CN103695315B - 一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，该微生物即淡紫拟青霉菌（Paecilomvces？lilacinus）三炬03菌株，菌种专利保藏号CCTCC？NO:M2010165。该方法包括利用微生物菌即淡紫拟青霉菌三炬03菌株，以虾壳粉为原料，通过微生物发酵生产甲壳低聚糖：①在一定溶氧条件下；②在培养到一定菌体密度时添加一定量菌丝生长抑制剂去氧胆酸钠的条件下，促进菌体胞外几丁质酶的分泌，提高对甲壳素降解水平；③在发酵中后期流加补料工艺的条件下，用虾、蟹壳为原料发酵生产甲壳低聚糖。所得到的甲壳低聚糖可用于医药，农业、食品领域，整个生产工艺简便高效，具有广泛的工业化发展前景，为虾、蟹壳找到了一条绿色的应用途径。

Description

一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及一种微生物菌株及其发酵生产甲壳低聚糖的方法。

背景技术

当前国内对甲壳素的利用，主要以壳聚糖为主，而甲壳低聚糖作为一种功能性低聚糖，在医药、食品等领域具有广泛的应用前景，其市场价格比壳聚糖高10倍左右。甲壳低聚糖在国内已有生产，大多是采用酸碱水解法，但产物纯度低、浪费大、环境污染严重，也有采用酶解法，大都是采用复合酶法，其成本昂贵、规模较小。国外也只有日本等少数几个国家有规模生产。近年对甲壳低聚糖的功能、性质研究的深入，其应用在国内外受到广泛的关注，市场前景广阔。

甲壳低聚糖生产的原料，来源于海产品加工厂的虾、蟹壳等废料。我国海域面积极其辽阔，海产品生产量很大，这些资源很好很充足，但却迄今仍未有效地被开发和利用，因而对环境造成潜在的威胁。所以合理开发利用这一资源，不仅具有经济学意义，还有很重要的生态学意义。

传统的制备甲壳低聚糖的方法是脱乙酰基化学法，由于生产过程耗费能源多、所需设备复杂、采用大量的酸碱用量，同时也污染环境。因此，人们开始寻找生物方法脱乙酰基，现在大都采用酶解法，由于至今没有单一、高效，专一性的酶，需要采用复合的酶解，成本较昂贵，而且在酶解过程没有科学、规范化、合适的酶反应系统，离大规模工业化生产尚有一定距离。

发明内容

针对传统的制备方法是脱乙酰基化学法，其生产过程耗费能源多、所需设备复杂、采用大量的酸碱用量，同时也污染环境等问题，以及现在采用的生物酶解法，该生产法缺乏廉价、高效、专一性酶和合理的反应系统，使生产缺乏产业化能力的现状。本发明提供一种用微生物菌发酵生产甲壳低聚糖的方法，该方法利用一种用微生物菌即淡紫拟青霉菌Paecilomyceslilacinus在人为调控条件下耗氧深层发酵降解虾、蟹壳，生产出较高浓度甲壳低聚糖，有效避免了传统甲壳低聚糖生产过程采用大量的酸碱用量，有效地提高了能源的利用率，同时又能实现廉价、低成本工业化生产甲壳低聚糖。

本发明的目的是这样实现的：在用微生物发酵生产甲壳低聚糖的过程中，通过采用特定发酵微生物菌株(Paecilomvceslilacinus三炬03菌株)，菌种专利保藏号CCTCCNO：M2010165)及对该发酵微生物菌株的菌体形态进行控制(添加0.075％Deoxycholicacidsodiumsalt，其中文名为去氧胆酸钠)，来改变发酵代谢平衡，促进胞外几丁质酶的分泌，增加发酵产物甲壳低聚糖的产生，同时通过流加补料方式，来提高发酵产物甲壳低聚糖的浓度，再通过添加表面活性剂(Tween-80)的方式，来确保产物的稳定和促进菌体与产物的分离，最后通过离心除菌、膜过滤或浓缩喷雾干燥、精制等工艺生产出不同质量规格的产品。

本发明用于发酵生产甲壳低聚糖的菌种，该菌为淡紫拟青霉菌(Paecilomvceslilacinus)三炬03菌株，菌种专利保藏号CCTCCNO：M2010165。菌种保藏时间为2010年6月30日，地点为：中国典型培养物保藏中心(武汉大学)

本发明用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，包括如下步骤：

(1)原料配备：将新鲜的虾壳或蟹壳制成含原料2-5％重量比的发酵原液，并灭菌；

(2)菌种制备：将淡紫拟青霉菌(Paecilomvceslilacinus)三炬03菌株由斜面培养逐步转入种子罐培养；

(3)在灭菌后的发酵原液中添加2-10％体积比的种子罐培养液，发酵获得甲壳低聚糖发酵液；

(4)从甲壳低聚糖发酵液中分离提取甲壳低聚糖。

在本发明的较佳实施例中，步骤(1)包括：

a、原料的制备：新鲜的虾壳或蟹壳晒干，粉碎成120目的干粉备用；

b、发酵原液配制：以重量比2-5％的虾、蟹壳粉与水混合均匀，再加入0.01-0.1％蛋白胨、0.1-1％葡萄糖、0.1-1％磷酸二氢钾、0.05-0.5％硫酸镁，制成发酵原液；

c、发酵原液灭菌：采用蒸汽加热灭菌。

在本发明的较佳实施例中，步骤(2)包括：斜面保藏菌种→活化生产斜面→一级三角瓶扩培→二级三角瓶扩培→种子培养→成熟菌种，接种量为5％发酵液量逐级接种。每一级的种子接种之前都要进行菌体形态的观察、纯度的检测，并严格控制逐级接种的菌龄。

在本发明的较佳实施例中，步骤(3)包括：

a、接种发酵：往灭菌好的发酵液中接种入5％种子罐培养好的发酵菌，搅拌通风发酵，刚接种后通风量为1：0.25(v／v.min)，在发酵的过程，根据OD值和二氧化碳的产生量，逐步增加通风量至1：0.35(v／v.min)；

b、加药调控：当OD值达到一定值时，添加入0.075％Deoxycholicacidsodiumsalt(去氧胆酸钠)，再经40min后，把通风量提高到1：0.55(v／v.min)，并逐步提高发酵温度至31℃，在发酵过程定期测定几丁质酶活和还原糖含量，及甲壳低聚糖的生成量；

c、流加补料：当发酵液还原糖的含量达55mg／ml时，开始流加补料，补料成分为10％虾、蟹壳粉和0.1％硫酸镁混合悬浮液。把补料置于流加罐中，通入蒸汽升温至121℃，保温30分钟灭菌，冷却后备用，在发酵的中后期时，按5％的量分三次逐步流加入发酵罐。当还原糖的含量达120mg／ml时，流加入一定量的吐温80，继续发酵到还原糖含量基本稳定(三次测定含量基本一致)时，为发酵结束。发酵结束时，把发酵液的温度冷却到18℃以下；

在本发明的较佳实施例中，前述步骤b中，当发酵微生物菌数量达到一定值时，通过添加药品来调整菌体的形态，达到改变微生物的代谢平衡。当发酵到一定周期时，通过测定OD值来确定药品的添加时间，即：发酵液稀释10倍后，在波长为505nm下测定OD值，当OD值为0.4-0.45时，开始添加抑制剂(0.075％Deoxycholicacidsodiumsalt)，来抑制菌丝的生长，使菌体内蛋白质的代谢平衡发生改变，胞外酶合成加快，几丁质酶(Chitinase)的含量明显增加，这样可显著增加甲壳素的降解速度，产物中甲壳低聚糖的含量得到有效提高。

在本发明的较佳实施例中，步骤(4)包括：

a、离心去菌体：冷却后的发酵液，直接泵入离心机，在离心机5000rpm中，离心30分钟，获得上清液，把上清液泵入储罐中备用，抽样检测含甲壳低聚糖量；

b、膜过滤：把上清液经两道膜过滤可获得较高浓度、较高纯度的甲壳低聚糖。可以选择不同孔径的膜，来进行分离，这样可进一步获得更高纯度和浓度的产品，以适用于不同用途。或

c、真空浓缩：也可把上清液泵入双效蒸发浓缩罐中，进行真空浓缩，浓缩至浓缩液甲壳低聚糖含量在15～20％时，泵入储罐备用；

d、喷雾干燥：将步骤b或c获得的甲壳低聚糖浓缩液，采用喷雾干燥机，通过调节进料口温度为150℃，出料口温度70～75℃，进行喷雾干燥，制得甲壳低聚糖干燥粉产品，甲壳低聚糖收率可达96％以上，水溶性好。

e、产品精制：喷雾干燥的粉末中，还含有一定量的无机盐成分，因此甲壳低聚糖3000～4000分子量的含量纯度为93.6％。该产品作为农用、畜牧食用，纯度已完全可行，如需进一步提高含量，可通过2倍的食用乙醇进行纯化，即可获得99％含量甲壳低聚糖产品，完全水溶。

本发明筛选的微生物菌即淡紫拟青霉菌，能分泌一定量的胞外甲壳素酶，在人为的发酵调控条件下，使其具有持续降解甲壳素的能力，使甲壳素被降解形成一定分子量(3000～4000)和浓度的甲壳低聚糖。在发酵过程中虾、蟹壳(甲壳素)一方面为该菌繁殖提供C／N营养，另一方面转化为发酵代谢产物(甲壳低聚糖)。本发明运用微生物发酵法技术生产甲壳低聚糖，有效避免了传统甲壳低聚糖生产过程采用大量的酸碱用量，有效地提高了能源的利用率，以及避免用酶法较高昂生产成本。可以较廉价地获取纯度较高的甲壳低聚糖产品，该产品可应用于医药、农业、食品等领域。

附图说明

图1为菌株形态，其中A为显微镜(400X)观察照片；B、C分别为平板菌落正面及背面照片；

图2为本发明一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法工艺流程图。

具体实施方式

实施例1

菌种从多种土壤中分离获得多种淡紫拟青霉菌株，用平板分析甲壳降解能力好的菌株，此菌株为来源南靖亚热带原始森林土壤，分离获得的淡紫拟青霉菌株，再通过钴-60和紫外线交替诱变，获取能直接降解虾、蟹壳粉末，形成甲壳低聚糖(3000～4000分子量)产品的新淡紫拟青霉菌株SJ-03，该菌株保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏号：CCTCCNO：M2010165。

其菌株形态见图1.

1)菌株SJ-0318SrRNA序列：

TGGTGATTCATGATAACTTCTCGAATCGCATGGCCTTGCGCCGGCGATGGTTCATTCAAATTTCTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTAGTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTAATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGCACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGCGGGGAAACAGGACTTTTACTTTGAAAAAATTAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATGAAATAGGACGTGCGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGATGTTATTTTTTGACTCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCCGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGGAGCCAGCGAGTACTCCCTTGGCCGGAAGGCCCGGGTAATCTTGTTAAACTCCGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCGTCCGGACTGGCCCAGAGAGG。

菌株SJ-0318SrRNA测序BLAST结果：

2)菌株SJ-0328SrRNA基因序列：

GGCGAGTGAAGCGGCAACAGCTCAAATTTGAAATCTGGCCCCCAGGGCCCGAGTTGTAATTTGCAGAGGATGCTTTTGGCGCGGTGCCTTCCGAGTTCCCTGGAACGGGACGCCATAGAGGGTGAGAGCCCCGTCTGGTCGGACGCCTAGCCTGTGTAAAGCTCCTTCGACGAGTCGAGTAGTTTGGGAATGCTGCTCTAAATGGGAGGTATATGTCTTCTAAAGCTAAATACCGGCCAGAGACCGATAGCGCACAAGTAGAGTGATCGAAAGATGAAAAGCACTTTGAAAAGAGGGTTAAATAGTACGTGAAATTGTTGAAAGGGAAGCGCTTGTGACCAGACTTGGGCCCGGTGGATCATCCAGCGTTCTCGCTGGTGCACTCCGCCGGGTTCAGGCCAGCATCAGTTCGCCGCGGGGGAAAAAGGCTTCGGGAACGTGGCTCCTACGGGAGTGTTATAGCCCGTTGCATAATACCCTGGGGCGGACTGAGGTTCGCGCTCCGCAAGGATGCTGGCGTAATGGTCATCAGCGACCCGTCTTGAAACACGGACCA。

菌株SJ-0328SrRNA基因测序BLAST结果：

菌种鉴定报告--微生物菌株ITS序列的测定与分析

3)菌株SJ-03ITS序列

AACCCACTGTGAACCTTACCTCAGTTGCCTCGGCGGGAACGCCCCGGCCGCCTGCCCCCGCGCCGGCGCCGGACCCAGGCGCCCGCCGCAGGGACCCCAAACTCTCTTGCATTACGCCCAGCGGGCGGAATTTCTTCTCTGAGTTGCACAAGCAAAAACAAATGAATCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTGGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATGTGAATTGCAGAATTCAGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCGCCAGCATTCTGGCGGGCATGCCTGTTCGAGCGTCATTTCAACCCTCGAGCCCCCCCCGGGGGCCTCGGTGTTGGGGGACGGCACACCAGCCGCCCCCGAAATGCAGTGGCGACCCCGCCGCAGCCTCCCCTGCGTAGTAGCACACACCTCGCACCGGAGCGCGGAGGCGGTCACGCCGTAAAACGCCCAACTTTCTTAGAGTTGACCTCGGATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGACGGAGGAA

菌株SJ-03ITS测序BLAST结果

根据上述检测结果，将菌株鉴定为：菌株SJ-03：淡紫拟青霉(Paecilomyceslilacinus)。

实施例2

菌种的制备：从冰箱中取出淡紫拟青霉菌种的保藏斜面，转接到生产斜面上，一股一根保藏斜面转接5根生产斜面，进行菌种活化，再把转接好的生产斜面放入28℃的培养箱中培养3天；当长满斜面后即可接种入一级三角瓶中28℃培养3天，三角瓶中的培养基为3.5％虾、蟹壳粉水悬浮液和0.02％蛋白胨和一些无机盐制成培养基；经镜检如菌丝健壮、无杂菌即可接入二级三角瓶中28℃培养2天，二级三角瓶培养基与一级相同；经镜检如菌丝健壮、无杂菌即可接入种子罐中28℃培养36小时，接种量为5％V／V，同时对接种完的菌液必须留样涂平板，做含菌量、菌落和杂菌污染的观察。

实施例3

将新鲜的虾壳或蟹壳晒干，粉碎成120目的干粉.然后以重量比4.5％的虾、蟹壳干粉与水混合均匀，再加入0.02％蛋白胨、0.5％葡萄糖、0.2％磷酸二氢钾、0.1％硫酸镁，制成发酵原液。

把配制好的发酵原液泵入空灭好的发酵罐中，密闭罐体，加入蒸汽进行灭菌，使料温升至121℃，保温30分钟，然后逐渐冷却至28℃，往灭菌好的发酵液中接种入种子罐培养好的发酵菌，搅拌通风发酵，刚接种后通风量为1：0.25v／v.min，在发酵的过程，根据OD值和二氧化碳的产生量，逐步增加通风量至1：0.35(v／v.min)；当OD值达到一定值时，添加入重量比0.075％Deoxycholicacidsodiumsalt，再经40min后，把通风量提高到1：0.55(v／v.min)，并逐步提高发酵温度至31℃，在发酵过程定期测定几丁质酶活和还原糖含量，及甲壳低聚糖的生成量。

当二氧化碳含量每立方气体体积每增加5克当量时，可通风量就增加0.05v／v.min，同时也要根据参照发酵液的OD值，进行综合判断提高发酵的通风量。对发酵温度也是根据发酵的周期进行逐步提高，分四次提高温度，初温为28℃，10小时第一次提温至29℃，16小时左右第二次提温至29.5℃，20小时左右第三次提温至30℃，28至30小时左右第四次提温至31℃，到发酵结束前再把发酵温度冷却到18℃以下。

当发酵液还原糖的含量达55mg／ml时，开始流加补料，补料成分为10％虾、蟹壳粉和0.1％硫酸镁混合悬浮液。把补料置于流加罐中，通入蒸汽升温至121℃，保温30分钟灭菌，冷却后备用，在发酵的中后期时，按5％的量分三次逐步流加入发酵罐。当还原糖的含量达120mg／ml时，流加入一定量(具体的量为重量比0.068％)的吐温80，继续发酵到还原糖含量基本稳定(三次测定含量基本一致)时，为发酵结束。

发酵结束时，把发酵液的温度冷却到18℃以下，直接泵入离心机，在离心机5000rpm中，离心30分钟，获得上清液，把上清液泵入储罐中备用；发酵液经离心除菌，得到的上清液即为一定浓度的甲壳低聚糖产品。其次可把上清液经两道膜过滤可获得较高浓度、较高纯度的甲壳低聚糖。可以选择不同孔径的膜，来进行分离，这样可进一步获得更高纯度和浓度的产品，以适用于不同用途。或经浓缩罐浓缩，把上清液泵入双效蒸发浓缩罐中，进行真空浓缩，浓缩至浓缩液甲壳低聚糖含量在10～15％时，泵入储罐备用，可使甲壳低聚糖的浓度进一步提高，最后再通过低温喷雾干燥的方法，将甲壳低聚糖制成粉剂。在用喷雾干燥机时，通过调节进料口温度为150℃，出料口温度70～75℃，进行喷雾干燥，制得甲壳低聚糖干燥粉产品，甲壳低聚糖收率可达96％以上，水溶性好。由于喷雾干燥的粉末中，还含有一定量的无机盐成分，因此产品中分子量3000～4000的甲壳低聚糖含量的纯度为93.6％。该产品作为农用、畜牧食用，纯度已完全可行。

实施例4

过程同实施例3基本相同，为提高发酵的效率，通过添加抑制剂来改变发酵代谢平衡，提高产物含量，在发酵过程中通过测定发酵液的OD值来判断添加的时间，把发酵液稀释10倍后，用分光光度计来测定，把分光光度计的波长调为505nm，在此波长下测定OD值，当OD值为0.4-0.45时(该值为经验值，该数据是通过平板计数法来确定在该数值时发酵液中微生物的含量)，开始添加抑制剂(0.075％Deoxycholicacidsodiumsalt)，该抑制剂是用无菌水，在无菌状态下溶解并添加，通过添加抑制剂来抑制菌丝的生长，使菌体内蛋白质的代谢平衡发生改变，胞外酶合成加快，特别是几丁质酶(Chitinase)的含量明显增加，这样可显著增加甲壳素的降解速度，产物中甲壳低聚糖的含量得到有效提高。

实施例5

实施例3结束之后，为进一步提高甲壳低聚糖的含量，可用喷雾干燥完的粉末甲壳低聚糖固体体积1.5倍量的食用乙醇进行溶解，使可溶于乙醇的无机盐和其他可溶性杂质溶于乙醇中，因为甲壳低聚糖不溶于乙醇，搅拌20min，板框过滤，得到干物质，低温抽真空干燥，就可得到99％含量甲壳低聚糖。

Claims (9)

1.用于发酵生产甲壳低聚糖的菌种，该菌为淡紫拟青霉菌(Paecilomvceslilacinus)三炬03菌株，菌种专利保藏号CCTCCNO:M2010165。

2.如权利要求1所述的菌种的用途，其用于发酵生产甲壳低聚糖。

3.一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，包括如下步骤：

(1)原料配备：将新鲜的虾壳或蟹壳制成含原料2-5％重量比的发酵原液，并灭菌；其中，发酵原液的配置如下：以重量比2-5％的虾、蟹壳粉与水混合均匀，再加入0.01-0.1％蛋白胨、0.1-1％葡萄糖、0.1-1％磷酸二氢钾、0.05-0.5％硫酸镁，制成发酵原液；

(2)菌种制备：将权利要求1中的菌种由斜面培养逐步转入种子罐培养；

(3)在灭菌后的发酵原液中添加2-10％体积比的种子罐培养液，发酵获得甲壳低聚糖发酵液；

(4)从甲壳低聚糖发酵液中分离提取甲壳低聚糖。

4.如权利要求3所述的一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，其特征在于，步骤(1)包括：

a、原料的制备：新鲜的虾壳或蟹壳晒干，粉碎成120目的干粉备用；

b、发酵原液配制：以重量比2-5％的虾、蟹壳粉与水混合均匀，再加入0.01-0.1％蛋白胨、0.1-1％葡萄糖、0.1-1％磷酸二氢钾、0.05-0.5％硫酸镁，制成发酵原液；

c、发酵原液灭菌：采用蒸汽加热灭菌。

5.如权利要求3所述的一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，其特征在于，步骤(2)包括：斜面保藏菌种→活化生产斜面→一级三角瓶扩培→二级三角瓶扩培→种子培养→成熟菌种，接种量为5％发酵液量逐级接种。

6.如权利要求3所述的一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，其特征在于，步骤(3)包括：

a、接种发酵：往灭菌好的发酵液中接种入5％种子罐培养好的发酵菌，搅拌通风发酵，刚接种后通风量为1：0.25v/v.min，在发酵的过程，根据OD值和二氧化碳的产生量，逐步增加通风量至1：0.35v/v.min；

b、加药调控：当OD值达到一定值时，添加入0.075％去氧胆酸钠，再经40min后，把通风量提高到1：0.55v/v.min，并逐步提高发酵温度至31℃，在发酵过程定期测定几丁质酶活和还原糖含量，及甲壳低聚糖的生成量；

c、流加补料：当发酵液还原糖的含量达55mg/ml时，开始流加补料，补料成分为10％虾、蟹壳粉和0.1％硫酸镁混合悬浮液；把补料置于流加罐中，通入蒸汽升温至121℃，保温30分钟灭菌，冷却后备用，在发酵的中后期时，按5％的量分三次逐步流加入发酵罐；当还原糖的含量达120mg/ml时，流加入适量的吐温80，继续发酵到还原糖含量基本稳定时，为发酵结束；发酵结束时，把发酵液的温度冷却到18℃以下。

7.根据权利要求6所述的一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，其特征在于：步骤b中，发酵液稀释10倍后，在波长为505nm下测定OD值，当OD值为0.4-0.45时，开始添加抑制剂0.075％去氧胆酸钠，来抑制菌丝的生长，使菌体内蛋白质的代谢平衡发生改变。

8.如权利要求3所述的一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，其特征在于，步骤(4)包括：

a、离心去菌体：冷却后的发酵液，直接泵入离心机，在离心机5000rpm中，离心30分钟，获得上清液，把上清液泵入储罐中备用，抽样检测含甲壳低聚糖量；

b、膜过滤：把上清液经两道膜过滤获得较高浓度、较高纯度的甲壳低聚糖；或

c、真空浓缩：把上清液泵入双效蒸发浓缩罐中，进行真空浓缩，浓缩至浓缩液甲壳低聚糖含量在15～20％时，泵入储罐备用；

d、喷雾干燥：将步骤b或c的甲壳低聚糖浓缩液，采用喷雾干燥机，通过调节进料口温度为150℃，出料口温度70～75℃，进行喷雾干燥，制得甲壳低聚糖干燥粉产品。

9.如权利要求8所述的一种用微生物发酵生产甲壳低聚糖的方法，其特征在于，步骤(4)还包括：

e、产品精制：通过2倍的食用乙醇进行纯化，获得99％含量甲壳低聚糖产品，完全水溶。