CN107746810A - 一种有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及液体培养提高桑黄菌丝体产量的有效方法。原料包括玉米淀粉、豆粕粉、低分子量壳寡糖与无机盐。通过在液体条件下先用中性蛋白酶、淀粉酶与纤维素酶分别对玉米淀粉、豆粕粉进行酶解处理，制备处理液。再将酶解处理液与壳寡糖、无机盐配制培养基，接种桑黄种子，控制培养条件，采用分批补料方式，液体发酵获得桑黄菌丝体。方法包括原料酶解预处理、培养基制备、发酵培养等步骤。本发明易操作，工艺稳定，菌丝体得率高，生产成本低，易于产业化和市场化。

Description

一种有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法
技术领域
本发明涉及有效提高桑黄菌丝体产量的液体发酵培养方法，属于微生物工程领域。
背景技术
桑黄是一种大型珍稀药用真菌，其主要有抗肿瘤、保肝抗肝、抗诱变与突变等药理，可用于治疗血崩、血淋、脱肛泻血、带下、闭经、脾虚泄泻、降血糖等功效。在国际医药市场上价格昂贵、供不应求。随着桑黄的用量日益加大，各产地对野生资源掠夺式收购，天然野生的桑黄资源数量越来越少。由于受生理状态的特殊性、复杂性以及环境的制约，桑黄在自然界中形成可用子实体需要多年。所以人工培养大量菌丝体代替子实体已成为趋势，对于保护天然资源、解决资源匮乏、满足市场需要、提高经济效益，均具有重要的意义。
人工培养桑黄菌丝体的方式有固体培养与液体培养两种。固体培养需20～30天获得大量菌丝体，同时需要较大的空间，且条件难以控制。而液体发酵一般需要6～10天，是在生化反应器内、通过控制最佳条件来培养菌丝体，生产工艺容易控制且规范。目前人工液体培养研究主要是对桑黄菌丝生长的培养基组分和生长条件进行了探索，而确定培养技术，但存在一些不足或弊端，如接种量大，种子培养规模大，10％，甚至15％-20％，更大规模的培养则受到种子量的限制，导致成本大；另培养周期长，6-7天，甚至达10天，增加了染菌的风险，同时水电汽等能耗增大。
针对上述液体培养技术上存在的不足或弊端，提出了一种提高桑黄液态培养菌丝体产量、缩短发酵周期的有效方法。
发明内容
发明目的：提供一种有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的制备方法，实现稳定、高效地获得高产量的桑黄菌丝体，具有抗肿瘤、保肝抗肝、抗诱变、降血糖等功效。
技术方案：
一种有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法，包括下述步骤：
A.取玉米淀粉15～20重量份，加100重量份水，搅拌均匀，升温到50℃，加0.1份中性蛋白酶与0.5重量份淀粉酶进行酶解预处理，将淀粉与蛋白分解成小分子量的寡糖与寡肽；再取豆粕粉10～15重量份，加100重量份水，搅拌均匀，升温到45℃，加0.4～0.5重量份中性蛋白酶与0.1重量份纤维素酶进行酶解预处理，将蛋白分解成寡肽及降解纤维素成寡糖，将两种原料的酶解处理液混合，用于配制液体培养基，供菌种发酵；
B.培养基配制：包括PDA斜面培养基100ml、液体摇瓶培养基1000ml与发酵培养基40L；
C.菌种的活化：将桑黄菌种接种到PDA斜面培养基上活化，然后取一小块活化菌种接种到液体摇瓶种子培养基中培养，获得摇瓶种子培养物；
D.发酵培养：将上述获得的桑黄菌种子培养物接种于经灭菌处理的发酵培养基，进行深层液体发酵，获得发酵培养物；
E.分离过滤：将发酵好的发酵培养物进行固液分离，收集桑黄菌的菌丝体；E.菌丝干燥：将得到的菌丝体经低温干燥，获得菌丝体产品。
所述有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法，所选菌种为桑黄Phellinusigniarius。
所述有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法，所用的原料壳寡糖的分子量为500-1000。
所述有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法，玉米粉预处理液与豆粕粉处理液按1:1比例混匀，部分用作起始培养基，其用量为两种预处理液混合总量的40-42.5％，剩余57.5-60％的混合量采用分批补料方式，分4-6次加入，发酵3-4天结束。
所述有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法，按重量计：菌丝体量干重为25-30g/L。
桑黄拉丁名为Phellinus igniarius，购自华中农业大学菌种实验中心，中性蛋白酶、淀粉酶及壳寡糖为市场采购。
有益效果：1、材料来源易得稳定；2、桑黄菌可有效利用酶解处理后的原料，生长速度快，菌丝体产量高；3、工艺稳定，易操作，生产成本低，易于产业化和市场化。
具体实施方式
以下通过实施例形式对本发明的上述内容再作进一步的详细说明，但不应将此理解为本发明上述主题的范围仅限于以下的实施例，凡基于本发明上述内容所实现的技术均属于本发明的范围。
本发明所述的有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法是经过大量筛选试验得到的最优方案，结合具体实施方式，对本发明进一步说明如下：
实施例一：
1.PDA斜面培养基制备与斜面菌种培养：200g去皮土豆，切片加1000mL水，煮沸30min，过滤收集滤液，定容到1000mL，加蔗糖20g，KH2PO4 1g，K2HPO4 0.5g，MgSO4·7H2O1g，琼脂20g；pH 6.5；琼脂溶化后装入试管，为试管高度的1/3；115℃灭菌30min，制成斜面培养基；将桑黄菌菌种接种到PDA斜面培养基上28℃条件下培养7～10天，获得斜面菌种；
2.玉米粉与豆粕粉预处理：100L容器内加入15～20公斤玉米粉，搅拌均匀，升温到50℃并维持，分别加入100g中性蛋白酶(酶活性为5万U/g)与500g淀粉酶(酶活性为2万U/g)，100rpm搅拌，作用2-3h，制得玉米粉预处理液；100L容器内加入10～15公斤豆粕粉，搅拌均匀，升温到45℃并维持，分别加入400～500g中性蛋白酶(酶活性为5万U/g)与100g纤维素酶(酶活性为1万U/g)，100rpm搅拌，作用4-5h，制得豆粕粉处理液；将玉米粉预处理液与豆粕粉处理液按1:1比例混匀，为桑黄发酵所需的主要碳氮源。
3.液体种子培养基制备与液态三角瓶种子培养：200g去皮土豆，切片加800mL水，煮沸30min，过滤收集滤液，定容到800mL，加玉米粉预处理液150ml与豆粕粉预处理液50ml，KH2PO4 1～3g，K2HPO40.5～1g，MgSO4·7H2O 1～3g；pH 6.5～8；115℃灭菌25～30min。将斜面菌种取1～3小块到液体种子培养基中，在25～28℃，200r/min条件下培养7天，获得三角瓶种子培养物；
4.发酵液体初始培养基制备：在50L容器内，加入玉米粉预处理液与豆粕粉处理液的混合液20L，再加入0.1千克壳寡糖与无机盐(含0.05千克磷酸二氢钾、0.03千克硫酸镁、0.03千克硫酸锰、0.02千克硫酸锌、0.02千克硫酸钾、0.02千克氯化钙)，搅拌溶解均匀，最后补水30L。
5.桑黄菌液体发酵：采用100L发酵罐，装料系数50％，先装入发酵液初始培养基50L，121℃灭菌30min；接入液态三角瓶种子2L，温度26～28℃，pH 5.5～6.5，溶氧20％～40％，搅拌转速300rpm。发酵40h后，按每5h补入1:1混匀的玉米粉预处理液与豆粕粉处理液(需预先灭菌)5L，共补料6次，第6次补料后继续发酵10h，发酵结束，前后总发酵时间75h；
6.桑黄菌丝体的分离：发酵结束后，采用板框过滤的方式，进行固液分离，获得桑黄菌丝体。
7.得到的菌丝体经低温干燥，获得菌丝体干重为26g/L。
实施例二：
1.PDA斜面培养基制备与斜面菌种培养，玉米粉与豆粕粉预处理同实施例一；
2.液体种子培养基制备与液态三角瓶种子培养：
玉米粉预处理液500ml与豆粕粉预处理液500ml，壳寡糖2～5g，KH2PO4 1～3g，K2HPO40.5～1g，MgSO4·7H2O 1～3g；pH 6.5～8；115℃灭菌25～30min。将斜面菌种取2～3小块到液体种子培养基中，在26℃，200r/min条件下培养5天，获得三角瓶种子培养物；
4.发酵液体初始培养基制备：在50L容器内，加入玉米粉预处理液与豆粕粉处理液的混合液30L，再加入0.2千克壳寡糖与无机盐(含0.05千克磷酸二氢钾、0.02千克硫酸镁、0.02千克硫酸锰、0.015千克硫酸锌、0.02千克硫酸钾、0.02千克氯化钙)，搅拌溶解均匀，最后补水20L。
5.桑黄菌液体发酵：采用100L发酵罐，装料系数50％，先装入发酵液初始培养基50L，121℃灭菌30min；接入液态三角瓶种子5L，温度26～28℃，pH 5.5～6.5，溶氧20％～40％，搅拌转速300rpm。发酵40h后，按每8h补入1:1混匀的玉米粉预处理液与豆粕粉处理液(需预先灭菌)10L，共补料4次，第4次补料后继续发酵10h，发酵结束，前后总发酵时间82h；
6.桑黄菌丝体的分离：板框过滤的方式，固液分离，获得桑黄菌丝体。
7.得到的菌丝体经低温干燥，获得菌丝体干重为30g/L。

Claims (5)

1.一种有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法，其特征在于，包括下述步骤：
A.取玉米淀粉15～20重量份，加100重量份水，搅拌均匀，升温到50℃，加0.1份中性蛋白酶与0.5重量份淀粉酶进行酶解预处理，将淀粉与蛋白分解成小分子量的寡糖与寡肽；再取豆粕粉10～15重量份，加100重量份水，搅拌均匀，升温到45℃，加0.4～0.5重量份中性蛋白酶与0.1重量份纤维素酶进行酶解预处理，将蛋白分解成寡肽及降解纤维素成寡糖，将两种原料的酶解处理液混合，用于配制液体培养基，供菌种发酵；
B.培养基配制：包括PDA斜面培养基100ml、液体摇瓶培养基1000ml与发酵培养基40L；
C.菌种的活化：将桑黄菌种接种到PDA斜面培养基上活化，然后取一小块活化菌种接种到液体摇瓶种子培养基中培养，获得摇瓶种子培养物；
D.发酵培养：将上述获得的桑黄菌种子培养物接种于经灭菌处理的发酵培养基，进行深层液体发酵，获得发酵培养物；
E.分离过滤：将发酵好的发酵培养物进行固液分离，收集桑黄菌的菌丝体；E.菌丝干燥：将得到的菌丝体经低温干燥，获得菌丝体产品。
2.根据权利要求1所述有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法，其特征在于，所选菌种为桑黄Phellinus igniarius。
3.根据权利要求1所述有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法，其特征在于，所用的原料壳寡糖的分子量为500-1000。
4.根据权利要求1所述有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法，其特征在于，玉米粉预处理液与豆粕粉处理液按1:1比例混匀，部分用作起始培养基，其用量为两种预处理液混合总量的40-42.5％，剩余57.5-60％的混合量采用分批补料方式，分4-6次加入，发酵3-4天结束。
5.根据权利要求1所述有效提高桑黄液态培养菌丝体产量的方法，其特征在于，按重量计：菌丝体量干重为25-30g/L。
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