CN104130950A - 一株黑曲霉及其培养方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株黑曲霉及其培养方法与应用。黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02，2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.9449，本发明还涉及该黑曲霉的培养方法与应用。

Description

一株黑曲霉及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及一株黑曲霉及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
黑曲霉，半知菌亚门，丝孢纲，丝孢目，丛梗孢科，曲霉属真菌中的一个常见种。广泛分布于世界各地的粮食、植物性产品和土壤中。是重要的发酵工业菌种，可生产淀粉酶、酸性蛋白酶、纤维素酶、果胶酶、葡萄糖氧化酶、柠檬酸、葡糖酸和没食子酸等。有的菌株还可将羟基孕甾酮转化为雄烯。生长适温37℃，最低相对湿度为88％，能引致水分较高的粮食霉变和其他工业器材霉变。
低聚果糖是指2～5个果糖基为链节，以一个葡萄糖基为链的端基，以果糖基→果糖连接键为主体骨架连结形成的碳水化合物。低聚果糖是一种天然活性物质。甜度为蔗糖的0.3-0.6倍。既保持了蔗糖的纯正甜味性质，又比蔗糖甜味清爽。是具有调节肠道菌群，增殖双歧杆菌，促进钙的吸收，调节血脂，免疫调节，抗龋齿等保健功能的新型甜味剂，被誉为继抗生素时代后最具潜力的新一代添加剂——促生物质。
当前国内外生产低聚果糖的方法主要是菌种发酵法和酶转化法，菌种发酵法是指用产β-果糖基转移酶的菌种直接发酵蔗糖溶液生产低聚果糖，该方法的缺点是生产的低聚果糖纯度不高，后续提纯困难。酶转化法是指先培养产酶菌种，然后提取β-果糖基转移酶进行酶转化生产低聚果糖，该方法目前存在的问题是提取的酶活较低，转化过程中受到反应中高含量的副产物葡萄糖的影响造成转化率低，生产成本高居不下。
因此，寻找一种高酶活性的β-果糖基转移酶成为解决低聚果糖生产瓶颈的关键。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株黑曲霉及其培养方法与应用。
本发明另一个目的是提供该黑曲霉菌株在生产低聚果糖中的应用，由于该菌株所产β-果糖基转移酶具有高转化蔗糖成低聚果糖的能力，可显著降低生产成本。
本发明的技术方案如下：
一株黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02，2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.9449，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明所述黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02的原始菌株分离于山东德州百龙创园低聚果糖生产车间附近的土壤，并经过诱变后，获得。该菌株呈黑褐色，直径15～20pm，长约1～3mm，壁厚而光滑。顶部形成球形顶囊，其上全面覆盖一层梗基和一层小梗，小梗上长有成串褐黑色的球状,直径2.5～4.0μm。分生孢子头球状，直径700～800μm，褐黑色。蔓延迅速，初为白色，后变成鲜黄色直至黑色厚绒状,背面无色或中央略带黄褐色。分生孢子头褐黑色放射状，分生孢子梗长短不一。该菌株可高产β-果糖基转移酶，经培养发酵后该酶酶活可达到1000U/ml，相对于传统β-果糖基转移酶活力提高30％以上，同时还具有耐葡萄糖的特性，应用于低聚果糖生产中可大大提高蔗糖转化成低聚果糖的能力，显著降低生产成本。
上述黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02的培养方法，步骤如下：
(1)取黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02接种于固体培养基中，在30～38℃的条件下，活化培养20～30h，制得活化菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在30～38℃的条件下，增殖培养20～30h，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比1～10％的比例接种于发酵培养基中，在30～38℃，扩大培养20～35h，即得菌体发酵液。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的种子培养基组分如下，均为重量百分比：
硝酸钠0.3％；磷酸氢二钾0.1％；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％；酵母膏1％；蔗糖5％，余量水，pH为4.0～6.0；
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖10％，酵母膏1％，硝酸钠0.3％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％，余量水。
所述步骤(1)中的固体培养基为本领域常规固体培养基，如PDA培养基等。
上述黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02在制备β-果糖基转移酶中的应用。
上述应用，步骤如下：
(a)取上述制备的菌体发酵液经固液分离，洗涤菌体，合并分离液及洗涤液，制得粗酶液；
(b)将步骤(a)制得的粗酶液置于40～50℃水浴中热变性50～70min，固液分离，取上清液，加入固体硫酸铵，使溶液达到40％的硫酸铵饱和度，冷藏静止2h，固液分离，取上清液，再加入固体硫酸铵，使溶液达到90％的硫酸铵饱和度，冷藏静止2h，固液分离，取沉淀，溶解于pH 7.8、0.05mol/L的磷酸盐缓冲中，经DEAE-纤维素阴离子交换柱层析，收集洗脱液，经超低温真空浓缩，制得β-果糖基转移酶。
根据本发明优选的，所述步骤(a)的洗涤菌体为采用pH 7.0、浓度50mmol/L的磷酸缓冲液重悬，然后经固液分离，取液体，制得洗涤液。
根据本发明优选的，所述步骤(a)、(b)中的固液分离均为在4℃、10000r/min条件下，离心60min。
上述制备的β-果糖基转移酶在制备低聚果糖中的应用。
有益效果
1.本发明从土壤中分离出黑曲霉菌种，在经过紫外诱变、亚硝基胍诱变处理等诱变处理技术，最后获得高产β-果糖基转移酶的高产菌株命名为BLCY-02，其酶活达到1000U/ml，相对于传统β-果糖基转移酶活力提高30％以上，同时还具有耐葡萄糖的特性，应用于低聚果糖生产中可大大提高蔗糖转化成低聚果糖的能力，显著降低生产成本。
2.本发明摈弃了传统的黑曲霉菌种直接发酵蔗糖溶液生产低聚果糖的方法，通过简便的提纯步骤，就可以获得β-果糖基转移酶，极大地降低后续低聚果糖提纯的难度和成本，并显著提高低聚果糖成品的质量。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。
实施例1
一株黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02，2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.9449，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
上述黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02的筛选过程如下：
(1)富集培养
选取山东德州百龙创园低聚果糖生产车间附近的土壤，用小铲子除去表土，取离地面5-15cm处的土壤约10g，用无菌水稀释10倍，加入察氏培养基进行富集培养，察氏培养基成分：硝酸钠0.3％；磷酸氢二钾0.1％；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％；氯化钾0.05％；硫酸亚铁0.001％；蔗糖3％；pH为6.0；培养温度为28-32℃，培养28h。
(2)纯种分离
采用划线分离法，取一支盛有5ml无菌水的大试管，取步骤(1)中富集培养后的菌液2ml放入其中稀释，充分振荡分散，用接种环以无菌操作挑取稀释液一环先在平板培养基一边做第一次平行划线3-4条，再转动培养皿约60度角，将接种环上剩余物烧掉，待冷却后同一次划线方法做第二次划线，同法依次做第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，将培养皿倒置，28-32℃培养28h后，挑取单个菌落接种于10个斜面培养基上，分别编号01-10。
将01-10斜面种子接种于摇瓶培养基中培养28-32℃培养28h，对01-10摇瓶发酵液β-果糖基转移酶酶活进行测定，06号摇瓶酶活最高，达到655U/ml。
平板培养基成分：硝酸钠0.3％；磷酸氢二钾0.1％；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％；氯化钾0.05％；硫酸亚铁0.001％；蔗糖3％；琼脂2％，pH为4.0-6.0；
摇瓶培养基成分：硝酸钠0.3％；磷酸氢二钾0.1％；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％；酵母膏0.5％；蔗糖5％，pH为4.0-6.0；
(3)诱变筛选
对06号菌种进行紫外线诱变，紫外线诱变采用15W紫外线灯20cm照射，照射时间为120s，得到的高产菌种再进行亚硝基胍诱变处理，最终得到高产β-果糖基转移酶的高产菌株命名为BLCY-02，其酶活达到1000U/ml。
酶活测定用pH 5.5、50mmol/L Na2HPO4-NaH2PO4缓冲溶液配制，10％(w/v，单位g/ml)的蔗糖溶液作底物，加入适量的酶液(控制三糖最终生成量10％)，40℃水浴振荡反应40min后,立即于100℃沸水浴中15min，终止反应，离心，取上清液测定各糖组分含量。
酶活定义如下：在上述反应条件下，每分钟产生1μmol蔗果三糖所需酶量为转移酶1个活力单位(U)。
实施例2
实施例1所述的黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02的培养方法，步骤如下：
(1)取黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02接种于PDA培养基中，在30℃的条件下，活化培养30h，制得活化菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在30℃的条件下，增殖培养30h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
硝酸钠0.3％；磷酸氢二钾0.1％；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％；酵母膏1％；蔗糖5％，余量水，pH为6.0；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比1％的比例接种于发酵培养基中，在30℃，扩大培养35h，即得菌体发酵液；
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖10％，酵母膏1％，硝酸钠0.3％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％，余量水。
经检测，上述制得的菌体发酵液的菌体浓度为6.0×109cfu/ml。
实施例3
实施例1所述的黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02的培养方法，步骤如下：
(1)取黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02接种于PDA培养基中，在38℃的条件下，活化培养20h，制得活化菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在38℃的条件下，增殖培养20h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
硝酸钠0.3％；磷酸氢二钾0.1％；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％；酵母膏1％；蔗糖5％，余量水，pH为4.0；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比10％的比例接种于发酵培养基中，在38℃，扩大培养20h，即得菌体发酵液；
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖10％，酵母膏1％，硝酸钠0.3％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％，余量水。
经检测，上述制得的菌体发酵液的菌体浓度为5.0×109cfu/ml。
实施例4
实施例1所述的黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02的培养方法，步骤如下：
(1)取黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02接种于PDA培养基中，在35℃的条件下，活化培养25h，制得活化菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在35℃的条件下，增殖培养25h，制得种子液；
所述种子培养基组分如下，均为重量百分比：
硝酸钠0.3％；磷酸氢二钾0.1％；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％；酵母膏1％；蔗糖5％，余量水，pH为5.0；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比5％的比例接种于发酵培养基中，在35℃，扩大培养30h，即得菌体发酵液；
所述发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖10％，酵母膏1％，硝酸钠0.3％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％，余量水。
经检测，上述制得的菌体发酵液的菌体浓度为5.5×109cfu/ml。
实施例5
黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02在制备β-果糖基转移酶中的应用。
上述应用，步骤如下：
(a)分别取实施例2～4制备的菌体发酵液经4℃、10000r/min条件下离心60min，收集分离液，沉淀为菌体，用pH 7.0、浓度50mmol/L的磷酸缓冲液重悬，经4℃、10000r/min条件下离心60min，收集洗涤液，合并分离液及洗涤液，制得粗酶液；
(b)将步骤(a)制得的粗酶液置于45℃水浴中热变性60min，经4℃、10000r/min条件下离心60min，取上清液，加入固体硫酸铵，使溶液达到40％的硫酸铵饱和度，冷藏静止2h，经4℃、10000r/min条件下离心60min，取上清液，再加入固体硫酸铵，使溶液达到90％的硫酸铵饱和度，冷藏静止2h，经4℃、10000r/min条件下离心60min，取沉淀，溶解于pH7.8、0.05mol/L的磷酸盐缓冲中，经DEAE-纤维素阴离子交换柱层析，收集洗脱液，经超低温真空浓缩，制得β-果糖基转移酶。
经检测，实施例2中每毫升发酵液能够产生7500μgβ-果糖基转移酶，实施例3中每毫升发酵液能够产生6800ugβ-果糖基转移酶，实施例4中每毫升发酵液能够产生7100μgβ-果糖基转移酶。
将上述β-果糖基转移酶配制成浓度为20000μg/ml的β-果糖基转移酶溶液，经检测，酶活达到1000U/ml；
在相同浓度条件下检测06号黑曲霉原始菌株所产β-果糖基转移酶，酶活为655U/ml。
由上述结果可以看出本申请所述黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02菌株所产β-果糖基转移酶酶活远高于原始出发菌株。

Claims (9)

1.一株黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02，2014年07月15日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号CGMCC No.9449，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02的培养方法，其特征在于，步骤如下：
(1)取黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02接种于固体培养基中，在30～38℃的条件下，活化培养20～30h，制得活化菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在30～38℃的条件下，增殖培养20～30h，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比1～10％的比例接种于发酵培养基中，在30～38℃，扩大培养20～35h，即得菌体发酵液。
3.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的种子培养基组分如下，均为重量百分比：
硝酸钠0.3％；磷酸氢二钾0.1％；硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％；酵母膏1％；蔗糖5％，余量水，pH为4.0～6.0。
4.如权利要求2所述的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中的发酵培养基组分如下，均为重量百分比：
蔗糖10％，酵母膏1％，硝酸钠0.3％，硫酸镁(MgSO4·7H2O)0.05％，余量水。
5.权利要求1所述黑曲霉(Aspergillus niger)BLCY-02在制备β-果糖基转移酶中的应用。
6.如权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤如下：
(a)取上述制备的菌体发酵液经固液分离，洗涤菌体，合并分离液及洗涤液，制得粗酶液；
(b)将步骤(a)制得的粗酶液置于40～50℃水浴中热变性50～70min，固液分离，取上清液，加入固体硫酸铵，使溶液达到40％的硫酸铵饱和度，冷藏静止2h，固液分离，取上清液，再加入固体硫酸铵，使溶液达到90％的硫酸铵饱和度，冷藏静止2h，固液分离，取沉淀，溶解于pH 7.8、0.05mol/L的磷酸盐缓冲中，经DEAE-纤维素阴离子交换柱层析，收集洗脱液，经超低温真空浓缩，制得β-果糖基转移酶。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(a)的洗涤菌体为采用pH 7.0、浓度50mmol/L的磷酸缓冲液重悬，然后经固液分离，取液体，制得洗涤液。
8.如权利要求6所述的应用，其特征在于，所述步骤(a)、(b)中的固液分离均为在4℃、10000r/min条件下，离心60min。
9.权利要求5制备的β-果糖基转移酶在制备低聚果糖中的应用。
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