CN101148646B - 一种高活力壳聚糖酶制剂的生产方法 - Google Patents

Abstract

本发明提出了一种利用枯草芽孢杆菌TQS6，采用UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，诱导培养能高效表达壳聚糖酶TQK菌株及其发酵生产高活力壳聚糖酶的生产方法，对该菌株进行斜面培养，一级培养后进行发酵培养，并且在发酵过程中通入富氧空气增加溶氧，保证发酵液溶氧浓度为30％-80％；培养18-24小时，平均酶活力达到718u/ml。在优化产酶条件下可发酵得到高活力壳聚糖酶。通过本技术生产出的酶具有产酶量高，产酶稳定，酶活力高，使用本发明的高活力壳聚糖酶能高效经济地转化壳聚糖生产壳寡糖。

Description

一种高活力壳聚糖酶制剂的生产方法

技术领域；

本发明涉及微生物发酵技术和酶工程技术，特别是一种高效表达壳聚糖酶的芽孢杆菌TQK菌株和高活力壳聚糖酶制剂的生产方法。

背景技术

目前，国内外降解制备壳寡糖的方法大致可分为酶降解法、氧化降解法和酸降解法三大类。利用生物酶降解制备壳寡糖的过程明显优于另两种化学降解法，这是由于酶法降解过程使降解产物的分子量分布更容易被控制，能对降解过程进行监控，生产出有效(2-10糖)含量较高的壳寡糖，且降解条件比较温和，无需加入大量的反应试剂，对环境污染较少。热点论坛第6卷第2期报道了李风平等(2003)筛选到1株产壳聚糖的腐皮镰孢菌(Fusariumsolani)菌株，摇瓶表明，产酶要84小时，酶活力45u/ml；逢玉娟等(2005)筛选到产酶能力强的菌株，72小时菌株YJ102发酵液中壳聚糖酶活力达到17.04u/ml；吴健等筛选到一株半纤维A1号菌株，发酵酶活力达到300u/ml。壳聚糖酶数量众多，但普遍存在酶活性低，酶解底物浓度低(3-10％)，酶解时间长，能耗高等问题。

发明内容

本发明的目的是利用TQS6菌株，通过UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，诱导培养能高效表达壳聚糖酶的芽孢杆菌TQk菌株，及其发酵生产高活力壳聚糖酶的生产方法，从而能高效经济地转化生产壳寡糖。

使用的微生物：本发明涉及的芽孢杆菌TQK，它具有高效表达壳聚糖酶的特性，该菌株于2007年8月14日在中国典型培养物保藏中心保藏，地址.中国.武汉.武汉大学，保藏号为CCTCC No：M207129(以下简称TQK)。

芽孢杆菌TQK菌株的菌学特性：

a、形态特征：单个细胞0.7～0.8×2～3微米、着色均匀。无荚膜，周生鞭毛，能运动。革兰氏阳性菌，芽孢0.6～0.9×1.0～1.5微米，椭圆到柱状，位于菌体中央或稍偏，芽孢形成后菌体不膨大。

b、生理生化特征：菌落表面粗糙不透明，污白色或微黄色、在液体培养基中生长时，形成皱醭；需氧菌；可利用蛋白质、多种糖及淀粉。在壳聚糖的诱导下产生壳聚糖酶，在壳寡糖的生产上起到关键作用。广泛分布在土壤及腐败的有机物中，易在枯草浸汁中繁殖。

本发明是这样实现的。从CCTCC(中国典型培养物保藏中心保藏)取得的TQS6菌株为基础，通过UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，紫外诱变的条件是：紫外灯功率15～30w，照射距离20～50cm，照射时间1～8min。NTG诱变的条件是：NTG浓度1～3mg/ml，在pH6.0的tris缓冲液中，处理90～120min。将菌种接种在含有0.1～0.5％的刚果红平板培养基中，30～35℃，诱导培养24～48小时，可见透明水解圈。培养基配方按质量百分比计为：1.5～2.5％琼脂，壳聚糖1～3％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，NaCl 0.1～0.5％，刚果红0.1～0.5％。

选取水解圈直径H/C菌落直径比值大的菌株，进行摇瓶复筛，通过DNS法测定酶活。平均酶活力达到518u/ml。

选取优良菌株进行稳定传代3代。最后得到高产壳聚糖酶斜面菌株。并将该菌株命名为TQK，于4℃冰箱中保存。并送中国典型培养物保藏中心保藏，保藏号为CCTCC No：M207129(简称TQK)

发酵产酶工艺包括如下步骤：

(1)一级液体培养：即从斜面到1000ml三角瓶的放大培养，接种量为TQK斜面菌一环，在30～35℃，200～300r/min，PH6.0～7.0条件下，在液体培养基中培养12～24小时。培养基配方按质量百分比计：壳聚糖0～0.5％，胰蛋白胨0.5～2％，酵母浸粉0.5～2％，NaCl 0～0.5％。

(2)7L小罐发酵产酶

以3-5％的接种量接种，培养条件：35-37℃，300-500r/min，培养基配方为壳聚糖1.5-2.5％，无机盐复合成份4.5-5.0％(Na₂HPO₄·12H₂O 1～3％，KH₂PO₄0.1～0.5％，NaCl 0.1～0.5％，NH₄Cl 0.1～0.5％，KCL 0.01～0.05％)，酶母浸粉1.0-1.5％，胰蛋白胨1.0-1.5％，玉米渣1-5％，最佳培养条件：35±1℃，500r/min，最佳配方为壳糖聚1.5％，无机盐复合成份4.5％，酶母浸粉1.0％，胰蛋白胨1.0％，玉米渣3％，通入压缩空气，旺盛时补加纯氧，组成富氧空气，保证发酵液溶氧浓度为30％-80％；培养18-24小时，最佳培养22小时；DNS法测定酶液的活力，平均酶活力达到718μ/ml。

(3)酶的纯化

发酵完成后，用大容量低温高速离心机以6000r/min将发酵液中培养基残余物及部分菌体除去。用0.1μm的微滤膜对酶液进行纯化处理，进一步除去残存的微量的菌体，用6000分子量的超滤膜对稀酶进行处理，浓缩除去部分水和无机盐类物质，酶的得率≥80％。

(4)高活力壳聚糖酶酶液低温0～4℃下贮存。

本发明与现有技术相比具有以下突出特点：

1、高效产酶菌株

目前，一般菌株发酵产壳聚糖酶的较快周期在72小时(参阅热点论坛第6卷第2期“酶法制备壳寡糖研究现状”一文)，本发明采用的菌株则是通过诱变、诱导、筛选出的高效菌株，发酵仅需18-24小时，产酶效率大大提高。

2、酶的活性大大提高

现有壳聚糖的酶活性仅为300u/ml，而本发明提供的酶是高活性的酶，酶活性可达718u/ml。(酶活性测定用DNS法测定)

3、酶解工艺效率高

一般壳聚糖酶发酵水解工艺中，水解底物浓度为3％-10％，需72小时。而将本发明应用于水解工艺中，底物可达20％，水解时间仅需4-6小时。

具体实施方式

下面结合实施例，对本发明做进一步地详细说明。

实施例1高效表达壳聚糖酶的TQK菌株选育.

从CCTCC(中国典型培养物保藏中心保藏)取得的TQS6菌株为基础，通过UV(紫外线诱变)和NTG(亚硝基胍诱变)复合诱变，紫外诱变的条件是：紫外灯功率15～30w，照射距离20～50cm，照射时间1～8min。NTG诱变的条件是：NTG浓度1～3mg/ml，在pH6.0的tris缓冲液中，处理90～120min。将菌种接种在含有0.3％的刚果红平板培养基中，35℃诱导培养30小时，可见透明水解圈。培养基配方按质量百分比计为：2％琼脂，壳聚糖0.5％，胰蛋白胨1％，酵母浸粉1％，NaCl 0.5％，刚果红0.3％。

选取水解圈直径H/C菌落直径比值大的菌株，进行摇瓶复筛，通过DNS法测定酶活。平均酶活力达到518u/ml。选取优良菌株进行稳定传代3代，最后得到高产壳聚糖酶斜面菌株，于4℃冰箱中保存。将该菌株命名为TQK，保藏号为CCTCC No：M207129。

实施例2发酵生产壳聚糖酶

1)：将TQK菌株(保藏号为CCTCC No：M207129)用划线接种在含酵母浸粉1％，胰蛋白胨1％，氯化钠0.5％，壳聚糖0.5％，琼脂2％的平面培养基上，33℃温度下培养24小时使用。

2)一级液体培养：用1000ml的三角瓶装200ml含酵母浸粉1％，胰蛋白胨1％，氯化钠0.5％，壳聚糖0.5％的液体培养基，10磅灭菌20分钟，接种一环，34℃摇床上震荡(260r/min)培养27小时。

3)用7升发酵罐装5升含酵母浸粉，胰蛋白胨，壳糖聚，无机盐复合成份，玉米渣组成的液体培养基，同上灭菌后接摇瓶种子200mL于35℃下通气搅拌18-24小时出罐。

4)低温离心分离酶液：用大容量低温高速离心机以6000r/min的转速在4℃条件下离心15-20分钟，除去菌体等残存物，取出上清液得本发明所诉的酶液，置0-4℃低温保存备用。

酶活的测定，采用DNS法测定酶液的活力

1、DNS法测酶活：以1％冰乙酸溶液配置浓度为1％的壳聚糖浓度，49℃水浴保温反应10min，加入DNS试剂，沸水浴中显色10min，用纯水稀释定容到25ml。用721分光光度计，在520nm处进行比色。通过测定OD值求出对应的还原糖含量，再用酶活公式计算求出酶活力。酶活力定义为：在49℃、pH6.0条件下，每分钟生成1μmol相当于壳寡糖的还原糖所需的酶量为一个酶活力单位.

2、酶活计算公式为

公式X＝A×1ml/V×F×1/T×1000/180

式中：X-酶活力μmol/ml             A-壳寡糖生成量mg

Claims (1)

1.一种枯草芽孢杆菌(Bacillus subtill)TQK，其保藏号为CCTCCNo：M207129。