CN105132311B - 利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法，属于微生物领域。该方法包括a、以谷胱甘肽废液为种子培养基有效成分，分别对地衣芽胞杆菌种子液、产朊假丝酵母菌种子液、嗜酸乳杆菌种子液及枯草芽孢杆菌种子液进行种子罐培养；b、以谷胱甘肽废液为发酵罐培养基有效成分，进行发酵罐发酵，得到功能发酵液。与现有技术相比，本发明所述方法利用谷胱甘肽废液生产功能微生物，具有成本较低、产品多元化、经济价值高、废弃物再生利用率高等特点，具有极其广泛的应用价值。

Description

利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法

技术领域

本发明涉及微生物领域，具体地说是利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法。

背景技术

谷胱甘肽，一般指还原性谷胱甘肽(Glutathione，GSH)，它是一种广泛存在于人体正常细胞内的生物活性物质，是人类细胞中自然合成的含量最丰富的含巯基的低分子三肽，临床证明还原性谷胱甘肽是一种用途广泛的小分子肽类活性物质，具有重要的抗氧化和整合解毒作用，用于病毒性、药物毒性、酒精毒性及其它化学物质引起的肝脏损害，也是癌症患者放化疗时的辅助治疗药物，对急性贫血、成人呼吸窘迫综合症、败血症联合治疗有着积极的作用。

目前，谷胱甘肽制备方法主要有溶剂提取法、化学合成法、酶合成法、微生物发酵法。溶剂提取法主要利用小麦胚芽、酵母为原料，虽然已经工业化，但工艺较落后，生产规模小且产量低，而且产品质量不高；化学合成法主要利用谷氨酸、半胱氨酸、甘氨酸为原料，工艺较成熟，但存在成本高、反应步骤多、反应时间长、操作复杂的缺点，同时产物为谷胱甘肽的左旋体和右旋体的混合物，化学拆分困难，由此造成了产品纯度不高，并且环境污染很严重限制了该方法的应用；酶合成法主要是以谷氨酸、半管氨酸、甘氨酸为底物，利用谷胱甘肽合成酶，加入ATP合成，处于研究阶段，虽然酶法生产工艺明确，产品纯度较高，但是操作复杂，而且需要底物氨基酸和昂贵的ATP，因此生产成本很高。

微生物发酵法生产谷胱甘肽主要以糖类为原料，利用酵母和大肠杆菌体内物质代谢来获得谷胱甘肽，具有反应条件温和、成本低、生产效率快等优点，其生产过程为：无菌条件下接入种子液，在一定温度下，通风培养，得到含有谷胱甘肽的发酵液，将发酵液离心过滤(1)，得到含有谷胱甘肽的菌体，将洗涤好的菌体制成菌悬液，离心过滤(2)，取滤液加入适量物料反应生成沉淀，将沉淀制成混悬液，离心过滤(3)，将滤液脱色、浓缩、结晶、离心(4)得到谷胱甘肽湿晶体，最后用真空干燥得到谷胱甘肽干品。

微生物发酵法生产谷胱甘肽过程中的设备清洗废水、发酵液离心后的残液、地面冲洗废水、离心结晶母液等各种废水共同构成谷胱甘肽发酵生产废液。各种废液直接排放不仅会严重污染环境，而且造成资源浪费。利用传统的物化处理技术、生物处理技术如凝聚法、蒸发浓缩法、吸附法、活性污泥法、生物活性炭法、生物膜法等进行废水处理，虽然能够达标，但是基建投资及运行维护费用高，工艺复杂，废弃物再生利用率低，易产生二次污染。

谷胱甘肽废液资源化是谷胱甘肽企业可持续发展的最佳战略，但相关研究成果还未见报道。

发明内容

本发明的技术任务是针对上述现有技术的不足，提供利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法。

谷胱甘肽废液中含有大量的氨基酸、糖类、粗蛋白、营养盐等营养成分，经过申请人大量实验验证得到，将谷胱甘肽废液应用于微生物生产中，可达到意想不到的技术效果。

本发明的技术任务是按以下方式实现的：利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法，包括以下步骤：

a、以谷胱甘肽废液为种子培养基有效成分，分别对地衣芽胞杆菌种子液、产朊假丝酵母菌种子液、嗜酸乳杆菌种子液及枯草芽孢杆菌种子液进行种子罐培养，得到地衣芽胞杆菌种子罐培养液、产朊假丝酵母菌种子罐培养液、嗜酸乳杆菌种子罐培养液及枯草芽孢杆菌种子罐培养液；

b、将步骤(a)得到的地衣芽胞杆菌种子罐培养液、产朊假丝酵母菌种子罐培养液、嗜酸乳杆菌种子罐培养液及枯草芽孢杆菌种子罐培养液混合后，以谷胱甘肽废液为发酵罐培养基有效成分，对混合液进行发酵罐发酵，得到功能发酵液；

c、步骤b所得发酵液经过处理，得到功能微生物产品。

上述方法中，地衣芽胞杆菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC23584；嗜酸乳杆菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC6074)；产朊假丝酵母菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC31188)；枯草芽孢杆菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC20872)。

作为优选，所述谷胱甘肽废液为微生物发酵法生产谷胱甘肽过程中发酵液离心后的残液，即背景技术中所述的发酵液离心过滤(1)的残液。其主要营养物质及其含量为：氮1.48g/100mL～1.55g/100mL；磷0.096g/100mL～0.12g/100mL；钾3.0g/100m～3.08g/100mL；有机质40.35g/100mL～41.0g/100mL；氨基酸总量4.9～5.02g/100mL；粗蛋白含量14.86～15.31g/100mL；可溶性固形物含量38.0g/100mL～38.86g/100mL，含糖量17.85g/100mL～18.24g/100mL，pH5.0～5.5g/100mL；水分53.50％～55.20g/100mL。

为了更好地适应培养需要，种子培养基的制备方法优选为：将谷胱甘肽废液加纯水稀释5～20倍，在pH5.5～7.2，121℃～125℃，0.103MPa～0.168MPa条件下灭菌0.5～1h，降温至27～36℃即完成制备过程。

作为优选：利用种子培养基对地衣芽胞杆菌种子液进行种子罐培养时，种子罐的培养基装料量控制在种子罐公称容积的50％～75％，最佳60％，接种量控制在种子罐实际装料量的0.5％～2％，发酵温度控制在28～31℃，最佳30℃；pH控制在6.8～7.2，最佳7.0；搅拌转速控制在160～180r/min，最佳170r/min；通气量控制在1VVm～2VVm，最佳1.5VVm；培养18h～26h，最佳24h；

利用种子培养基对产朊假丝酵母菌种子液进行种子罐培养时，种子罐的培养基装料量控制在种子罐公称容积的50％～75％，最佳60％，接种量控制在种子罐实际装料量的0.5％～2％，发酵温度控制在27～30℃，最佳28℃；pH控制在5.8～6.2，最佳6.0；搅拌转速控制在190～220r/min，最佳200r/min；通气量控制在1VVm～2VVm，最佳1.5VVm；培养20h～26h，最佳24h；

利用种子培养基对嗜酸乳杆菌种子液进行种子罐培养时，种子罐的培养基装料量控制在种子罐公称容积的50％～75％，最佳60％，接种量控制在种子罐实际装料量的0.5％～2％，发酵温度控制在35～37℃，最佳36℃；pH控制在5.6～6.0，优选5.8；搅拌转速控制在135～160r/min，优选150r/min；不通气，培养23h～36h，优选30h；

利用种子培养基对枯草芽孢杆菌种子液进行种子罐培养时，种子罐的培养基装料量控制在种子罐公称容积的50％～75％，最佳60％，接种量控制在种子罐实际装料量的0.5％～2％，发酵温度控制在28～30℃，最佳29℃；pH控制在7.0～7.2，最佳7.2；搅拌转速控制在135～160r/min，最佳150r/min；通气量控制在1VVm～3VVm，最佳1.5VVm；培养24h～36h，最佳30h。

种子罐培养时使用的种子液体，可通过现有技术中公知的菌种种子液制备方法得到。例如，可以首先对保藏菌种进行斜面活化，然后对活化后的菌种进行三角瓶种子制备。菌种活化、三角瓶种子制备时所使用培养基的类型、成分不影响本发明技术效果的实现。

为了更好地适应培养需要，发酵罐培养基的制备方法优选为：将谷胱甘肽废液加纯水稀释5～20倍，在pH5.5～7.2，121℃～125℃，0.103MPa～0.168MPa条件下灭菌0.5～1h，降温至27～36℃即完成制备过程。

作为优选：利用发酵罐培养基对混合液进行发酵罐发酵时，地衣芽胞杆菌种子罐培养液、产朊假丝酵母菌种子罐培养液、嗜酸乳杆菌种子罐培养液及枯草芽孢杆菌种子罐培养液的接种量分别控制在发酵罐实际装料量的1％～5.0％，发酵温度控制在25～35℃，最佳30℃，pH控制在6.0～7.0，最佳6.2，搅拌转速控制在150～250r/min，最佳200r/min，间歇搅拌通气，培养24h～48h，最佳36小时。

进一步的，进行发酵罐发酵时，地衣芽胞杆菌种子罐培养液、产朊假丝酵母菌种子罐培养液、嗜酸乳杆菌种子罐培养液及枯草芽孢杆菌种子罐培养液按照等比例接入发酵罐中，各培养液的接种量最佳为2.5％，总接种量为发酵罐实际装料量的10％。

作为优选，间歇搅拌通气的具体操作方法为：在发酵开始时，同时关闭搅拌和所有阀门，24h后打开放气阀，调节放气阀的开关幅度控制发酵罐罐压0.02～0.03MPa，以后每6小时同时开启搅拌和通气，搅拌和通气时间为30min，放气阀一直为打开状态，通过调节放气阀的开关幅度，将发酵罐罐压保持在0.02～0.03MPa，通气量控制在1VVm～3VVm。

发酵罐发酵过程中可以对发酵液进行检测，检测频率优选为：接种后4h后开始，每隔2h进行一次取样，检测活菌数、pH指标，至24h后，取样时间间隔缩短至0.5～1h；发酵液检测指标：pH4.5～5.5；地衣芽胞杆菌含菌量≥12.5×10⁸CFU/mL；枯草芽孢杆菌含菌量≥12×10⁸CFU/mL；产朊假丝酵母菌含菌量≥6.5×10⁸CFU/mL；嗜酸乳杆菌含菌量≥25×10⁸CFU/mL；总活菌数≥56× 10⁸CFU/mL。

步骤c中，发酵液可以直接进行灌装，成为瓶装液体活菌微生物产品，也可以与吸附载体充分混合后，经烘干得到固体型微生物产品。

上述吸附载体可以是现有技术中任意一种粉剂型吸附载体。优选为脱脂米糠、小麦麸皮、玉米麸皮、麦芽糊精、稻壳粉、玉米芯粉中的一种或两种以上物质的混合物。吸附载体的粒度在80～30筛目之间，即0.177～0.6mm之间；含水量8％～10％，不高于12％。

发酵液与吸附载体的混合比例为1:4～1:5(重量比)，混合均匀度CV≤5％，混合物料水分控制在20％～25％范围内，要求地衣芽胞杆菌含菌量≥2.5×10⁸CFU/mL；枯草芽孢杆菌含菌量≥2.5×10⁸CFU/mL；产朊假丝酵母菌含菌量≥2.5×10⁸CFU/mL；嗜酸乳杆菌含菌量≥4.5×10⁸CFU/mL；总活菌数≥12×10⁸CFU/mL。

混合物料烘干时，烘干托盘物料厚度优选为3～5cm，每1.5～2.5h翻动一次，温度控制在35～40℃，抽湿烘干时间控制在18～22小时，烘干后的固体功能微生物产品水分控制在8％～10％；pH4.5～5.5；地衣芽胞杆菌含菌量≥2.0×10⁸CFU/mL；枯草芽孢杆菌含菌量≥2.0×10⁸CFU/mL；产朊假丝酵母菌含菌量≥2×10⁸CFU/mL；嗜酸乳杆菌含菌量≥4×10⁸CFU/mL；总活菌数≥10×10⁸CFU/mL。

本发明利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法与现有技术相比具有以下突出的有益效果：

(一)利用谷胱甘肽废液为原料来生产功能微生物，变废为宝，解决了环境污染问题，能够促进动植物的生长，并提高动植物的抗病能力，从而延伸了谷胱甘肽产业链，提高了谷胱甘肽废弃物的综合利用率和附加值；

(二)省去了谷胱甘肽废液的脱色、脱盐预处理工序，也不需额外添加其他的营养物质，仅仅是将谷胱甘肽废液稀释后即可作为液体种子培养基和液体发酵培养基，原料成本投资低；

(三)运用生物仿生学原理，调节发酵过程中的微生态环境，将好氧菌和厌氧菌混合培养扩增，互惠共生，互不拮抗，使功能微生物由随机变为可控有序状，最大程度的发挥群体生态学优势效应，生成集多功能于一体的混合发酵物，不仅含活菌剂，还包含多糖、多肽氨基酸、酶等活性产物。相对于将单个菌种单独发酵后再混合使用，本发明节约了时间和成本，最大限度提高了功能微生物定植效益，解决了产品性能质量不稳定，保质期短的难题。

具体实施方式

以具体制备实施例、实验例对本发明的利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法作以下详细地说明。

制备实施例一：

地衣芽胞杆菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC23584；

嗜酸乳杆菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC6074)；

产朊假丝酵母菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC31188)；

枯草芽孢杆菌(提供形式：安瓿管冻干粉)购买至中国工业微生物菌种保藏管理中心，编号CICC20872)。

1)菌种活化

(1-1)地衣芽胞杆菌菌种活化

斜面培养基制备：蛋白胨0.5％，牛肉浸取物0.3％，NaCl 1.5％，琼脂1.5％，pH7.0，121℃，0.103MPa，灭菌30min，无菌条件下制备斜面试管。

活化方法：无菌条件下，将冷冻保藏管中的地衣芽胞杆菌菌种接种到斜面中，30℃条件下活化48h，得到斜面菌种或菌种斜面。

(1-2)产朊假丝酵母菌菌种活化

斜面培养基制备：5°Bé麦芽汁，琼脂1.5％，自然pH，121℃，0.103MPa，灭菌30min，无菌条件下制备斜面试管。

活化方法：无菌条件下，将冷冻保藏管中的产朊假丝酵母菌接种到斜面中，28℃条件下活化48h，得到斜面菌种或菌种斜面。

(1-3)嗜酸乳杆菌菌种活化

斜面培养基制备：酪蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，葡萄糖0.5％，乙酸钠0.5％，柠檬酸二铵0.2％，Tween800.1％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄·7H₂O 0.02％， CaCO₃2％，琼脂1.5％，pH6.8，121℃，0.103MPa，灭菌30min，无菌条件下制备斜面试管。

活化方法：无菌条件下，将冷冻保藏管中的嗜酸乳杆菌接种到斜面中，36℃条件下活化36h，得到斜面菌种或菌种斜面。

(1-4)枯草芽孢杆菌菌种活化

斜面培养基制备：蛋白胨0.5％，牛肉浸取物0.3％，NaCl0.5％，琼脂1.5％，pH7.0，121℃，0.103MPa，灭菌30min，无菌条件下制备斜面试管。

活化方法：无菌条件下，将冷冻保藏管中的枯草芽孢杆菌接种到斜面中，29℃条件下活化24h，得到斜面菌种或菌种斜面。

2)三角瓶种子制备

(2-1)地衣芽胞杆菌三角瓶种子液制备

三角瓶液体培养基制备：蛋白胨0.5％，牛肉浸取物0.3％，NaCl 1.5％，MnSO₄·H₂O5ppm，pH7.0，121℃～125℃，0.103MPa～0.168MPa，灭菌30min。

三角瓶种子液制备方法：无菌条件下，取1～2环经步骤(1-1)活化的地衣芽胞杆菌斜面菌种，接入装量为30mL液体培养基的250mL三角瓶中，置于170r/min中摇床中，pH7.0，30℃恒温培养24h，得到地衣芽胞杆菌三角瓶种子液。

(2-2)产朊假丝酵母菌三角瓶种子液制备

三角瓶液体培养基制备：5°Bé麦芽汁，自然pH，121℃，0.103MPaMPa，灭菌30min。

三角瓶种子液制备方法：无菌条件下，取一环经步骤(1-2)活化的产朊假丝酵母菌斜面菌种，接入装量为50mL液体培养基的250mL三角瓶中，置于200r/min中摇床中，28℃恒温培养24h，得到产朊假丝酵母菌三角瓶种子液。

(2-3)嗜酸乳杆菌三角瓶种子液制备

三角瓶液体培养基制备：酪蛋白胨1％，牛肉膏1％，酵母粉0.5％，葡萄糖0.5％，乙酸钠0.5％，柠檬酸二铵0.2％，Tween800.1％，K₂HPO₄0.2％，MgSO₄·7H₂O0.02％，CaCO₃2％，pH6.2，121℃，0.103MPa，灭菌30min。

三角瓶种子液制备方法：无菌条件下，取一环经步骤(1-3)活化的嗜酸乳杆菌菌斜面菌种，接入装量为35mL液体培养基的250mL三角瓶中，置于150r/min中摇床中，36℃封口培养30h，得到嗜酸乳杆菌菌三角瓶种子液。

(2-4)枯草芽孢杆菌三角瓶种子液制备

三角瓶液体培养基制备：蛋白胨0.5％，牛肉浸取物0.3％，NaCl0.5％，MnSO₄·H₂O5ppm，pH7.2，121℃，0.103MPa，灭菌30min。

三角瓶种子液制备方法：无菌条件下，取一环经步骤(1-4)活化的枯草芽孢杆菌斜面菌种，接入装量为35mL液体培养基的250mL三角瓶中，置于150r/min中摇床中，29℃恒温培养30h，得到枯草芽孢杆菌三角瓶种子液。

3)种子罐培养

谷胱甘肽废液来自山东金城生物药业有限公司，是谷胱甘肽发酵液离心后的残液，经山东省农业科学院农业资源与环境研究所检测，其成分组成：氮1.51g/100mL；磷0.10g/100mL；钾3.05g/100mL；有机质40.75g/100mL；可溶性固形物含量38.4g/100mL，含糖量18g/100mL，pH5.11；水分54.34％。

经农业部都市农业(北方)重点实验室日历L-8900高速氨基酸自动分析仪检测，其18种氨基酸和粗蛋白含量分析见表1：

表1谷胱甘肽废液中的18种氨基酸和粗蛋白含量分析

(3-1)地衣芽胞杆菌种子罐培养

种子罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释10倍，pH控制在7.0，121℃，0.103MPa，灭菌1h，降温至30℃，备用。

种子罐培养过程：种子罐的装料量控制在种子罐公称容积的60％，在无菌条件下，取经步骤(2-1)制备的地衣芽胞杆菌三角瓶种子液接入种子罐中，接种量控制在种子罐实际装料量的1％，发酵温度控制在30℃，pH控制在7.0，搅拌转速控制在170r/min，通气量控制在1.5VVm[指单位时间(min)单位种子液体积(m³)通入的标准状态下的空气体积(m³)]，培养24h，得到地衣芽胞杆菌种子罐培养液，培养结束时，测得芽孢形成率为82.5％，活菌数为10.25×10⁸CFU/mL，杂菌污染率为0.3％。

(3-2)产朊假丝酵母菌种子罐培养

种子罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释10倍，pH6.0，121℃，0.103MPa，灭菌1h，降温至28℃，备用。

种子罐培养过程：种子罐的装料量控制在种子罐公称容积的60％，在无菌条件下，取经步骤(2-2)制备的产朊假丝酵母菌三角瓶种子液接入种子罐中，接种量控制在种子罐实际装料量的1％，发酵温度控制在28℃，pH控制在6.0，搅拌转速控制在200r/min，通气量控制在1.5VVm[指单位时间(min)单位种子液体积(m³)通入的标准状态下的空气体积(m³)]，培养24h，得到产朊假丝酵母菌种子罐培养液，培养结束时测得活菌数为5.18×10⁸CFU/mL，杂菌污染率为0.28％。

(3-3)嗜酸乳杆菌种子罐培养

种子罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释10倍，pH6.2，121℃，0.103MPa，灭菌1h，降温至36℃，备用。

种子罐培养过程：种子罐的装料量控制在种子罐公称容积的60％，在无菌条件下，取经步骤(2-3)制备的嗜酸乳杆菌三角瓶种子液接入种子罐中，接种量控制在种子罐实际装料量的2％，发酵温度控制在36℃，pH控制在6.2，搅拌转速控制在150r/min，不通气，培养30h，得到嗜酸乳杆菌种子罐培养液，培养结束时测得活菌数为22.07×10⁸CFU/mL，杂菌污染率为0.2％。

(3-4)枯草芽孢杆菌种子罐培养

种子罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释10倍，pH7.2，121℃℃，0.103MPaMPa，灭菌1h，降温至29℃，备用。

种子罐培养方法：种子罐的装料量控制在种子罐公称容积的60％，在无菌条件下，取经步骤(2-4)制备的枯草芽孢杆菌三角瓶种子液接入种子罐中，接种量控制在种子罐实际装料量的1.5％，发酵温度控制在29℃，pH控制在7.2，搅拌转速控制在150r/min，通气量控制在1.5VVm[指单位时间(min)单位种子液体积(m³)通入的标准状态下的空气体积(m³)]，培养30h，得到枯草芽孢杆菌种子罐培养液，培养结束时测得芽孢形成率为92.6％，含菌量为10.94×10⁸CFU/mL，杂菌污染率为0.2％。

4)发酵罐发酵

发酵罐液体培养基制备：谷胱甘肽废液用纯水稀释10倍，pH6.0～7.0，121℃～125℃，0.103MPa～0.168MPa，灭菌0.5～1h，降温至25～35℃，备用。

发酵罐培养方法：发酵罐的体积为5m³， 装料量为3m³，在无菌条件下，取经步骤3)制备的枯草芽孢杆菌种子罐培养液75L、地衣芽胞杆菌种子罐培养液75L、嗜酸乳杆菌种子罐培养液75L、产朊假丝酵母菌种子罐培养液75L共计300L接入发酵罐中，发酵温度控制在30℃，pH控制在6.2。在发酵开始时，同时关闭搅拌和所有阀门，24h后打开放气阀，调节放气阀的开关幅度控制发酵罐罐压0.025MPa，以后每6小时同时开启搅拌和通气，搅拌和通气时间为30min，放气阀一直为打开状态，通过调节放气阀的开关幅度，将发酵罐罐压保持在0.025MPa，通气量控制在1.5VVm，保持发酵36h，得到发酵液。发酵液指标：pH5.02；地衣芽胞杆菌含菌量12.53×10⁸CFU/mL；枯草芽孢杆菌含菌量12.26×10⁸CFU/mL；产朊假丝酵母菌含菌量6.61×10⁸CFU/mL；嗜酸乳杆菌含菌量25.29×10⁸CFU/mL；总活菌数56.69×10⁸CFU/mL；砷盐0.3mg/Kg；重金属0.35mg/Kg；霉菌数10CFU/mL；大肠杆菌6CFU/100mL；沙门氏菌无检出；外观、气味具有酸香味的深棕色液体；

5)发酵液经过全自动灌装生产线，洗灌装机150瓶/min，2L/瓶，12瓶/箱获得液体型瓶装功能微生物产品，保质期为1年，6个月时检验菌种存活率为85.53％，1年时检验菌种存活率81.68％。

制备实施例二：

卧式双轴桨叶混合机型号SSHJ-4，全体积4m³，每批混合量为2吨，其中装填的麸皮(含水量8.5％)1.7吨，发酵液0.3吨，混合时间60s，从混合机出来的物料水分为21.58％，地衣芽胞杆菌含菌量2.60×10⁸CFU/mL；枯草芽孢杆菌含菌量2.54×10⁸CFU/mL；产朊假丝酵母菌含菌量2.72×10⁸CFU/mL；嗜酸乳杆菌含菌量4.87×10⁸CFU/mL；总活菌数12.73×10⁸CFU/mL

将从混合机出来的物料装入托盘中，每个托盘所装的物料深度为4cm，将托盘送至烘干室立体架上，烘干室12m×12m×3m，每1h翻动物料一次，烘干室温度控制在37℃，烘干时间20h，获得1.7吨干燥后的固体功能微生物产品，外观为酸香味的粉剂产品，水分为8％，地衣芽胞杆菌含菌量2.11×10⁸CFU/mL；枯草芽孢杆菌含菌量2.26×10⁸CFU/mL；产朊假丝酵母菌含菌量2.42×10⁸CFU/mL；嗜酸乳杆菌含菌量4.45×10⁸CFU/mL；总活菌数11.24×10⁸CFU/mL；相比烘干前，总活菌数降低11.70％，砷盐0.25mg/Kg；重金属0.3mg/Kg；霉菌8CFU/mL；大肠杆菌6CFU/100mL；沙门氏菌无检出。经全自动定量包装机生产线，2Kg/袋，12袋/箱，保质期为1年，6个月时检验菌种存活率为90.26％，1年时检验菌种存活率85.66％。

实验例一：

以制备实施例一所得液体型瓶装功能微生物产品与市售购买的其他公司生产的产品进行对比试验。

试验地点：设在济南市农业高新技术产业示范园生菜大棚

试验时间：2014年9月30日至12月18日和2015年3月1日至5月11日。2014年9月30日和2015年3月1日分别进行播种育苗；2014年10月28日和2015年3月25日分别进行定植，定植密度为行、株20～25厘米；2014年12月10日和2015年5月15日分别进行采收。

供试生菜品种：美国大速生。

供试菌肥及试验设计:

本发明实施例一所得的液体型瓶装功能微生物产品，用A来表示；润康源微生物菌剂(菌种组合为酿酒酵母、干酪乳杆菌，经检测活菌总数为11.3×10⁸CUF/mL)，来自临沂益康有机农业科技有限公司，用B来表示。

本发明实施例一所得的液体型瓶装功能微生物产品用设置3个处理浓度， 分别为1:500、1:1000、1:1500(微生物产品与清水体积之比) ， 以清水作为对照(CK)；润康源微生物菌剂分别为1:100、1:200、1:300(微生物产品与清水体积之比) ， 以清水作为对照(CK)；共计7个处理， 各处理设置详见表2。

每个处理小区面积25m²， 随机区组排列， 3次重复。育苗前种子分别用各处理菌肥浓度浸种2h， 在生菜定植缓苗后开始叶面喷施微生物菌肥进行处理， 每7天喷施一次，喷施时间均为下午2点， 共喷施5次。喷施菌肥采用喷雾器喷施法， 每小区配用15公斤待用浓度的菌肥， 然后均匀喷施至生菜叶片。

表2各处理名称

测定项目及方法：

1)生菜形态指标和产量的测定

生菜地上部生长指标的测定：播种后3d开始记录不同微生物菌肥处理的生菜的出苗率；定植后40天随机取30株生菜，用蒸馏水冲洗干净，吸去表面水分，测定其地上部生长指标，包括株高、叶面积、地上部鲜重、地上部干重、亩产量。株高为根莲处至时片生长最高点距离；地上部和地下部分别在105℃下杀青，75℃烘至恒重，测量干质量。

2)生菜品质指标的测定

采收期，每处理随机取30株生菜， 将烂叶黄叶去除，将其他叶片剪碎混合，测定可溶性糖、可溶性蛋白、维生素C、游离氨基酸的含量。可溶性糖含量的测定釆用蒽酮比色法；可溶性蛋白质的测定采用考马斯亮蓝G-250染色法；维生素C采用分光光度计法测定；游离氨基酸采用茚三酮溶液显色法测定。

试验结果：

1)在播种后的第10天，两种菌肥各浓度的出苗率均达到了88％以上， 表明微生物菌肥处理后的土壤透气性和保水性均有利于生菜种子的出苗，可有效缩短育苗时间；A2(实施例一所得的液体型瓶装功能微生物产品1:1000)的孔隙度最大，透气性最好，所以对育苗影响最大，其出苗率最高达99.06％，与清水对照组相比提高了4.91％；B2(润康源微生物菌剂1:200清水稀释)的总孔隙率次之，相应的出苗率低于A2(实施例一所得的液体型瓶装功能微生物产品1:1000，但也比清水对照组提高了1.14％。

两种微生物菌肥不同浓度处理对生菜生长的影响有一定的差异，与清水对照组相比，处理A2、B2均能显著增加温室生菜的株高、叶面积、地上部鲜重、地上部干重、亩产量，且促进效果表现为A2＞B2，其中A2(实施例一所得的液体型瓶装功能微生物产品1:1000)处理效果最好，分别使株高、地上部鲜重、地上部干重、亩产量、叶面积比清水对照组增加了29.32％、24.66％、73.21％、26.30％、18.26％，B2(润康源微生物菌剂1:200清水稀释)处理效果次之，分别使株高、地上部鲜重、地上部干重、亩产量、叶面积比清水对照组增加了24.54％、20.15％、56.87％、22.80％、14.49％，其他浓度的处理结果与清水对照组相比差异不显著。

实验例二：

以制备实施例二所述方法制备2Kg/袋的粉剂产品进行对比实验。

试验方法：试验选用产期、胎次、品种相同、肤色相近的50日龄杜长大三元杂交断奶仔猪90头，试验时间125天，随机分为三组，每组30头，平均分为三圈饲养，每组的仔猪体重无明显差异(P＞0.05)。三组仔猪饲养于同一幢猪舍内，环境条件相同，预饲期两周，预饲期内完成去势、驱虫、防疫注射；试验设对照、添加制备实施例二得到的粉剂产品处理组、添加高龙微生物饲料添加剂粉剂产品(购自山东高龙生物科技有限公司，检测活菌数为12.0×10⁸CFU/g)三个处理，对照组：全价料；试验组：全价料+0.2％高龙微生物饲料添加剂粉剂产品；

自由采食，计量不限量，自动饮水器饮水。

指标统计：准确记录日增重、料重比、蛋白消化率、有机物消化率、腹泻发生率、腹泻复发率，对试验数据行比较。

应用效果：全价料+0.2％制备实施例二得到的粉剂产品效果最好，全价料+0.2％高龙微生物饲料添加剂粉剂产品次之，其中制备实施例二得到的粉剂产品日增重比对照组提高9.44％，料重比试验组比对照组降低6.83％；腹泻发生率明显低于对照组，低25.22％，而且腹泻发生率0％，而对照组复发率为22.8％。差异均极显著P＜(0.01)；蛋白消化率比对照组提高8.56％，有机物消化率比对照组提高8.78％。

本发明实施例二得到的粉剂产品无毒、无副作用、无污染、安全可靠，添加到肥育猪日粮中。一方面，该粉剂产品能有效提高饲料的利用率，可以增加日增重，这除了固体型功能微生物产品本身含有大量的活菌，被动物摄取利用，起到使饲料中部分不易吸收利用的物质得以降解外，还与固体型功能微生物产品中的部分活性营养物质有关；另一方面，该粉剂产品有明显的增强畜禽机体对疫病的抵抗力的作用，特别是肠道细菌性疾病，这可能由于固体型功能微生物产品中有益菌与肠道内的有益菌一起并形成了优势菌群，大量繁殖，通过竞争性抑制使有害菌的繁殖受到抑制，阻止了细菌性疫病的发生，从而达到增强抗病力的作用。

Claims (7)

1.利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法，其特征在于包括以下步骤：

a、以谷胱甘肽废液为种子培养基有效成分，分别对地衣芽胞杆菌种子液、产朊假丝酵母菌种子液、嗜酸乳杆菌种子液及枯草芽孢杆菌种子液进行种子罐培养，得到地衣芽胞杆菌种子罐培养液、产朊假丝酵母菌种子罐培养液、嗜酸乳杆菌种子罐培养液及枯草芽孢杆菌种子罐培养液，

种子培养基的制备方法：将谷胱甘肽废液加纯水稀释5～20倍，在pH5.5～7.2，121℃～125℃，0.103MPa～0.168MPa条件下灭菌0.5～1h，降温至27～36℃即完成制备过程；

b、将步骤a得到的地衣芽胞杆菌种子罐培养液、产朊假丝酵母菌种子罐培养液、嗜酸乳杆菌种子罐培养液及枯草芽孢杆菌种子罐培养液混合后，以谷胱甘肽废液为发酵罐培养基有效成分，对混合液进行发酵罐发酵，得到功能发酵液，

发酵罐培养基的制备方法：将谷胱甘肽废液加纯水稀释5～20倍，在pH5.5～7.2，121℃～125℃，0.103MPa～0.168MPa条件下灭菌0.5～1h，降温至27～36℃即完成制备过程；

c、步骤b所得发酵液经过处理，得到功能微生物产品，

所述谷胱甘肽废液为微生物发酵法生产谷胱甘肽过程中发酵液离心后的残液。

2.根据权利要求1所述的利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法，其特征在于：

利用种子培养基对地衣芽胞杆菌种子液进行种子罐培养时，种子罐的培养基装料量控制在种子罐公称容积的50％～75％，接种量控制在种子罐实际装料量的0.5％～2％，发酵温度控制在28～31℃，pH控制在6.8～7.2，搅拌转速控制在160～180r/min，通气量控制在1VVm～2VVm，培养18h～26h；

利用种子培养基对产朊假丝酵母菌种子液进行种子罐培养时，种子罐的培养基装料量控制在种子罐公称容积的50％～75％，接种量控制在种子罐实际装料量的0.5％～2％，发酵温度控制在27～30℃，pH控制在5.8～6.2，搅拌转速控制在190～220r/min，通气量控制在1VVm～2VVm，培养20h～26h；

利用种子培养基对嗜酸乳杆菌种子液进行种子罐培养时，种子罐的培养基装料量控制在种子罐公称容积的50％～75％，接种量控制在种子罐实际装料量的0.5％～2％，发酵温度控制在35～37℃；pH控制在5.6～6.0；搅拌转速控制在135～160r/min；不通气，培养23h～36h；

利用种子培养基对枯草芽孢杆菌种子液进行种子罐培养时，种子罐的培养基装料量控制在种子罐公称容积的50％～75％，接种量控制在种子罐实际装料量的0.5％～2％，发酵温度控制在28～30℃，pH控制在7.0～7.2，搅拌转速控制在135～160r/min，通气量控制在1VVm～3VVm，培养24h～36h。

3.根据权利要求1或2所述的利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法，其特征在于：利用发酵罐培养基对混合液进行发酵罐发酵时，地衣芽胞杆菌种子罐培养液、产朊假丝酵母菌种子罐培养液、嗜酸乳杆菌种子罐培养液及枯草芽孢杆菌种子罐培养液的接种量分别控制在发酵罐实际装料量的1％～5.0％，发酵温度控制在25～35℃，pH控制在6.0～7.0，搅拌转速控制在150～250r/min，间歇搅拌通气，培养24h～48h。

4.根据权利要求3所述的利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法，其特征在于：

在发酵开始时，同时关闭搅拌和所有阀门，24h后打开放气阀，调节放气阀的开关幅度控制发酵罐罐压0.02～0.03MPa，以后每6小时同时开启搅拌和通气，搅拌和通气时间为30min，放气阀一直为打开状态，通过调节放气阀的开关幅度，将发酵罐罐压保持在0.02～0.03MPa，通气量控制在1VVm～3VVm。

5.根据权利要求3所述的利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法，其特征在于：

发酵罐发酵过程中的检测频率：接种后4h后开始，每隔2h进行一次取样，检测活菌数、pH指标，至24h后，取样时间间隔缩短至0.5～1h；

发酵液检测指标：pH4.5～5.5；地衣芽胞杆菌含菌量≥12.5×10⁸CFU/mL；枯草芽孢杆菌含菌量≥12×10⁸CFU/mL；产朊假丝酵母菌含菌量≥6.5×10⁸CFU/mL；嗜酸乳杆菌含菌量≥25×10⁸CFU/mL；总活菌数≥56×10⁸CFU/mL。

6.根据权利要求1所述的利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法，其特征在于步骤c中，发酵液直接进行灌装，成为瓶装液体活菌微生物产品。

7.根据权利要求1所述的利用谷胱甘肽废液生产功能微生物的方法，其特征在于步骤c中，发酵液与吸附载体充分混合后，经烘干得到固体型微生物产品。