CN114317295A - 一种桑黄菌丝体培养用液体培养基及其培养方法 - Google Patents
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Abstract
本发明提供一种桑黄菌丝体培养用液体培养基及其培养方法，以玉米粉和土豆粉为主要营养物质，添加桑木屑提取物和甘草提取物能够促进桑黄菌丝体的快速生长，且能够使得人工培养的桑黄菌丝体的药用活性与野生桑黄的药用活性相当；同时，添加了纳米级羟基磷灰石、柠檬酸三铵、四水乙酸镁等功能组分，有利于保持桑黄菌种的活力，促进桑黄菌丝体的生长。同时，通过对桑黄菌丝体培养过程中的pH值，培养温度、培养转速和通入空气的量等参数进行优化，能够促进桑黄菌丝体的快速生长。本发明提供的桑黄菌丝体的培养方法操作简单，具有生长周期短，发酵菌丝体产量高的优点，可以用于大规模的工业生产。
Description
技术领域
本发明属于微生物培养技术领域，具体涉及一种桑黄菌丝体培养用液体培养基及其培养方法。
背景技术
桑黄是属于担子菌亚门层菌纲的一种药用真菌，又名鲍氏木层孔菌，因其子实体具有抗肿瘤、抗氧化等多种功能，已成为国内外的研究热点，是国际公认的生物抗癌效率最高的真菌。
近年来，市场对桑黄需求量增大致使野生桑黄的掠夺性开采无法杜绝，且受其生理生态的特殊性和复杂性及外部条件的制约，造成自然界形成的子实体非常稀少，野生天然桑黄资源匮乏，面临枯竭，再加上桑黄的人工驯化栽培难度较大，难以形成稳定的医药工业产品来源，极大的限制了桑黄产业的发展。
现代研究表明，桑黄多糖主要分胞内多糖和胞外多糖，是桑黄中主要有效成分，具有显著抑制肿瘤生长和转移作用，且对人体不良反应小。桑黄孢子在适宜的条件下萌发生长形成桑黄菌丝，而桑黄菌丝体的成分类似于子实体的活性成分，因而通过发酵培养桑黄菌丝体获得桑黄多糖具有广阔的应用前景。
因此，如何选择合适的液体培养基以及培养方法从而促进桑黄菌丝体的发酵生长，提高桑黄菌丝体的产量是本领域技术人员亟需解决的技术难点。
发明内容
为了克服现有技术的不足，本发明提供一种桑黄菌丝体培养用液体培养基及其培养方法，通过对液体培养基中组分和含量的调整，以及培养方法的优化，实现了桑黄菌丝体的快速生长，提供了桑黄菌丝体的产量，有利于解决现有技术对桑黄稀缺的问题。
为了实现上述目的，本发明采用以下技术方案，一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，包括以下重量份数的原料，以每升计：
土豆粉60-80g，玉米粉30-50g，桑木屑提取物5-15g，甘草提取物3-6g，葡萄糖3-6g，麦芽糖2-4g，酵母粉3-8g，蛋白胨5-10g，磷酸二氢钾2-5g，羟基磷灰石3-6g，硫酸镁1-3g，碳酸钙0.5-2g，维生素B 0.02-0.05g，柠檬酸三铵2-6g，四水乙酸镁0.8-1.5g，余量为水。
所述土豆粉和玉米粉均经过100-200目筛网过滤。
所述桑木屑提取物经由以下制备方法制备而成，选取桑木屑粉碎成80-100目的桑木屑粉，加入质量浓度为55-70％的乙醇，所述桑木屑粉与乙醇的重量比为1:8-10，加热至40-55℃后，超声处理25-35min，循环提取2-3次，合并提取液，经浓缩、冷冻干燥后得到桑木屑提取物。
所述甘草提取物经由以下制备方法制备而成，选取甘草粉碎成80-100目的甘草粉，加入甘草粉重量5-10倍的水，加热至30-35℃，超声提取20-30min，循环提取2-3次，合并提取液，经浓缩、冷冻干燥后得到甘草提取物。
所述羟基磷灰石为纳米级羟基磷灰石，粒径为80-120nm。
所述桑黄菌丝体培养用液体培养基的pH值用pH调节剂调整为5-7。
作为优选，一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，包括以下重量份数的原料，以每升计：
土豆粉70-80g，玉米粉40-50g，桑木屑提取物5-10g，甘草提取物3-5g，葡萄糖3-6g，麦芽糖2-4g，酵母粉3-6g，蛋白胨5-8g，磷酸二氢钾2-5g，羟基磷灰石4-6g，硫酸镁1-3g，碳酸钙0.5-2g，维生素B 0.02-0.05g，柠檬酸三铵2-6g，四水乙酸镁0.8-1.5g，余量为水。
本发明的另一个目的，在于提供一种桑黄菌丝体的培养方法，采用上述液体培养基进行培养，包括以下步骤：
(1)将桑黄菌种接种液体培养基中进行活化培养，调整温度为24-30℃，摇床转速为100-130r/min下培养3-5天，得到种子培养液；
(2)将步骤(1)制得种子培养液按体积百分比为10-15％的接种量接种于液体培养基中，放置在液体发酵罐中，通入空气的速率为2-4L/min，发酵温度为25-30℃，搅拌转速为180-220r/min，进行发酵培养10-14天，得到桑黄菌丝体和发酵液的混合液；
(3)将步骤(2)得到的桑黄菌丝体和发酵液的混合液过滤，将滤液高速离心得到固形物，然后将滤饼和固形物混合并在70-80℃的温度下烘干，即得到桑黄菌丝体。
所述步骤(3)的高速离心的转速为8000-10000r/min。
与现有技术相比，本发明具有以下有益的效果。
(1)本发明提供一种桑黄菌丝体培养用液体培养基及其培养方法，以玉米粉和土豆粉为主要营养物质，添加桑木屑提取物和甘草提取物能够促进桑黄菌丝体的快速生长，且能够使得人工培养的桑黄菌丝体的药用活性与野生桑黄的药用活性相当；同时，添加了纳米级羟基磷灰石、柠檬酸三铵、四水乙酸镁等功能组分，有利于保持桑黄菌种的活力，促进桑黄菌丝体的生长。
(2)本发明通过对桑黄菌丝体培养过程中的pH值，培养温度、培养转速和通入空气的量等参数进行优化，能够促进桑黄菌丝体的快速生长。本发明提供的桑黄菌丝体的培养方法操作简单，具有生长周期短，发酵菌丝体产量高的优点，可以用于大规模的工业生产。
具体实施方式
为了进一步理解本发明，下面结合实施例对本发明优选实施方案进行描述，但是应当理解，这些描述只是为了进一步说明本发明的特征和优点，而不是对本发明权利要求的限制。本发明所有原料，对其来源没有特别限制，在市场上购买的或按照本领域技术人员熟知的常规方法制备的即可。
实施例1
一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，包括以下重量份数的原料，以每升计：
土豆粉70g，玉米粉50g，桑木屑提取物15g，甘草提取物6g，葡萄糖4g，麦芽糖2g，酵母粉8g，蛋白胨5g，磷酸二氢钾2g，羟基磷灰石3g，硫酸镁1g，碳酸钙2g，维生素B 0.02g，柠檬酸三铵6g，四水乙酸镁0.8g，余量为水。
所述土豆粉和玉米粉均经过200目筛网过滤；所述桑木屑提取物经由以下制备方法制备而成，选取桑木屑粉碎成100目的桑木屑粉，加入质量浓度为70％的乙醇，所述桑木屑粉与乙醇的重量比为1:10，加热至40℃后，超声处理35min，循环提取3次，合并提取液，经浓缩、冷冻干燥后得到桑木屑提取物。
所述甘草提取物经由以下制备方法制备而成，选取甘草粉碎成80目的甘草粉，加入甘草粉重量5倍的水，加热至35℃，超声提取30min，循环提取3次，合并提取液，经浓缩、冷冻干燥后得到甘草提取物。
所述羟基磷灰石为纳米级羟基磷灰石，粒径为120nm；所述桑黄菌丝体培养用液体培养基的pH值用pH调节剂调整为6.5。
一种桑黄菌丝体的培养方法，采用上述液体培养基进行培养，包括以下步骤：
(1)将桑黄菌种接种液体培养基中进行活化培养，调整温度为30℃，摇床转速为130r/min下培养5天，得到种子培养液；
(2)将步骤(1)制得种子培养液按体积百分比为15％的接种量接种于液体培养基中，放置在液体发酵罐中，通入空气的速率为4L/min，发酵温度为28℃，搅拌转速为220r/min，进行发酵培养14天，得到桑黄菌丝体和发酵液的混合液；
(3)将步骤(2)得到的桑黄菌丝体和发酵液的混合液过滤，将滤液高速离心得到固形物，然后将滤饼和固形物混合并在70℃的温度下烘干，即得到桑黄菌丝体。所述步骤(3)的高速离心的转速为8000r/min。
实施例2
一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，包括以下重量份数的原料，以每升计：
土豆粉60g，玉米粉40g，桑木屑提取物10g，甘草提取物5g，葡萄糖6g，麦芽糖3g，酵母粉8g，蛋白胨6g，磷酸二氢钾4g，羟基磷灰石3g，硫酸镁2g，碳酸钙1g，维生素B 0.05g，柠檬酸三铵5g，四水乙酸镁1.5g，余量为水。
所述土豆粉和玉米粉均经过150目筛网过滤；所述桑木屑提取物经由以下制备方法制备而成，选取桑木屑粉碎成80目的桑木屑粉，加入质量浓度为60％的乙醇，所述桑木屑粉与乙醇的重量比为1:9，加热至50℃后，超声处理30min，循环提取2次，合并提取液，经浓缩、冷冻干燥后得到桑木屑提取物。
所述甘草提取物经由以下制备方法制备而成，选取甘草粉碎成100目的甘草粉，加入甘草粉重量8倍的水，加热至30℃，超声提取30min，循环提取3次，合并提取液，经浓缩、冷冻干燥后得到甘草提取物。
所述羟基磷灰石为纳米级羟基磷灰石，粒径为80nm；所述桑黄菌丝体培养用液体培养基的pH值用pH调节剂调整为5。
一种桑黄菌丝体的培养方法，采用上述液体培养基进行培养，包括以下步骤：
(1)将桑黄菌种接种液体培养基中进行活化培养，调整温度为27℃，摇床转速为110r/min下培养4天，得到种子培养液；
(2)将步骤(1)制得种子培养液按体积百分比为12％的接种量接种于液体培养基中，放置在液体发酵罐中，通入空气的速率为3L/min，发酵温度为30℃，搅拌转速为180r/min，进行发酵培养14天，得到桑黄菌丝体和发酵液的混合液；
(3)将步骤(2)得到的桑黄菌丝体和发酵液的混合液过滤，将滤液高速离心得到固形物，然后将滤饼和固形物混合并在80℃的温度下烘干，即得到桑黄菌丝体。所述步骤(3)的高速离心的转速为10000r/min。
实施例3
一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，包括以下重量份数的原料，以每升计：
土豆粉80g，玉米粉30g，桑木屑提取物8g，甘草提取物6g，葡萄糖6g，麦芽糖4g，酵母粉8g，蛋白胨10g，磷酸二氢钾2g，羟基磷灰石3g，硫酸镁3g，碳酸钙2g，维生素B 0.05g，柠檬酸三铵4g，四水乙酸镁1.2g，余量为水。
所述土豆粉和玉米粉均经过150目筛网过滤；所述桑木屑提取物经由以下制备方法制备而成，选取桑木屑粉碎成80目的桑木屑粉，加入质量浓度为65％的乙醇，所述桑木屑粉与乙醇的重量比为1:9，加热至40℃后，超声处理35min，循环提取2次，合并提取液，经浓缩、冷冻干燥后得到桑木屑提取物。
所述甘草提取物经由以下制备方法制备而成，选取甘草粉碎成80目的甘草粉，加入甘草粉重量8倍的水，加热至35℃，超声提取20min，循环提取3次，合并提取液，经浓缩、冷冻干燥后得到甘草提取物。
所述羟基磷灰石为纳米级羟基磷灰石，粒径为100nm；所述桑黄菌丝体培养用液体培养基的pH值用pH调节剂调整为5.5。
一种桑黄菌丝体的培养方法，采用上述液体培养基进行培养，包括以下步骤：
(1)将桑黄菌种接种液体培养基中进行活化培养，调整温度为26℃，摇床转速为120r/min下培养3天，得到种子培养液；
(2)将步骤(1)制得种子培养液按体积百分比为11％的接种量接种于液体培养基中，放置在液体发酵罐中，通入空气的速率为2L/min，发酵温度为28℃，搅拌转速为180r/min，进行发酵培养14天，得到桑黄菌丝体和发酵液的混合液；
(3)将步骤(2)得到的桑黄菌丝体和发酵液的混合液过滤，将滤液高速离心得到固形物，然后将滤饼和固形物混合并在75℃的温度下烘干，即得到桑黄菌丝体。所述步骤(3)的高速离心的转速为9000r/min。
实施例4
一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，包括以下重量份数的原料，以每升计：
土豆粉70g，玉米粉40g，桑木屑提取物8g，甘草提取物3g，葡萄糖3g，麦芽糖4g，酵母粉5g，蛋白胨7g，磷酸二氢钾3g，羟基磷灰石4g，硫酸镁1g，碳酸钙1.5g，维生素B 0.04g，柠檬酸三铵3g，四水乙酸镁1.1g，余量为水。
所述土豆粉和玉米粉均经过100目筛网过滤；所述桑木屑提取物经由以下制备方法制备而成，选取桑木屑粉碎成80目的桑木屑粉，加入质量浓度为70％的乙醇，所述桑木屑粉与乙醇的重量比为1:10，加热至45℃后，超声处理35min，循环提取3次，合并提取液，经浓缩、冷冻干燥后得到桑木屑提取物。
所述甘草提取物经由以下制备方法制备而成，选取甘草粉碎成100目的甘草粉，加入甘草粉重量6倍的水，加热至35℃，超声提取30min，循环提取3次，合并提取液，经浓缩、冷冻干燥后得到甘草提取物。
所述羟基磷灰石为纳米级羟基磷灰石，粒径为110nm；所述桑黄菌丝体培养用液体培养基的pH值用pH调节剂调整为6。
一种桑黄菌丝体的培养方法，采用上述液体培养基进行培养，包括以下步骤：
(1)将桑黄菌种接种液体培养基中进行活化培养，调整温度为27℃，摇床转速为110r/min下培养4天，得到种子培养液；
(2)将步骤(1)制得种子培养液按体积百分比为13％的接种量接种于液体培养基中，放置在液体发酵罐中，通入空气的速率为3L/min，发酵温度为28℃，搅拌转速为200r/min，进行发酵培养13天，得到桑黄菌丝体和发酵液的混合液；
(3)将步骤(2)得到的桑黄菌丝体和发酵液的混合液过滤，将滤液高速离心得到固形物，然后将滤饼和固形物混合并在80℃的温度下烘干，即得到桑黄菌丝体。所述步骤(3)的高速离心的转速为10000r/min。
对比例1
液体培养基中不添加甘草提取物，其余组分、配比和制备方法与实施例4完全相同。
对比例2
液体培养基中不添加桑木屑提取物，其余组分、配比和制备方法与实施例4完全相同。
对比例3
液体培养基中不添加羟基磷灰石，其余组分、配比和制备方法与实施例4完全相同。
对比例4
用pH调节剂调整液体培养基的pH值为4，其余组分、配比和制备方法与实施例4完全相同。
测试实施例1-4和对比例1-4获得桑黄菌丝体的产量，结果见表1。
表1
| 编号 | 实施例1 | 实施例2 | 实施例3 | 实施例4 |
| 菌丝体产量(g/L) | 24.3 | 25.1 | 24.6 | 25.4 |
| 编号 | 对比例1 | 对比例1 | 对比例1 | 对比例1 |
| 菌丝体产量(g/L) | 20.5 | 18.3 | 22.4 | 19.4 |
从表1的实验数据可以发现，本发明提供的液体培养基以及相应的培养方法能够得到较高产量的桑黄菌丝体。
本领域的技术人员容易理解，以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
Claims (9)
1.一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，其特征在于：包括以下重量份数的原料，以每升计：
土豆粉60-80g，玉米粉30-50g，桑木屑提取物5-15g，甘草提取物3-6g，葡萄糖3-6g，麦芽糖2-4g，酵母粉3-8g，蛋白胨5-10g，磷酸二氢钾2-5g，羟基磷灰石3-6g，硫酸镁1-3g，碳酸钙0.5-2g，维生素B 0.02-0.05g，柠檬酸三铵2-6g，四水乙酸镁0.8-1.5g，余量为水。
2.根据权利要求1所述的一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，其特征在于：所述土豆粉和玉米粉均经过100-200目筛网过滤。
3.根据权利要求1所述的一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，其特征在于：所述桑木屑提取物经由以下制备方法制备而成，选取桑木屑粉碎成80-100目的桑木屑粉，加入质量浓度为55-70％的乙醇，所述桑木屑粉与乙醇的重量比为1:8-10，加热至40-55℃后，超声处理25-35min，循环提取2-3次，合并提取液，经浓缩、冷冻干燥后得到桑木屑提取物。
4.根据权利要求1所述的一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，其特征在于：所述甘草提取物经由以下制备方法制备而成，选取甘草粉碎成80-100目的甘草粉，加入甘草粉重量5-10倍的水，加热至30-35℃，超声提取20-30min，循环提取2-3次，合并提取液，经浓缩、冷冻干燥后得到甘草提取物。
5.根据权利要求1所述的一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，其特征在于：所述羟基磷灰石为纳米级羟基磷灰石，粒径为80-120nm。
6.根据权利要求1所述的一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，其特征在于：所述桑黄菌丝体培养用液体培养基的pH值用pH调节剂调整为5-7。
7.根据权利要求1所述的一种桑黄菌丝体培养用液体培养基，其特征在于：
土豆粉70-80g，玉米粉40-50g，桑木屑提取物5-10g，甘草提取物3-5g，葡萄糖3-6g，麦芽糖2-4g，酵母粉3-6g，蛋白胨5-8g，磷酸二氢钾2-5g，羟基磷灰石4-6g，硫酸镁1-3g，碳酸钙0.5-2g，维生素B 0.02-0.05g，柠檬酸三铵2-6g，四水乙酸镁0.8-1.5g，余量为水。
8.一种桑黄菌丝体的培养方法，采用权利要求1-7任一项所述的液体培养基进行培养，其特征在于：包括以下步骤：
(1)将桑黄菌种接种液体培养基中进行活化培养，调整温度为24-30℃，摇床转速为100-130r/min下培养3-5天，得到种子培养液；
(2)将步骤(1)制得种子培养液按体积百分比为10-15％的接种量接种于液体培养基中，放置在液体发酵罐中，通入空气的速率为2-4L/min，发酵温度为25-30℃，搅拌转速为180-220r/min，进行发酵培养10-14天，得到桑黄菌丝体和发酵液的混合液；
(3)将步骤(2)得到的桑黄菌丝体和发酵液的混合液过滤，将滤液高速离心得到固形物，然后将滤饼和固形物混合并在70-80℃的温度下烘干，即得到桑黄菌丝体。
9.根据权利要求8所述的一种桑黄菌丝体的培养方法，其特征在于：所述步骤(3)的高速离心的转速为8000-10000r/min。
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