CN102127514B - 一株强稳定性中温中性α-淀粉酶高产菌及其酶学性质 - Google Patents
一株强稳定性中温中性α-淀粉酶高产菌及其酶学性质 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属生物技术领域，具体涉及一株高产强稳定性中温中性淀粉酶枯芽胞杆菌(Bacillus subtilis)XLG-1的筛选及此酶的酶学性质的初步研究。该菌株保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称中国微生物菌种保藏中心)，保藏号CGMCC No.3871。其生物学特性为：形态为长杆状，在淀粉筛选固体培养基上菌落圆形、边缘不齐、菌苔干燥、不透明、乳白色。在37℃摇瓶培养72h，酶活可达22000U/mL，经过紫外线-氯化锂复合诱变后最高产酶达6183U/mL，此酶广泛引用于洗涤剂、啤酒、食品、医药、制革、纺织，造纸业等领域。
Description
技术领域
本发明涉及一株具有工业应用潜力的，强稳定性中温中性α-淀粉酶产生菌的筛选及其产酶性质，属生物技术领域。
背景技术
α-淀粉酶(α-amylase，EC3.2.1.1)又称液化酶，长链淀粉水解为短链糊精和还原糖，因生成的糖为α型，故称α-淀粉酶，它将淀粉分子链中的α-1，4葡萄糖苷键随机切断成长短不一的短链糊精、少量麦芽糖和葡萄糖。α-淀粉酶是淀粉加工过程中的主要酶类之一，反应不需要辅酶，且条件温和，副产物少，因此广泛应用于洗涤剂、啤酒、食品、医药、制革、纺织等领域。其中微生物源的α-淀粉酶由于其生产成本低、环境危害小、产酶活性高，便于工业生产，成为最具发展前途的工业酶之一。
我国上世纪70年代已有了α-淀粉酶工业化生产，相继开发出中温淀粉酶、高温淀粉酶、酸性淀粉酶，碱性淀粉酶等，但淀粉酶的酶学性质仍无法完全满足现代工业的需求。本发明所涉及的中温中性α-淀粉酶不仅温度、pH适应范围广且耐温耐酸性能好，展示了诱人的工业应用前景和商业价值，是实现化学工业过程向建立高效率、低成本生物技术加工过程转化的最佳催化剂。
发明内容
本发明的目的是提供一株生产强稳定性中温中性淀粉酶菌株(枯草芽孢杆菌XLG-1)，以及对其产酶性质的初步研究，然后通过初步的紫外诱变筛选出一株α-淀粉酶高产菌。
本发明提供的产中温中性淀粉酶菌株从淀粉加工厂污泥中筛选得到，通过考察其形态特征、生理生化特性，将其鉴定为枯草芽孢杆菌Bacillus subtilis，命名为XLG-1，经诱变后的菌株于2010年5月24日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(简称中国微生物菌种保藏中心)，保藏号CGMCCNO.3871。
对该菌株的相关研究得到如下结论：
1.菌落形态特征及生理生化特征：该菌在酸性培养基上生长良好，为好氧菌，菌落表面干燥，不透明，边缘整齐，乳白色。革兰氏染色阳性，镜检为长杆状。其生理生化特征见表1。
表1 XLG-1的生理生化特征
2.培养基及培养条件
筛选培养基：淀粉1％，蛋白胨1％，(NH)2SO40.4％，K2HPO40.8％，CaCl20.2％，琼脂2％，pH 5.5。
种子培养基：酵母粉0.5％，蛋白胨1％，可溶性淀粉1％，NaCl 1％。
发酵培养基：玉米粉5％～15％，豆饼粉4％～10％，(NH)2SO40.4％，K2HPO40.8％，CaCl20.2％。
摇瓶培养条件：该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中，接种量10％(V/V)，250r/min、37℃发酵培养72h。
3.酶学性质：
(1)该酶温度适应范围较宽，最适作用温度在50-70℃之间，且在60℃以下保存的温度稳定性较好，而70℃以上保存长时间温度稳定性较差，但保存两小时内残余酶活仍然很高。
(2)该酶最适反应pH值为5.5。在pH值4.5-7.5之间均有较高酶活力。
(3)该酶分子量在58KD左右。
4.酶活性
XLG-1在以上发酵培养基中摇瓶培养72h，酶活达到2200U/mL。经紫外线-氯化锂复合诱变后筛选到最高产酶量为6183U/mL。
5.诱变筛选
经过紫外线-氯化锂复合诱变后筛选到4株具有较高酶活的突变菌，列表如下：
菌株 XLG-1(原菌) XLG-51 XLG-60 XLG-78 XLG-100
酶活(U/mL) 2200 5822 5717 6183 5618
经再次摇瓶发酵后XLG-78为稳定的最高产菌。
【有益效果】
提供了一株具有工业应用潜力的强稳定性中温中性α-淀粉酶产生菌及其酶学性质。
附图说明：
图1产酶菌株的生长曲线
图2温度对酶活性的影响
图3不同温度下此酶的稳定性
图4pH对酶活性的影响
图5不同pH稳定性
具体实施方式
实施例1：产淀粉酶菌株的筛选
初筛：在淀粉加工厂周围取土样1g溶于50mL无菌水中，摇匀制成土壤悬液，并于80℃水浴20min富集芽孢；将土壤悬液稀释不同倍数后取200μL涂布于上述筛选培养基的固体平板中，培养48h后，挑取水解圈/直径大的几株单菌落进行划线分离，并保存于种子斜面培养基。
复筛：将初筛得到的几株菌进行摇瓶复筛，摇瓶培养基为上述的发酵培养基，在37℃，250r/min(旋转式摇床)，培养72h后测发酵液中酶活，得到产酶最高的一株菌命名为XLG-1。
实施例2：淀粉酶活性的测定
淀粉酶酶活的测定采用国标工业用α-淀粉酶制剂测定方法(QB1805.1-93)。
酶活单位的定义：1mL液体酶，于60℃、pH 6.0条件下，1min液化1mg可溶性淀粉，即为1个酶活力单位，以U/mL表示。
实施例3：中温中性淀粉酶酶学性质
(1)温度对酶活性的影响以及酶的热稳定性
相同反应体系，于30～90℃下分别测定该淀粉酶酶活力，结果如图2所示：该酶在30-85℃之间均表现较高酶活性，说明该酶的温度适应范围较宽，其最适作用温度为50-70℃。将该酶液在40℃，60℃，70℃下恒温保存不同时间测残余酶活，结果如图3所示：40℃，60℃两个温度下保存18h仍有65％以上酶活残存，而70℃保存4h后酶活仅存3％，表明该酶在60℃以下活性非常稳定。
(2)pH对酶活性的影响以及酸稳定性研究
相同反应体系，在pH 3-8.5下分别测该酶酶活，结果如图4所示，该酶在pH5-7时酶活性较高，表明该酶为中性淀粉酶。不同pH值下此酶的稳定性：将酶用不同pH值的磷酸氢二钠-柠檬酸缓冲液适当稀释，在25℃下保温18h后再测此酶酶活，结果如图5所示，发现在pH 5-8，均有较高残余酶活，但pH 5-7较稳定，18h室温保存后仍有75％以上的酶活，说明此酶耐pH值范围较广且在中性偏酸条件下较稳定。
(3)淀粉酶蛋白分子量大小的测定
将发酵得到的粗酶液通过SDS-PAGE分析蛋白分子量，此酶分子量在58KD左右。
实施例4：培养条件及产酶活性的研究
种子培养条件：测定XLG-1菌株在种子培养基中的生长曲线，如附图1所示：该菌在37℃，250rpm(旋转式摇床)的条件下培养6h进入对数生长期，第18h进入生长稳定期，由此得出种子培养时间为12h。
发酵培养条件及酶活测定：该菌在含有30mL发酵培养基的250mL摇瓶中进行摇瓶发酵，种子接种量10％(V/V)，37℃、250r/min培养72h，离心取发酵上清液，测得酶活性达2200U/mL。
实施例5：紫外线-氯化锂复合诱变筛选
1.氯化锂平板的制备
在上述的筛选培养基中添加0.4％(w/v)的氯化锂，121℃高压蒸汽灭菌20min后制成平板
2.菌悬液的制备
(1)将在平板划线分离后长出的单菌落接入上述的种子液中，250r/min，37℃旋转式摇床上培养，12h后取培养液1mL于2mL的离心管中，8000r/min离心5min。
(2)去除上清液，用1mL生理盐水悬浮菌体。
(3)8000r/min离心5min，重复步骤(2)两次。
(4)将悬浮后的菌液再倒入9mL的生理盐水中。
3.紫外诱变的处理
(1)将紫外灯线灯开关打开预热约30min。
(2)取直径6cm无菌平皿，加入上述调整好的细胞浓度的菌悬液3mL，并放入一根无菌磁力搅拌器或大头针。
(3)打开皿盖，在距离为30cm，功率15w的紫外灯下分别搅拌照射10s，盖上皿盖，关闭紫外灯。
(4)照射计时从开盖起，先开磁力搅拌器开关，再开皿盖照射，使菌悬液中的细胞接受照射均等。
4.稀释涂布
用10倍稀释法把经过照射的菌液在生理盐水中稀释成10-1-10-6，然后取10-4，10-5，10-6三个稀释度的菌液100μL涂布于平板，每个稀释度涂三个平板，用无菌玻璃棒均匀地涂满整个平板表面。以同样的操作，取未经紫外线照射的菌液稀释涂平板作对照。
5.培养
将上述涂布均匀的平板，用黑色的布或报纸包好，置37℃培养48h，注意每个平板背面要事先标明处理时间和稀释度。
6.筛选
在长出菌落的平板上初筛出水解圈与菌落直径比值较大者挑至斜面保存，纯化后进行摇瓶发酵复筛。
经复筛后得到一株突变菌株产酶高达6183U/mL。
Claims (2)
1.一株高产强稳定性中温中性α-淀粉酶的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） XLG-1，现保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心（简称中国微生物菌种保藏中心），保藏号CGMCC NO.3871。
2.培养权利要求1所述的枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） XLG-1的方法，其特征为：初始发酵培养基为玉米粉5-15%，豆饼粉4-10%，(NH)2SO4 0.4%，K2HPO4 0.8%，CaCl2 0.2%；培养条件为：250 mL三角瓶装30 mL的发酵培养基，接种量为10%（体积比），37℃，200-250 r/min，发酵72 h。
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