CN104893985A - 一种棘孢曲霉菌株及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种棘孢曲霉菌株及其应用，属于发酵工程与生物技术领域，该棘孢曲霉菌株的保藏名称为：曲霉（Aspergillus sp.）BG30，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2013年06月28日，保藏编号：CGMCC No.7799。本发明的棘孢曲霉菌株发酵时胞外β-葡萄糖苷酶的酶活性高，副产物少，β-葡萄糖苷酶易分离纯化，分离纯化成本低，因此，以本发明的棘孢曲霉菌株作为出发菌株发酵生产β-葡萄糖苷酶易于实现工业化生产。

Description

一种棘孢曲霉菌株及其应用
技术领域
本发明涉及一种棘孢曲霉菌株及其应用，属于发酵工程与生物技术领域。
背景技术
β-葡萄糖苷酶（β-Glucosidase，EC 3.2.1.21），又称β-D-葡萄糖苷葡萄糖水解酶，它能够水解结合于末端非还原性的β-D-葡萄糖苷键，同时释放出β-D-葡萄糖和相应的配基，这种酶存在于许多植物体，还存在于一些酵母、霉菌、木霉菌属及细菌甚至是昆虫体内。β-葡萄糖苷酶可以将水果、蔬菜、茶叶中的风味前体物质β-糖苷水解为具有浓郁天然风味的香气物质。
β-葡萄糖苷酶的可运用领域广泛：可以用在果汁行业用于增香脱苦，很多果汁中含有很多风味前体物质——β-糖苷，只要通过一些酶的作用就能使这些糖苷配基挥发释放，起到增香的作用，在众多的研究中发现，棘孢曲霉产的葡萄糖苷酶对苹果汁、柠檬汁、茶汁的增香效果良好；另外在果酒中的增香目前也是研究的热点，对于脱苦的原理和增香类似，例如在青梅汁中，葡萄糖苷酶可以将其中的苦杏仁苷分解为苯甲醛及氢氰酸和两分子的葡萄糖，这就使青梅的苦味大大减少；葡萄糖苷酶的脱苦还可以用在柑橘、橄榄等具有一定苦味的水果中。
另外，还可以用于一些糖苷类前体的分解来生产分解后产物，例如低聚龙胆糖的生产、大豆异黄酮的生产，这两种产物的前体都是以结合型的糖苷形式存在。除了以上这些领域，β-葡萄糖苷酶的应用领域还很宽泛，比如制造生物酒精，通过基因技术来达到防治病虫害的目的，以及一些天然染料的生产，动物饲料的生产甚至是医药领域。
现有技术中产β-葡萄糖苷酶的棘孢曲霉菌株胞外β-葡萄糖苷酶活性不高，本申请的发明人获得一株具有较高胞外β-葡萄糖苷酶活性的棘孢曲霉菌株。
发明内容
本发明的目的在于提供一株具有较高胞外β-葡萄糖苷酶活性的棘孢曲霉菌株。
本发明另一个目的是提供该棘孢曲霉菌株在产生β-葡萄糖苷酶中的应用。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是：
一种棘孢曲霉菌株，该棘孢曲霉菌株的保藏名称为：曲霉(Aspergillus sp.)BG30，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年06月28日，保藏编号：CGMCC No.7799。
本发明棘孢曲霉菌株的菌落形态特征：在麦芽汁琼脂培养基上生长快，25℃黑暗条件下培养7天，菌落直径60-65mm，质地绒状；产孢结构大量形成，分生孢子头紫褐色，初期球形，后期开裂，菌落背面浅褐色。分生孢子梗大，宽8.5-11.0μm，褐色，壁光滑，顶囊球形，直径33-42μm，全部表面可有；产孢结构单层，瓶梗6-10*μm，分生孢子椭圆形，少数球形或近球形，浅到褐色，具明显小刺，2.9-4.7*2.5-4.0μm，未见有性孢子。
所述棘孢曲霉菌株应用于β-葡萄糖苷酶中的生产，具体包括以下步骤：
（1）将曲霉（Aspergillus sp.）BG30接入斜面培养基进行增殖培养，获得种子；
（2）将种子接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得β-葡萄糖苷酶粗酶液，所述粗酶液经过分离、纯化获得β-葡萄糖苷酶。
培养条件影响棘孢曲霉菌株的繁殖，进而影响其生产β-葡萄糖苷酶的能力，步骤（1）中增殖培养的条件为温度28~34℃，培养时间56~150h；步骤（2）中发酵培养的条件为温度28~34℃，培养时间56~150h。
β-葡萄糖苷酶作为胞外产物，发酵完成后，β-葡萄糖苷酶存在于发酵液中，通过常规的酶分离纯化方法即可分离纯化获得高酶活的β-葡萄糖苷酶。
培养基的种类也是影响棘孢曲霉菌株繁殖的重要条件，步骤（1）中斜面培养基的组成为：葡萄糖 2.0-5.0g，氯化钠3.0g，硝酸钾3.0g，磷酸氢二钾0.06g，硫酸铜0.004g，麸皮10.0g，酒石酸钾钠0.005g，氯化铁0.005g，硫酸锰0.005g，琼脂20.0g，乳糖0-10.0g，蒸馏水1000mL， pH值5.5~6.0，所述斜面培养基配置好后于0.08Mpa灭菌20min，划线接入曲霉BG30进行培养。
步骤（2）中产酶培养基的组成以1L培养基计为：麸皮34~36g，硫酸铵1.8~2.0g，MgSO4·7H2O 0.4~0.5g，蛋白胨1.2~1.5g，FeSO4·7H2O 0.008~0.01g ，葡萄糖0-20g，pH 5.45~5.55。
与现有技术相比，本发明的有益效果是：
（1）本发明的棘孢曲霉菌株发酵时胞外β-葡萄糖苷酶的酶活性高，副产物少，β-葡萄糖苷酶易分离纯化，分离纯化成本低，因此，以本发明的棘孢曲霉菌株作为出发菌株发酵生产β-葡萄糖苷酶易于实现工业化生产。
（2）本发明的棘孢曲霉发酵培养基成分简单，工业化生产中配料简单，无需预处理，可以显著降低生产成本。
（3）本发明的棘孢曲霉菌株的培养条件工艺参数设计合理，过程易于控制。
具体实施方式
下面通过具体实施例，对本发明的技术方案作进一步的具体说明。
1、         菌株的分离纯化
1.1 样本采集：从小竹林排水沟、野生茶树下、腐烂竹叶和枯桃树木等下的土壤中采集25个土壤样品于无菌试管中。
1.2 样本处理
试剂准备：含抗生素的样本处理液配置：氨苄青霉素 1g，卡那霉素 0.55g，氯化钠 8.5g，吐温1g溶于适量水中；1g氯霉素用4.5ml乙醇溶解；将乙醇-氯霉素溶液混入第一步所得溶液中，定容至1L得到处理液。
筛选培养基：含甲基红的察氏培养基（g/L）：CMC-Na 15.0，硝酸钠 3.0g，七水硫酸镁 0.5g，氯化钾 0.5g，七水硫酸亚铁 0.01g，磷酸氢二钾 1.0g，甲基红 0.2g，琼脂 15g，水 1.0L。
样品处理：在每支含土壤样本的无菌试管中加入10mL含抗生素的样品处理液，并于高速混匀机中混匀，静置30min。
接种：分别将混合后的处理液取50μL于2mL的离心管中（第一管），并加入950μL生理盐水（无抗生素）即稀释20倍，从第一管中取50uL于第二管并计入950μL生理盐水，以上步骤重复，最后取稀释倍数为400，8000，160000的10μL涂布于平板，于28℃霉菌培养箱中培养。
1.3平板初筛
试剂准备：PDA培养基：马铃薯（去皮）200g/L，葡萄糖20.0g/L，琼脂15～20g/L，制得1L培养基，分别倒试管斜面、平板。
菌落挑取：取单一霉菌接种于PDA斜面上于28℃霉菌培养箱中培养。
1.4 试管摇床复筛 
1.4.1试剂准备：配制10×的真菌、细菌复筛培养基浓缩液：
真菌培养基浓缩液：（NH4）2SO4 20 g/L，KH2PO4 20g/L，CaCl2 4g/L, MgSO4·7H2O 4g/L。
细菌培养基浓缩液：KH2PO4 100g/L，NaCl 20g/L， MgSO4·7H2O 2g/L浓缩液配制完成后于灭菌锅灭菌，放于无菌柜,待用。
1.4.2 浓缩液配制培养基：
真菌：取浓缩液适量，加入纤维二糖 0.3g/L，CMC-Na 0.5g/L，然后将体积定容到浓缩液的10倍。
细菌：取浓缩液适量，加入纤维二糖 0.3 g/L, 蛋白胨1 g/L，将溶液定容到浓缩液的10倍。
pH4.5的0.2 mol/L Na2HPO4-0.1 mo mol/L的柠檬酸缓冲液的配制：0.1 mol/L的柠檬酸用磷酸二氢钠滴定至pH4.5，定容。
5 mmol /L的p-NPG(对硝基苯基葡萄糖苷)底物溶液
Na2CO3 1mol/L（反应终止液）
1.4.3 试管摇床发酵复筛
将初筛斜面上的菌落于超净台分别接种于含真菌浓缩液培养基和细菌浓缩液培养基的试管中，接种后于120r/min，30℃条件下摇床培养4d.。
1.4.4 酶活测定
在OD420nm下测吸光值，空白对照为酶液用去离子水代替的混合物。
酶活测定方法：将发酵培养液于3 000 r/min离心10 min，得上清粗酶液，用微量进样器取0.1 mL适度稀释的粗酶液，加入0.9 mL pH4.5的0.2  mo/L Na2HPO4-0.1 mol/L柠檬酸缓冲液,于50℃恒温水浴预热5～10 min,再加入已预热5～10 min的1 mL 5 mmol /L的p-NPG溶液，用秒表精确计时, 10 min后立即加入1 mL 1 mol·L-1的Na2CO3溶液终止反应，室温放置5 min，于4420 nm处测光吸收值OD。
酶活计算：每毫升酶液每分钟水解产生1μmol的对硝基苯酚的酶活力,定义为一个酶活单位，计算公式如下:
           U=C×N/10×0.1=C·N= 0.369·OD·N，上式中, U：酶活单位(μ/mL), 10:反应时间, N:原酶液稀释倍数, 0.1:取0.1 mL酶液反应, C:对应于对硝基苯酚-光密度曲线上的值C=0.369·OD·N。
1.5诱变
将步骤1.4试管摇床发酵复筛获得β-葡萄糖苷酶活性较高的棘孢曲霉菌进一步UV诱变处理，再通过EMS(甲基磺酸乙酯)和DES(硫酸二乙酯)联合诱变，获得一株β-葡萄糖苷酶酶活性最高的棘孢曲霉菌株，命名为：曲霉(Aspergillus sp.)BG30，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，保藏日期：2013年06月28日，保藏编号：CGMCC No.7799。
2、         菌株的鉴定
上述棘孢曲霉菌株的菌落特性为：在麦芽汁琼脂培养基上生长快，25℃黑暗条件下培养7天，菌落直径60-65mm，质地绒状；产孢结构大量形成，分生孢子头紫褐色，初期球形，后期开裂，菌落背面浅褐色。分生孢子梗大，宽8.5-11.0μm，褐色，壁光滑，顶囊球形，直径33-42μm，全部表面可有；产孢结构单层，瓶梗6-10*μm，分生孢子椭圆形，少数球形或近球形，浅到褐色，具明显小刺，2.9-4.7*2.5-4.0μm，未见有性孢子。
3、         本发明的棘孢曲霉菌株用于β-葡萄糖苷酶生产
斜面培养基的组成为：葡萄糖 5.0g，氯化钠3.0g，硝酸钾3.0g，磷酸氢二钾0.06g，硫酸铜0.004g，麸皮10.0g，酒石酸钾钠0.005g，氯化铁0.005g，硫酸锰0.005g，琼脂20.0g，乳糖10.0g，蒸馏水1000mL， pH值5.5~6.0，所述斜面培养基配置好后于0.08Mpa灭菌20min，划线接入曲霉BG30进行培养。
发酵培养基1（以1L计）：麸皮34g，硫酸铵1.8g，MgSO4·7H2O 0.4g，蛋白胨1.2g，FeSO4·7H2O 0.008g ，葡萄糖2g，pH 5.45。
发酵培养基2（以1L计）：麸皮36g，硫酸铵2.0g，MgSO4·7H2O 0.5g，蛋白胨1.5g，FeSO4·7H2O 0.01g ，葡萄糖2g，pH 5.55。
β-葡萄糖苷酶生产方法如下：
（1）将曲霉（Aspergillus sp.）BG30接入斜面培养基，于28~34℃，进行增殖培养96h，获得种子；
（2）将种子接入产酶培养基，于28-34℃进行发酵培养96h，发酵液进行离心分离获得β-葡萄糖苷酶粗酶液，所述粗酶液经过分离、纯化获得β-葡萄糖苷酶。
发酵完毕后按步骤1.4.4酶活测定方法，测定发酵液中β-葡萄糖苷酶的活性，具体结果如下：发酵培养基1获得的发酵液中β-葡萄糖苷酶的酶活为7.343 U/mL，发酵培养基2获得的发酵液中β-葡萄糖苷酶的酶活为7.543 U/mL。
上述棘孢曲霉的发酵液经40~70%（NH4）2SO4分级沉淀，透析，DEAE阴离子交换柱层析，Sephadex G-25凝胶柱脱盐，真空冷冻干燥后得到的β-葡萄糖苷酶，其比活达到521.853U/mg，纯化9.7倍，酶的回收率为66%。
上述分离得到的β-葡萄糖苷酶能够耐65~100℃高温，耐4%氯化钠，耐3%醋酸和11%酒精，具有较强的增香，转糖苷酶活性，可以用作酶法合成烷基糖苷，如用于催化葡萄糖和抗坏血酸合成抗坏血酸葡萄糖苷，在65℃，3min完成，而市售的β-葡萄糖苷酶要在40℃条件下36h方能完成。
以上所述的实施例只是本发明的一种较佳的方案，并非对本发明作任何形式上的限制，在不超出权利要求所记载的技术方案的前提下还有其它的变体及改型。

Claims (8)

1.一种棘孢曲霉菌株，其特征在于：该棘孢曲霉菌株的保藏名称为：曲霉(Aspergillus sp.)BG30，保藏单位：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏日期：2013年06月28日，保藏编号：CGMCC No.7799。
2.一种权利要求1所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：所述棘孢曲霉菌株在生产β-葡萄糖苷酶中的应用。
3.根据权利要求2所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：包括以下步骤：
（1）将曲霉（Aspergillus sp.）BG30接入斜面培养基进行增殖培养，获得种子；
（2）将种子接入产酶培养基进行发酵培养，发酵液进行分离获得β-葡萄糖苷酶粗酶液，所述粗酶液经过分离、纯化获得β-葡萄糖苷酶。
4.根据权利要求3所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：步骤（1）中所述增殖培养的温度为 28~34℃，培养时间为56~150h。
5.根据权利要求3所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：步骤（2）中所述发酵培养的温度为28~34℃，培养时间为56~150h。
6.根据权利要求5所述的棘孢曲霉的应用，其特征在于：所述发酵培养为摇床培养，摇床的转速为80~300r/min。
7.根据权利要求3所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：步骤（1）中斜面培养基的组成为：葡萄糖 2.0-5.0g，氯化钠3.0g，硝酸钾3.0g，磷酸氢二钾0.06g，硫酸铜0.004g，麸皮10.0g，酒石酸钾钠0.005g，氯化铁0.005g，硫酸锰0.005g，琼脂20.0g，乳糖0-10.0g，蒸馏水1000mL， pH值5.5~6.0，所述斜面培养基配置好后于0.08Mpa灭菌20min，划线接入曲霉BG30进行培养。
8.根据权利要求3所述的棘孢曲霉菌株的应用，其特征在于：步骤（2）中产酶培养基的组成以1L培养基计为：麸皮34~36g，硫酸铵1.8~2.0g，MgSO4·7H2O 0.4~0.5g，蛋白胨1.2~1.5g，FeSO4·7H2O 0.008~0.01g ，葡萄糖0-20g，pH 5.45~5.55。
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