CN115992055A - 一种循环分割补料发酵蜜环菌的工艺方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种循环分割补料发酵蜜环菌的工艺方法。发酵培养基组成：玉米粉5‑8％，豆粕2‑4％，VB1 0.003％，磷酸二氢钾0.15‑0.2％等，发酵条件为25‑28℃，200r/min，通气比1:(0.5‑1.0)V/V.min，发酵5‑6天，菌丝湿重达到300g/L以上，依此工艺，根据蜜环菌的生长状况，可循环分割2‑5次。与传统的发酵工艺相比，发明的主要优点：采用了多次分割补料发酵工艺，减少了种子培养周期，工作量减少，设备利用率提高；接种量增大，降低杂菌污染；生产周期缩短；生物量大；工艺稳定。
Description
技术领域
本发明涉及一种蜜环菌循环多次分割发酵工艺，具体涉及蜜环菌的发酵培养基成分，培养条件，以及后续的工艺改进，属于液态发酵技术领域。
背景技术
蜜环菌是属于担子菌门、伞菌目、白蘑科、蜜环菌属，其能与传统中草药猪苓和天麻有一种特殊的共生关系。根据生长和发育阶段的不同，蜜环菌可分为菌丝体与子实体两部分，菌丝体作为蜜环菌的营养器官，其有菌丝或菌索两种形态存在，而子实体是蜜环菌发育成熟的蘑菇。蜜环菌液体深层发酵技术能获得大批量的菌丝体以及代谢产物。液体深层发酵技术最早始于20世纪40年代中期抗生素的生产，它是利用给菌种提供最适的培养基成分，以及培养条件，从而获得相关产物。实现药用真菌工业化生产的主要途径就是通过液体深层发酵技术，我国是在1958年开始研究真菌的液态深层发酵，在20世纪60末实现了大规模生产药用真菌。液体深层发酵技术与传统的固态发酵相比，有能实现连续化生产，缩短发酵周期以及产生丰富的生理活性物质等优点，蜜环菌液态发酵产物中有核苷类，多糖类，氨基酸类以及倍半萜类化合物等活性成分，其中核苷类化合物具有增强机体免疫力，抗肿瘤，抗病毒等多种生理活性，多糖类化合物延缓衰老，增强免疫力以及辐射保护作用，氨基酸类是构建生命体大分子活性物质的原料，能为机体提供营养，蜜环菌菌丝体以及发酵液都具有良好的神经调节，脑保护作用，还能增强血流量，调节机体免疫力等生理活性，在这些方面具有跟天麻相同的药理效果。
真菌类的发酵工艺一般都存在发酵周期过长，从而原料利用率低，生产能力低，大大提高了生产成本。分割发酵是利用菌种发酵到生长对数后期，分离出一定比例的发酵液，然后在加入相同比例的培养基继续发酵，继续连续分割，使菌种一直保持较快的生长速度，由于蜜环菌前期种子液生长缓慢，而分割发酵工艺能省去前期制备种子的过程，从而缩短发酵周期，提高设备利用率，大大降低生产成本。分割发酵工艺对蜜环菌的发酵生产以及工艺质量监控有良好的指导作用，促进蜜环菌产业化生产具有良好的应用意义和现实意义，能带来良好的经济效益。
蜜环菌液态发酵的产物经离心或者过滤后分离得到菌丝体和发酵液，发酵液经浓缩后得到蜜环菌浓缩液，随着人们对蜜环菌相关药理活性成分研究的深入，市场上关于蜜环菌液态发酵产物相关产品的开发也越来越多，目前国内有关产品主要有三类:①根据蜜环发酵液经浓缩后制得产品，如脑心舒口服液，该产品主治滋补强壮，镇静安神。身体虚弱，心神不安，失眠多梦，神经衰弱，头痛眩晕的人可以服用。②根据蜜环菌发酵分离后的菌丝体制得产品，如蜜环菌片和晕痛片，蜜环菌片能有效降低高胆固醇血症和高甘油三酯血病，晕痛定能有效预防头痛，对神经性疾病有很好的预防和治疗效果。③对蜜环菌菌丝体进行有效提取，然后跟发酵液一起混合而得到的相关产品有蜜环菌糖浆和健脑露，蜜环菌糖浆主治神经衰弱，失眠多梦以及美尼尔综合征，健脑露能有效增强体质，降低高血压以及神经衰弱等症状。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种利于蜜环菌液态培养的最佳培养基，培养条件，以及在此基础上进行分割发酵，确定分割时间，分割比例和分割培养时间，再进行分割级数的确定，从而提高蜜环菌液态发酵生物量以及缩短发酵培养的时间。
本发明的技术方案是：
蜜环菌经过固体种子、摇瓶种子、发酵罐种子培养过程，再进入生产发酵罐，可以在生产发酵罐进行2-5次的分割，然后进行补料循环发酵。其工艺过程：
(1)蜜环菌固态种子培养与活化；
(2)蜜环菌摇瓶种子培养；
(3)蜜环菌种子罐发酵培养；
(4)种子成熟后移种到生产发酵罐，控制条件进行发酵培养；
(5)当培养至稳定期，菌丝增长缓慢，将发酵液分割至3-5个同体积发酵罐，补充新鲜发酵培养基，继续发酵培养；
(6)依此工艺，根据蜜环菌的生长状况，继续分割2-5次。
一种蜜环菌循环分割补料发酵工艺，进一步的技术方案是：
蜜环菌循环分割补料发酵工艺，种子罐培养基为：糊精30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水硫酸镁0.75g/L，pH为5.5，在26-28℃，200r/min，通风比1:0.8V/V.min，发酵培养6-7天，菌丝湿重达400g/L以上。
蜜环菌循环分割补料发酵工艺，发酵培养基为：玉米粉5-8％，豆粕2-4％，VB10.003％，磷酸二氢钾0.15-0.2％，七水硫酸镁0.075-0.1％，硫酸锌0.05-0.08％，装料系数为70-80％，pH为5.5-6.0；发酵条件为25-28℃，200r/min，通气比1:(0.5-1.0)V/V.min。
蜜环菌循环分割补料发酵工艺，发酵过程中补加糖化酶0.05％，酸性蛋白酶0.02％；当发酵培养5-6天，菌丝湿重达到300g/L以上，将含菌的发酵液分割至3-5个相同体积的发酵罐，补充灭菌的发酵培养基到装料系数的70-80％，继续发酵。
蜜环菌循环分割补料发酵工艺，可循环分割级数为2-5次。当分割后培养6天，菌丝湿重低于280g/L时，分割工艺全程结束。
本发明的主要优点：
1.本发明阐述了蜜环菌液态发酵工艺最佳培养基成分以及最佳培养条件，大大提高了蜜环菌液体发酵生物量。
2.本发明结合分割发酵工艺，分割比例为20-30％，培养5-6天，此时菌丝量湿重可达300g/L以上。且在此条件下能连续分割2-5次，大大缩短了发酵培养时间，效率高，工艺简易稳定，容易操作控制，适合大工业生产，成本低。
3.蜜环菌液态发酵后，菌丝体可制成蜜环菌片以及相关产品，发酵液经浓缩后可制成脑心舒口服液，具有广阔市场前景以及良好经济价值。
具体实施实例
结合实施例，本发明蜜环菌多次分割发酵工艺进一步说明如下：
实施例1：
固体平板种子制备：
100g麸皮与50g玉米粉混合，加入500mL水，升温至90℃，保温1h，期间间隔搅拌；1h后降温至60℃，加入1g淀粉酶与2g糖化酶，搅拌保温2h；2h后过滤收集滤液。取100mL滤液，加入磷酸二氢钾0.1g，磷酸氢二钾0.05g，七水硫酸镁0.05g，琼脂2g，115℃30min灭菌。冷却后倒平板，在无菌条件下，用接种铲将蜜环菌菌种接种到固体平板培养基上，28℃培养15天左右，待白色菌丝长满平板即可。
实施例2：
摇瓶种子制备：
摇瓶种子培养基：糊精30g/L，葡萄糖10g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水硫酸镁0.75g/L，调节pH 5.5，然后往250mL的三角瓶中分装50mL，115℃30min灭菌。在无菌条件下，将固体平板培养基活化好的菌种用接种铲铲取0.25cm2大小的菌苔3-4块接种到灭过菌的摇床扩大培养基中，26℃，200r/min培养7-10天左右。
实施例3：
种子罐种子制备：
种子罐培养基为：糊精30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水硫酸镁0.75g/L，pH为5.5，在28℃，200r/min，通风比1:0.8V/V.min，发酵培养7天，菌丝湿重达350g/L。
实施例4：
第一次发酵培养：
玉米粉6％，豆粕3％，VB1 0.003％，磷酸二氢钾0.16％，七水硫酸镁0.08％，硫酸锌0.06％，装料系数为80％，pH为5.5，补加糖化酶0.05％，酸性蛋白酶0.02％。培养条件为：温度26℃，搅拌转速200r/min，通气比1：0.6V/V.min，发酵培养6天，菌丝湿重量达到320g/L。
实施例5：
分割补料发酵
当第一次发酵培养6天，菌丝湿重量达到320g/L，将发酵液分割成5个同体积发酵罐，补充灭菌的发酵培养基到装料系数为80％，即玉米粉6％，豆粕3％，VB1 0.003％，磷酸二氢钾0.16％，七水硫酸镁0.08％，硫酸锌0.06％，pH为5.5，培养条件为：温度26℃，搅拌转速200r/min，通气比1：0.7V/V.min，发酵培养6天，菌丝湿重量达到330g/L。
实施例6：
分割发酵终点控制：
当经过第5次循环分割后，培养6天，菌丝湿重量低于280g/L时，分割工艺全程结束。
本发明保护范围不限于上述实施例。
Claims (5)
1.一种循环分割补料发酵蜜环菌的工艺方法，其特征在于，蜜环菌经过1次种子培养过程，进入生产发酵罐，再在生产发酵罐进行2-5次分割，进行补料循环发酵。其主要工艺过程：
(1)蜜环菌种子罐发酵培养；
(2)种子成熟后移种到发酵生产罐，发酵培养；
(3)当发酵至稳定期，将发酵液分割至3-5个同体积发酵罐，补充新鲜培养基，继续发酵培养；
(4)依此工艺，根据蜜环菌的生长状况，可循环分割2-5次。
2.根据权利要求1所述的蜜环菌多次分割补料发酵工艺，其特征在于，种子罐培养基为：糊精30g/L，蛋白胨16g/L，磷酸二氢钾1.5g/L，七水硫酸镁0.75g/L，pH为5.5，在26-28℃，200r/min，通风比1:0.8V/V.min，发酵培养6-7天，菌丝湿重达400g/L以上。
3.根据权利要求1所述的蜜环菌多次分割补料发酵工艺，其特征在于，发酵培养基为：玉米粉5-8％，豆粕2-4％，VB1 0.003％，磷酸二氢钾0.15-0.2％，七水硫酸镁0.075-0.1％，硫酸锌0.05-0.08％，装料系数为70-80％，pH为5.5-6.0；发酵条件为25-28℃，200r/min，通气比1:(0.5-1.0)V/V.min。
4.根据权利要求1所述的蜜环菌多次分割补料发酵工艺，其特征在于发酵过程中补加糖化酶0.05％，酸性蛋白酶0.02％；当发酵培养5-6天，菌丝湿重达到300g/L以上，将含菌的发酵液分割至3-5个相同体积的发酵罐，补充灭菌的发酵培养基到装料系数的70-80％，继续发酵。
5.根据权利要求1所述的蜜环菌反复分割补料发酵工艺，其特征在于可循环分割级数为2-5次。当分割后培养6天，菌丝湿重低于280g/L时，分割工艺全程结束。
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