CN110564629A - 一株里氏木霉及其培养方法与应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一株里氏木霉及其培养方法与应用，该里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY‑007，2019年6月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.17970，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。本发明首次获得的高产木聚糖酶的里氏木霉BLCY‑007，其发酵液中的木聚糖酶酶活可达到508U/ml，较传统木聚糖酶活提高60％以上，显著降低生产成本，最适pH值为5.0～6.0，有利于生产中对污染的控制。

Description

一株里氏木霉及其培养方法与应用
技术领域
本发明涉及一株里氏木霉菌种及其培养方法与应用，属于微生物技术领域。
背景技术
随着经济社会的高速发展，人们对食品的营养和功能的认识逐步提高，更加重视通过改善膳食条件和发挥食品本身的生理调节功能来达到提高自身健康的目的。低聚糖(oligosaccharides)，又称寡糖，是由2～10个单糖经糖苷键连接而成的直链或支链低度聚合糖的总称，分子量约为300～2000，具有特殊的生物学功能，特别是能促进肠内双歧杆菌的增殖，有益于人体肠道健康，其中功效最好的是低聚木糖。它的功效性是其他聚合糖类的近20倍，人体肠胃道内没有水解低聚木糖的酶，所以其可直接进入大肠内优先为双歧杆菌所利用，促进双歧杆菌增殖同时产生多种有机酸。降低肠道PH值，抑制有害菌生长，使益生菌在肠道大量增殖，达到上述的保健功效，这就是低聚木糖的保健奥秘所在。
低聚木糖也称木寡糖，由2～7个D-木糖以β-1，4-木糖苷键结合而成，部分还含有阿拉伯糖、葡萄糖醛酸等侧链。它是从玉米芯、棉籽売、甘蔗渣等天然食物纤维中采用木聚糖酶糖化分解半纤维素制取的一种低聚糖。因此，获得高效的木聚糖酶是制备低聚木糖的关键。中国专利文件CN105154412A公开了一种从银耳废菌包中提取木聚糖酶的方法，其属于生物发酵工程领域，具体是将银耳废菌包加水提取后，利用硫酸铵对提取液进行盐析，再经透析除盐后利用DEAE-纤维素柱层析进行纯化，得木聚糖酶。但是，该专利木聚糖酶提取、分离与纯化工艺复杂，不利于大规模工业化生产。
此外，通过微生物生产木聚糖酶也是一种高效的方式。例如：真菌里的青霉菌Pol6(Penicillium occitanis Pol6)和黑曲霉BCC14405(Aspergillus niger BCC14405)在生产木聚糖酶方面具有明显的产量优势，但是其在产木聚糖过程中常常会伴随着毒素的产生，使木聚糖酶在应用上具有一定的隐患。许多木霉当中也能高效的产生木聚糖酶，例如：专利文件IN201741043810A公开了一株新的木霉菌株GAMSII M501，保藏号为:CGMCC No.5，保藏号为CGMCC No.5。用于生产含有较高活性纤维素酶和木聚糖酶的酶混合物的MTCC25104。包括以下步骤:a)培养具有保藏号的新型天然菌株T.gamsii M501的细胞。MTCC25104在添加1％微晶纤维素并调节pH至5.5的改性VogelTM S培养基中，b)在约28℃的温度下培养细胞3天以获得培养物，c)从含有纤维素酶和木聚糖酶的培养物中获得培养上清液。T.gamsiii新菌株产生的FPase，CMCase和木聚糖酶的最大水平分别为2.0U/ml，45.3U/ml和600U/ml。得到的酶混合物可用于碱预处理的木质纤维素生物质的水解。但是，该菌株得到的酶为混合物。无法直接应用到低聚木糖的生产当中。
发明内容
本发明针对现有技术的不足，提供一株里氏木霉及其培养方法与应用。该里氏木霉具有高糖化分解半纤维素制备低聚木糖的能力，可显著降低生产成本。
本发明的技术方案如下：
一株里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007，2019年6月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.17970，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
本发明所述里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007的原始菌株分离于山东德州百龙创园研发中试车间附近的土壤，并经过突变剂或紫外线照射等诱变后获得。该菌株菌落呈广铺的棉絮状，起初为白色致密的平坦菌丝，而后边缘出现浅绿的产孢子丛束区，反面无色。分生孢子梗菌丝的短侧枝，透明，多分枝；小梗瓶形，中部弯曲；分生孢子椭圆形或长形，单细胞，透明，无色，壁光滑，成堆时绿色。
该菌株可高产木聚糖酶，产生的木聚糖酶为胞外酶，经简单的离心、洗涤即可得到酶制剂，该酶酶活达到508U/ml，最适pH值为5.5～6.5，较传统木聚糖酶酶活提高60％以上，可以显著降低低聚木糖的生产成本。
上述里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007的培养方法，包括步骤如下：
(1)取里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007接种于PDA培养基中，在24℃～28℃的条件下，活化培养12～24h，制得活化菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在24℃～28℃的条件下，增殖培养24～36h，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比1～10％的比例接种于发酵培养基中，在24℃～28℃，扩大培养24～36h，即得菌体发酵液。
根据本发明优选的，所述步骤(2)中的种子培养基原料组分如下：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g。将上述组分混合后加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L。
根据本发明优选的，所述步骤(3)中的发酵培养基原料组分如下，均为重量百分比：
玉米芯25％，葡萄糖4％，牛肉膏6％，蛋白陈1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸氢二钾0.02％，硫酸铵0.02％，余量水，pH＝5.0～6.0。
根据本发明优选的，所述步骤(1)中的PDA培养基原料组分如下：
马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g。
马铃薯提取液按如下方法制备：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L。
上述里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007在制备木聚糖酶中的应用。
优选的，应用步骤如下：
取上述制备的菌体发酵液经离心分离，洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，即为木聚糖酶粗酶制剂。
根据本发明优选的，上述洗涤菌体采用pH＝8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后经离心分离，保留沉淀，制得粗酶制剂。
根据本发明优选的，上述离心分离均为在4℃、10000r/min条件下，离心10min。
上述制备的木聚糖酶在制备低聚木糖中的应用。
本发明的有益效果
1、本发明首次获得的高产木聚糖酶的里氏木霉BLCY-007，其发酵液中的木聚糖酶酶活可达到508U/ml，较传统木聚糖酶活提高60％以上，显著降低生产成本，最适pH值为5.0～6.0，有利于生产中对污染的控制。
2、本发明所述的里氏木霉BLCY-007，产生的木聚糖酶为胞外酶，分离工艺简单，经简单的离心、洗涤、即可得到酶制剂，节约了生产成本，降低了动力损耗。
3、本发明制备的木聚糖酶不含有纤维素酶等杂酶，不含有毒素，能安全用于食品原料低聚木糖的生产。
具体实施方式
下面通过具体实施例对本发明作进一步说明，但不限于此。
实施例1
一株里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007，2019年6月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.17970，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
上述里氏木霉筛选过程如下：
(1)原始菌种的筛选：
富集培养
选取山东德州百龙创园低聚木糖生产车间附近的土壤，用小铲子除去表土，取离地面10～20cm处的土壤约10g，用无菌水稀释10倍，加入PDA培养基进行富集培养，24℃～28℃的条件下培养24-48h。
所述PDA培养基原料组分如下：
马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g。
马铃薯提取液按如下方法制备：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L。
纯种分离
采用划线分离法，取一支盛有5ml无菌水的大试管，取步骤(1)中富集培养后的菌液2ml放入其中稀释，充分振荡分散，用接种环以无菌操作挑取稀释液一环先在平板培养基一边做第一次平行划线3～4条，再转动培养皿约60度角，将接种环上剩余物烧掉，待冷却后同一次划线方法做第二次划线，同法依次做第三次和第四次划线。划线完毕，盖上皿盖，将培养皿倒置，28～38℃培养24h后，挑取单个菌落接种于10个斜面培养基上，得斜面种子，分别编号01～10。
将01～10斜面种子接种于摇瓶培养基中培养24～28℃培养36h，对01～10摇瓶发酵液进行木聚糖酶酶活测定，03号摇瓶酶活最高，达到105U/ml。
所述平板培养基原料组分如下：
马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g。
所述斜面培养基组分如下，均为重量百分比：
马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g。
所述摇瓶培养基组分如下：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g。将上述组分混合后加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L。
对01～10摇瓶发酵液接种于种子培养基中，在24℃～28℃的条件下，增殖培养10～20h，制得种子液；
种子培养基原料组分如下：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g。将上述组分混合后加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L。
取种子液，按体积比1～10％的比例接种于发酵培养基中，在24℃～28℃，扩大培养24～36h，即得菌体发酵液。
发酵培养基原料组分如下，均为重量百分比：
玉米芯25％，葡萄糖4％，牛肉膏6％，蛋白陈1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸氢二钾0.02％，硫酸铵0.02％，余量水，pH＝5.0～6.0。
(2)突变剂或紫外线照射诱导突变过程：
诱变筛选
对03号菌种进行紫外线诱变，紫外线诱变采用15W紫外线灯20cm照射，照射时间为180s，得到的高产菌种再进行甲基磺酸乙酯诱变处理，最终得到高产木聚糖酶的菌株命名为BLCY-007，其产木聚糖酶在最适条件下，酶活达到508U/ml。
酶活测定：
(i)木聚糖酶活单位的定义
在37℃、pH值为5.5的条件下，每分钟从浓度为5mg/ml的木聚糖溶液中释放1μmol还原糖所需要的酶量即为一个酶活力单位U。
(ii)酶活测定方法
取2ml浓度为1％的木聚糖底物(pH＝5.5乙酸-乙酸钠缓冲液配制)，加入到比色管中，37℃平衡10min，再加入2ml经pH＝5.5乙酸-乙酸钠缓冲液适当稀释并经37℃平衡好的酸性木聚糖酶酶液，混匀于37℃精确保温反应30min。反应结束后，加入5ml DNS试剂，混匀以终止反应。然后沸水浴煮沸5min，用自来水冷却至室温，加蒸馏水定容至25ml，混匀后，以标准空白样为空白对照，在540nm处测定吸光值AE。
酶活计算公式：
XD＝[(AE－AB)×K+C0]×N×1000/(M×t)
式中：XD为稀释酶液中木聚糖酶的活力，U/ml；AE为酶反应液的吸光度；AB为酶空白液的吸光度；K为标准曲线的斜率；C0为标准曲线的截距；M为木糖的摩尔质量，150.2g/mol；t为酶解反应时间，min；N为酶液稀释倍数；1000为转化因子，1mmol＝1000μmol。
实施例2
实施例1中所述的里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007的培养方法，包括步骤如下：
(1)取里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007接种于PDA培养基中，在24℃的条件下，活化培养12h，制得活化菌株；
PDA培养基原料组分如下：
马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g。
马铃薯提取液按如下方法制备：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在24℃的条件下，增殖培养24h，制得种子液；
种子培养原料基组分如下：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g；将上述组分混合后加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比2％的比例接种于发酵培养基中，在24℃扩大培养24h，即得菌体发酵液；
发酵培养基原料组分如下，均为重量百分比：
玉米芯25％，葡萄糖4％，牛肉膏6％，蛋白陈1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸氢二钾0.02％，硫酸铵0.02％，余量水，pH＝5.0～6.0。
实施例3
实施例1中所述的里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007的培养方法，包括步骤如下：
(1)取里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007接种于PDA培养基中，在28℃的条件下，活化培养24h，制得活化菌株；
PDA培养基原料组分如下：
马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g。
马铃薯提取液按如下方法制备：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在28℃的条件下，增殖培养36h，制得种子液；
种子培养基原料组分如下：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g；将上述组分混合后加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比8％的比例接种于发酵培养基中，在28℃，扩大培养36h，即得菌体发酵液；
发酵培养基原料组分如下，均为重量百分比：
玉米芯25％，葡萄糖4％，牛肉膏6％，蛋白陈1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸氢二钾0.02％，硫酸铵0.02％，余量水，pH＝5.0～6.0。
对比例1
如实施例1所述，采用不经过紫外诱导突变的原始菌种。参考实施例2的方法进行培养，得到发酵液。
对比例2
采用市购得到的里氏木霉。参考实施例2的方法进行培养，得到发酵液。
对比例3
采用市购木聚糖酶。
实施例4
取实施例2、对比例1、对比例2制备的菌体发酵液经离心分离，洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，即为粗酶制剂；洗涤菌体采用pH＝8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液；离心分离均为在4℃、10000r/min条件下，离心10min。
试验例1
测定实施例4中得到的粗酶制剂的酶活。酶活测定方法同实施例1。
结果如表1所示：
表1
编号 实施例2 对比例1 对比例2 对比例3
酶活U/mL 506 101 163 201
由上述表1可知，本发明的里氏木霉得到的木聚糖酶的酶活相比现有技术有大幅提升。

Claims (10)

1.一株里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007，2019年6月14日保存于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)，保藏号CGMCC No.17970，地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
2.权利要求1所述的里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007的培养方法，包括步骤如下：
(1)取里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007接种于PDA培养基中，在24℃～28℃的条件下，活化培养12～24h，制得活化菌株；
(2)取步骤(1)制得的活化菌株，接种于种子培养基中，在24℃～28℃的条件下，增殖培养24～36h，制得种子液；
(3)取步骤(2)制得的种子液，按体积比1～10％的比例接种于发酵培养基中，在24℃～28℃，扩大培养24～36h，即得菌体发酵液。
3.根据权利要求2所述的里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007的培养方法，其特征在于，所述步骤(2)中的种子培养基原料组分如下：
去皮马铃薯200g，葡萄糖20g，KH2PO4 3g，MgSO4·7H2O 1.5g；将上述组分混合后加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L。
4.根据权利要求2所述的里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007的培养方法，其特征在于，所述步骤(3)中的发酵培养基原料组分如下，均为重量百分比：
玉米芯25％，葡萄糖4％，牛肉膏6％，蛋白陈1％，无水硫酸镁0.01％，磷酸氢二钾0.02％，硫酸铵0.02％，余量水，pH＝5.0～6.0。
5.根据权利要求2所述的里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007的培养方法，其特征在于，所述步骤(1)中的PDA培养基原料组分如下：
马铃薯提取液1.0L，葡萄糖20.0g，琼脂15.0g；
马铃薯提取液按如下方法制备：取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1.0L煮沸30min，滤去马铃薯块，将滤液补足至1.0L。
6.权利要求1所述的里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007在制备木聚糖酶中的应用。
7.根据权利要求6所述的里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007的应用，其特征在于，应用步骤如下：
取上述制备的菌体发酵液经离心分离，洗涤菌体，二次离心，保留沉淀物，即为木聚糖酶粗酶制剂。
8.根据权利要求7所述的里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007的应用，其特征在于，洗涤菌体采用pH＝8.0、浓度50mmol/L的Tris-HCl缓冲液，然后经离心分离，保留沉淀，制得粗酶制剂。
9.根据权利要求7所述的里氏木霉(Trichoderma reesei)BLCY-007的应用，其特征在于，离心分离均为在4℃、10000r/min条件下，离心10min。
10.权利要求6所述的木聚糖酶在制备低聚木糖中的应用。
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