CN109607823A - 治理苏氨酸母液和分离提取蛋白的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于生物技术领域，治理苏氨酸母液和分离提取菌体蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1）制备产朊假丝酵母菌和干酪乳杆菌的发酵菌液，步骤2）制备水华鱼腥藻液，步骤3）母液处理，步骤4）分离提取蛋白。本发明方法在治理苏氨酸母液的同时，分离提取了菌体蛋白，可用于发酵培养基氮源或饲料组分，提高了工业附加值。

Description

治理苏氨酸母液和分离提取蛋白的方法
技术领域
本发明属于生物技术领域，具体涉及治理苏氨酸母液和分离提取蛋白的方法。
背景技术
我国是氨基酸生产和消费大国，在化工、制药、食品等行业生产中经常排放大量含氨基酸的废母液，含有多种氨基酸、残糖、发酵中间产物、铵盐等，表现为高COD，高NH3-N的特点，且呈酸性，排放到水体后，会严重污染环境，治理难度较大。为解决废水污染问题，同时将废水资源进行有效利用，在传统的生产工艺中，先将氨基酸废母液中菌体蛋白提取出来做成饲料进行出售，提取蛋白后的废母液经浓缩利用喷浆造粒技术制备肥料反哺农业。
氨基酸发酵废液喷浆造粒工艺是氨基酸生产企业有效处理高浓度废水，实现循环经济，增加企业经济收益的有效途径，但在发酵废液喷浆造粒过程中，产生了含有大量水分和有机物的污染烟气，易造成环境“二次污染”。该烟气具有严重异味影响到周围群众正常的生活，成为当地政府迫切解决的问题，是长期困扰发酵行业发展的重大技术难题。
有研究表明，可以利用氨基酸工业废水生产饲用菌体蛋白，例如中国专利技术“利用高含盐氨基酸废水发酵生产饲用汉逊德巴利酵母的方法”公开了一种回收利用氨基酸废水进行发酵生产菌体蛋白的方法，该方法利用废水制备了培养基，培养基组分为，高含盐氨基酸污水：125g/L-330g/L，碳源：30-100g/L，磷酸二氢钾（KH2PO4）：5-15g/L，酵母粉：0-10g/L，硫酸镁（MgSO4）：3-9g/L，碳酸钙（CaCO3）：0.75-2g/L，硫酸亚铁（FeSO4）：1.5-4g/L，培养基pH为3.5-7.5，该方法有效处理了废水，并且制备了菌体蛋白；但是该方法也存在一些缺陷：培养基原料成本较高、废水使用量有限等缺陷。
由于废母液含有多种营养成分，在储存池内存放过程中，会滋生大量微生物菌群，随着储存池运行时间的积累，池内形成了适应于废母液低pH、高盐分恶劣环境的优势菌群。阜丰集团研发中心曾对这项课题进行了专题研究（李海燕，徐国华等《味精废水中优势菌的分离筛选和生长特性的研究》，发酵科技通讯，2008年第4期），结果表明：在味精废水中，生长着大量的不同种的微生物，在一定的生态条件下，各种微生物的生长处于平衡状态；其中优势生长菌在废水中保持着优势生长，生长量所占水体中微生物总数的比例最大，通过研究改变优势菌的外部条件，提高其生长活性，对废水污染物的降解效果将会有较大的提高。可见，氨基酸母液中本身就存在微生物，其可以分解母液中污染物；我们可以通过添加特定的能适应母液环境的微生物，来分解氨基酸母液中的污染物，以达到综合处理母液的目的。
申请人之前的专利技术“CN107267427A，一种苏氨酸母液回收利用方法”利用枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及斜生栅藻对母液进行了处理，效果较好，但是需要对枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌以及斜生栅藻进行驯化，而且需要额外添加培养基组分，工艺复杂，成本提高，不利于处理大规模母液；大量的微生物蛋白也没有进行后续的深加工处理，造成了浪费。
发明内容
为了克服现有技术的存在的技术缺陷进行进一步地改进，本发明提供了治理苏氨酸母液和分离提取蛋白的方法。本发明在治理苏氨酸母液的同时，分离提取了菌体蛋白，一举两得，变废为宝。
为实现上述发明目的，本发明采用以下技术方案：
治理苏氨酸母液和分离提取菌体蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1）制备产朊假丝酵母菌和干酪乳杆菌的发酵菌液，步骤2）制备水华鱼腥藻液，步骤3）母液处理，步骤4）分离提取蛋白。
进一步地，
步骤1）制备产朊假丝酵母菌和干酪乳杆菌的发酵菌液：取适量苏氨酸母液，100℃煮沸5min，然后添加氯化铵，搅拌均匀，再依次接种产朊假丝酵母菌种子液和干酪乳杆菌种子液，温度为28-32℃，以200rpm震荡培养12h，然后静置培养24h，得到产朊假丝酵母菌和干酪乳杆菌的发酵菌液；
步骤2）制备水华鱼腥藻液：将处于对数生长期的水华鱼腥藻按照10％的接种量接种到BG11培养基中进行培养，培养的条件为：光照强度5000lux，25℃培养，光暗比为12:12，通气速率为0.2vvm；培养48h，收集藻液；
步骤3）母液处理：将苏氨酸母液排到反应池中，然后铺设无纺布作为附着载体，再将发酵菌液接种到反应池中，处理时间为2-3d，然后将藻液接种到反应池中，继续处理6-7d，板框过滤收集微生物，然后排出液体，用于田间灌溉；
步骤4）分离提取蛋白：将微生物置于80℃烘干，然后粉碎机粉碎成粉末，再添加到5倍重量的稀盐酸中，搅拌均匀，再静置1h，然后投入到高速剪切机中进行剪切，得到微生物悬液，加热至90℃，保温条件下，水解6h，自然降温至室温，1000rpm离心3min，去除沉淀物，将水解液经多效蒸发器蒸发制得膏状物，最后将膏状物经喷雾造粒干燥制成蛋白粉。
优选地，所述步骤1）中，氯化铵的添加量占苏氨酸母液的0.5-1%重量份。
优选地，所述步骤1）中，所述产朊假丝酵母菌种子液和干酪乳杆菌种子液的接种量均为5-10%。
优选地，所述步骤3）中，所述发酵菌液的接种量为1-2%。
优选地，所述步骤3）中，所述藻液的接种量为0.5-1%。
优选地，所述步骤1）中，所述产朊假丝酵母菌种子液的制备方法为：将产朊假丝酵母菌接种到YPD液体培养基中进行培养，获得产朊假丝酵母菌种子液。
优选地，所述步骤1）中，所述干酪乳杆菌种子液的制备方法为：将干酪乳杆菌接种到MRS液体培养基中进行培养，获得干酪乳杆菌种子液。
优选地，所述步骤4）中，所述稀盐酸的浓度为0.5mol/L。
优选地，所述步骤4）中，所述高速剪切机的速度剪切为10000rpm，剪切时间为180s。
与现有技术相比，本发明取得的有益效果主要包括但是并不限于以下几个方面：
由于母液中氧含量较低，本发明首先接种产朊假丝酵母菌和干酪乳杆菌，两种菌株可以相互共生，在厌氧条件下，分解大分子有机质，产生小分子有机物，抑制杂菌，后期再通过水华鱼腥藻利用小分子有机质的方式来降解母液中的氮、磷等有机营养物质，还可利用太阳光进行光合作用来保证自身的生长繁殖，吸收二氧化碳，并且产生氧气，还能促进菌株生长，整个方法简单可行，成本低廉，处理效果好；无纺布比表面积大，不容易被腐蚀，微生物可以附着上形成生物膜，挂膜效果好，处理效率高。本发明方法在治理苏氨酸母液的同时，分离提取了菌体蛋白，可用于发酵培养基氮源或饲料组分，提高了工业附加值。
附图说明
图1：各因素对母液中COD和氨氮去除率的影响；
图2：水华鱼腥藻的接种量对主要污染物COD和氨氮去除率的影响。
具体实施方式
为了使本技术领域的人员更好地理解本申请中的技术方案，下面将结合本申请具体实施例，对本发明进行更加清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本申请一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本申请中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都应当属于本发明保护的范围。
实施例1
治理苏氨酸母液和分离提取蛋白的方法，其包括如下步骤：
将产朊假丝酵母菌接种到YPD液体培养基中进行培养，获得产朊假丝酵母菌种子液，菌体浓度为1×109CFU/ml；
将干酪乳杆菌接种到MRS液体培养基中进行培养，获得干酪乳杆菌种子液，菌体浓度控制在3×109CFU/ml；
取适量苏氨酸母液，100℃煮沸5min，然后添加占苏氨酸母液0.6%重量份的氯化铵，搅拌均匀，然后依次接种产朊假丝酵母菌种子液和干酪乳杆菌种子液，接种量均为10%，温度为30℃，以200rpm震荡培养12h，然后静置培养24h，得到发酵菌液；
将处于对数生长期的水华鱼腥藻，按照10％的接种量接种到BG11培养基中进行培养，接种密度为1×105个/ml，培养的条件为：光照强度5000lux，25℃培养，光暗比为12:12，通气速率为0.2vvm；培养48h，收集藻液；
将苏氨酸母液排到反应池中，然后铺设无纺布作为附着载体，再按照 2%的接种量将发酵菌液接入到反应池中，处理时间为2d，然后按照1%的接种量将藻液接入到反应池中，继续处理6d，板框过滤收集微生物，然后排出液体，用于田间灌溉；
将微生物置于80℃烘干，粉碎机粉碎成粉末，然后添加到5倍重量的浓度为0.5mol/L的稀盐酸中，搅拌均匀，再静置1h，然后投入到高速剪切机中以10000rpm的速度剪切180s，得到微生物悬液，加热至90℃，保温条件下，水解6h，自然降温至室温，1000rpm离心3min，去除沉淀物，将水解液经多效蒸发器蒸发制得膏状物，最后将膏状物经喷雾造粒干燥制成蛋白粉。经检测，蛋白粉中蛋白的含量为50.3%，氨基酸含量为32.1%，余量为其他杂质；蛋白和氨基酸的总得率为0.34g/g微生物干重。本发明蛋白粉游离氨基酸含量达到30%以上，具备较好的营养价值，能够用于发酵氮源的使用。
实施例2
治理苏氨酸母液和分离提取菌体蛋白的方法，其包括如下步骤：
将产朊假丝酵母菌接种到YPD液体培养基中进行培养，获得产朊假丝酵母菌种子液，菌体浓度为2×109CFU/ml；
将干酪乳杆菌接种到MRS液体培养基中进行培养，获得干酪乳杆菌种子液，菌体浓度控制在5×109CFU/ml；
取适量苏氨酸母液，100℃煮沸5min，然后添加占苏氨酸母液0.5%重量份的氯化铵，搅拌均匀，然后依次接种产朊假丝酵母菌种子液和干酪乳杆菌种子液，接种量均为6%，温度为28℃，以200rpm震荡培养12h，然后静置培养24h，得到发酵菌液；
将处于对数生长期的水华鱼腥藻，按照10％的接种量接种到BG11培养基中进行培养，接种密度为1×105个/ml，培养的条件为：光照强度5000lux，25℃培养，光暗比为12:12，通气速率为0.2vvm；培养48h，收集藻液；
将苏氨酸母液排到反应池中，然后铺设无纺布作为附着载体，再按照1%的接种量将发酵菌液接入到反应池中，处理时间为3d，然后按照0.5%的接种量将藻液接入到反应池中，继续处理7d，板框过滤收集微生物，然后排出液体，用于田间灌溉；
将微生物置于80℃烘干，然后粉碎机粉碎成粉末，然后添加到5倍重量的浓度为0.5mol/L的稀盐酸中，搅拌均匀，再静置1h，然后投入到高速剪切机中以10000rpm的速度剪切180s，得到悬液，加热至90℃，保温条件下，水解6h，自然降温至室温，1000rpm离心3min，去除沉淀物，将水解液经多效蒸发器蒸发制得膏状物，最后将膏状物经喷雾造粒干燥制成蛋白粉。
实施例3
本发明采用的苏氨酸母液是从发酵液中提取苏氨酸之后的残液，随机选取2018年三季度的某一批次的苏氨酸母液进行试验，检测苏氨酸母液处理前、处理后的各污染物指标，具体见表1：
表1
指标 处理前 处理后（实施例1工艺）
COD（mg/L） 3218.5 53.1
氨氮（mg/L） 416.2 12.8
SS（mg/L） 157.3 7.9
P（mg/L） 113.8 5.7
粗蛋白（g/L） 29.6 4.1
如上表1所示，经过处理后，母液中的污染物以及粗蛋白含量降幅明显，可以用于田间灌溉水源，节能减排，减少了企业的环保压力。
实施例4
以主要污染物COD和氨氮为检测指标，验证各因素对母液处理的影响。
设置不同的对照组，其中，对照1：不添加产朊假丝酵母菌，其余同实施例1；对照2：不添加干酪乳杆菌，其余同实施例1；对照3：不添加水华鱼腥藻，其余同实施例1；对照4：三种微生物同时接入，其余同实施例1。实验组为实施例。如图1所示，与对照1-4相比，实验组采用先接入产朊假丝酵母菌和干酪乳杆菌，待部分大分子有机物被分解成小分子，然后接入水华鱼腥藻的方式，提高水华鱼腥藻繁殖速率，能够提高母液中主要污染物的去除率，效果优于对照1-4。
实施例5
水华鱼腥藻的接种量对主要污染物COD和氨氮去除率的影响。
设置接种量分别为0,0.25，0.5,1.0,2.0,4.0(%)六个不同梯度的接种量进行检测，如图2所示，随着接种量的增加，COD和氨氮去除率迅速提高，当增加到1%时，达到峰值，然后随着接种量的增加，COD和氨氮去除率下降，可能是因为水华鱼腥藻繁殖过快，造成藻类部分死亡以及水体污染，从而不利于污染物的去除。
尽管已经示出和描述了本发明的实施例，对于本领域的普通技术人员而言，可以理解在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，本发明的范围由所附权利要求及其等同物限定。

Claims (10)

1.治理苏氨酸母液和分离提取菌体蛋白的方法，其特征在于，所述方法包括如下步骤：步骤1）制备产朊假丝酵母菌和干酪乳杆菌的发酵菌液，步骤2）制备水华鱼腥藻液，步骤3）母液处理，步骤4）分离提取蛋白。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，
步骤1）制备产朊假丝酵母菌和干酪乳杆菌的发酵菌液：取适量苏氨酸母液，100℃煮沸5min，然后添加氯化铵，搅拌均匀，再依次接种产朊假丝酵母菌种子液和干酪乳杆菌种子液，温度为28-32℃，以200rpm震荡培养12h，然后静置培养24h，得到产朊假丝酵母菌和干酪乳杆菌的发酵菌液；
步骤2）制备水华鱼腥藻液：将处于对数生长期的水华鱼腥藻按照10％的接种量接种到BG11培养基中进行培养，培养的条件为：光照强度5000lux，25℃培养，光暗比为12:12，通气速率为0.2vvm；培养48h，收集藻液；
步骤3）母液处理：将苏氨酸母液排到反应池中，然后铺设无纺布作为附着载体，再将发酵菌液接种到反应池中，处理时间为2-3d，然后将藻液接种到反应池中，继续处理6-7d，板框过滤收集微生物，然后排出液体，用于田间灌溉；
步骤4）分离提取蛋白：将微生物置于80℃烘干，然后粉碎机粉碎成粉末，再添加到5倍重量的稀盐酸中，搅拌均匀，再静置1h，然后投入到高速剪切机中进行剪切，得到微生物悬液，加热至90℃，保温条件下，水解6h，自然降温至室温，1000rpm离心3min，去除沉淀物，将水解液经多效蒸发器蒸发制得膏状物，最后将膏状物经喷雾造粒干燥制成蛋白粉。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，氯化铵的添加量占苏氨酸母液的0.5-1%重量份。
4.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述产朊假丝酵母菌种子液和干酪乳杆菌种子液的接种量均为5-10%。
5.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，所述发酵菌液的接种量为1-2%。
6.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤3）中，所述藻液的接种量为0.5-1%。
7.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述产朊假丝酵母菌种子液的制备方法为：将产朊假丝酵母菌接种到YPD液体培养基中进行培养，获得产朊假丝酵母菌种子液。
8.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤1）中，所述干酪乳杆菌种子液的制备方法为：将干酪乳杆菌接种到MRS液体培养基中进行培养，获得干酪乳杆菌种子液。
9.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤4）中，所述稀盐酸的浓度为0.5mol/L。
10.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述步骤4）中，所述高速剪切机的速度剪切为10000rpm，剪切时间为180s。
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