly Ala Ser Trp Gln Val Val Ser Ser Asp Ser Ser Ala Gly Thr Val

420 425 430

Glu Leu Gln Thr Leu Gly Ile Ser Ile Ala Arg Glu Thr Lys Ala Ala

435 440 445

Leu Leu Ser Gly Thr Ser Phe Thr Glu Ser Asp Arg Thr Leu Asn Ser

450 455 460

Ser Gly Val Val Pro Phe Lys Arg Ser Pro Ser Glu Lys Phe Phe Val

465 470 475 480

Leu Ser Ala Gln Leu Ser Phe Pro Ala Ser Ala Arg Gly Ser Gly Leu

485 490 495

Lys Ser Gly Phe Gln Ile Leu Ser Ser Glu Leu Glu Ser Thr Thr Val

500 505 510

Tyr Tyr Gln Phe Ser Asn Glu Ser Ile Ile Val Asp Arg Ser Asn Thr

515 520 525

Ser Ala Ala Ala Arg Thr Thr Asp Gly Ile Asp Ser Ser Ala Glu Ala

530 535 540

Gly Lys Leu Arg Leu Phe Asp Val Leu Asn Gly Gly Glu Gln Ala Ile

545 550 555 560

Glu Thr Leu Asp Leu Thr Leu Val Val Asp Asn Ser Val Leu Glu Ile

565 570 575

Tyr Ala Asn Gly Arg Phe Ala Leu Ser Thr Trp Val Arg Ser Trp Tyr

580 585 590

Ala Asn Ser Thr Asn Ile Ser Phe Phe Gln Asn Gly Val Gly Gly Val

595 600 605

Ala Phe Ser Asn Val Thr Val Ser Glu Gly Leu Tyr Asp Ala Trp Pro

610 615 620

Asp Arg Gln Ser

625

<210> 2

<211> 1887

<212> DNA

<213> 黑曲霉（Aspergillus niger）

<400> 2

atgaagcttc aaacggcttc cgtactgctc ggcagtgctg ctgctgcctc gccttccatg 60

cagacgcggg cctccgttgt catcgactac aatgtcgcac ctccaaacct atccactctg 120

cccaatggct ccctcttcga aacatggcgt ccccgcgccc acgtcctgcc ccccaacggc 180

cagatcggtg acccctgcct gcattacacc gatccctcca cgggcctctt ccacgtcggc 240

ttccttcacg atggcagcgg catctccagc gccaccactg atgatctagc cacctacaag 300

gacctcaacc aaggcaacca agtcattgtt cccgggggta tcaacgaccc cgtcgccgtc 360

ttcgatggct ccgtcatccc cagcggcatc aacggcctcc ccactctcct ctacacctcc 420

gtctccttcc ttcccatcca ctggtccatc ccctacaccc gcggcagtga gacccaatcc 480

ctcgctgtct cctcggatgg cggcagcaac ttcaccaagc tcgaccaggg ccccgtcatc 540

cctggccctc ccttcgccta caacgtcacc gcattccggg acccctacgt cttccaaaac 600

cccaccctcg actccctcct gcacagcaag aacaacacct ggtataccgt catctccggt 660

ggtctgcacg gcaagggccc cgcccagttc ctctaccgcc agtacgaccc ggacttccag 720

tactgggagt tcctcggcca atggtggcac gagcccacca actccacttg gggtaacggc 780

acctgggccg gccgatgggc cttcaacttc gagaccggca acgtcttcag tctcgacgag 840

tacggataca acccccacgg ccagatcttc tccacgatcg gcaccgaggg ctctgaccag 900

cccgtcgtgc cccagctcac cagcatccac gacatgctct gggtgtccgg caacgtctct 960

cgcaatggct ctgtctcgtt caccccgaac atggcgggct tcctcgactg gggcttctcc 1020

tcttacgcag ctgccggaaa ggtcctcccc tcgacttctc tgccctcgac gaagagcggc 1080

gccccggacc gcttcatctc gtacgtctgg ctgtccggtg acctgttcga acaggccgaa 1140

gggttcccca cgaaccagca gaattggacc ggtacgctgt tgcttccgcg agagttgcgc 1200

gtgctgtata tccccaatgt ggtggacaat gctctggctc gggaatctgg tgcctcgtgg 1260

caggtcgtga gcagcgatag cagtgcgggc accgtggagc tgcagacact gggtatctcc 1320

attgcccggg aaaccaaggc cgccttgctg tcgggaacgt cgttcaccga gtccgaccgt 1380

actctgaaca gcagtggtgt tgtgccgttc aagcgctccc cgtccgagaa gttctttgtt 1440

ttgtccgcgc agctgtcctt ccctgcttcg gctaggggat cgggactcaa aagtggattc 1500

cagatcctct cgtcggagct ggaaagcacc actgtctact accagttctc gaatgagtcg 1560

attattgtcg accgcagtaa caccagtgct gcggcgcgta ccacggatgg tatcgatagc 1620

agtgcggagg ctggcaagtt gcgcctgttt gacgtgttga atggcggaga gcaggcgatt 1680

gagacgttgg atttgactct cgtggtggat aactcggtat tggagatcta tgccaatggt 1740

cggtttgcgt tgagtacttg ggttcgttct tggtacgcca attccacgaa catcagtttc 1800

ttccagaatg gcgtgggtgg tgttgcgttc tccaacgtga ccgtttccga gggcttgtat 1860

gatgcttggc cggatcgtca gtcttaa 1887

Claims

1.一种黑曲霉 (Aspergillus niger) 突变株 FTLM，其特征在于，所述的黑曲霉突变株的保藏编号为CCTCC NO：M2015485。

2.权利要求1所述的黑曲霉突变株FTLM 在果糖转移酶生产中的应用。