CN105624232B - 提高猴头菌发酵多糖的方法 - Google Patents

提高猴头菌发酵多糖的方法 Download PDF

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Abstract

本发明涉及遗传育种及生物活性物质生产技术领域的方法，公开了一种提高猴头菌发酵多糖的方法，包括以下步骤：(1)猴头菌原生质体制备；(2)辐照诱变虫草原生质体、原生质体再生；(3)挑选菌落，接种PDA培养基；(4)接种液体发酵培养基，该培养基由酵母膏、蛋白胨、葡萄糖、K2HPO4及MgSO4等营养物质组成。(5)发酵过程中添加吐温80和丙三醇；(6)猴头菌胞外多糖和胞内多糖的制备。该方法利用诱变技术获得菌丝生长速度快、生物量高的猴头菌株，通过在发酵过程中添加吐温80和丙三醇，来提高多糖的产量，通过膜分离技术来制备胞外多糖，通过超声的方法来制备胞内多糖。此方法获得多糖产量高，操作简单。

Description

提高猴头菌发酵多糖的方法
技术领域
本发明涉及遗传育种及生物活性物质生产技术领域的方法，尤其涉及提高猴头菌发酵多糖的方法。
背景技术
猴头菇(Hericium erinaceus)又名猴头、猴头蘑、猴头菌、刺猬菌等，是一种大型真菌，属担子菌纲，多孔菌目，齿菌科，猴头属，因其子实体形状像猴子头部而得名。研究发现，猴头菇具有广泛的药理活性。大量的医学和药理学研究表明，猴头菇多糖具有提高免疫力，抗肿瘤、抗衰老、降血脂等生理功能，对消化系统的癌变、溃疡、胃窦炎、慢性胃炎等病均有疗效。因此，猴头多糖制成的药品和保健品深受人们喜爱，开发前景广阔。猴头菌生长速度慢，天然资源有限，为扩大药源，目前多采用深层发酵培养生产猴头菌丝体及发酵液，满足临床和生产需要。用液体培养法具有以下优点：(1)大大缩短了生产周期(2)可进行工业化生产，大大提高产量。(3)节省劳动强度，降低生产成本；产品质量稳定。影响猴头菌液体发酵多糖产量的因素很多，菌种、培养基，培养条件等。本发明利用60Co辐射诱变技术获得生长速度快，生长势好的再生菌落进行液体培养，在发酵第4天的时候添加吐温80和丙三醇，来改变菌丝体的形态和增加细胞膜的通透性，从而提高猴头菌发酵多糖的产量。
发明内容
本发明针对现有技术的缺点，公开了提高猴头菌发酵多糖的方法。
为了解决上述技术问题，本发明通过下述技术方案得以解决。
提高猴头菌发酵多糖的方法，其特征在于：包括以下步骤，
A.菌种活化及接种：将猴头菌菌种接种在PDA斜面培养基上，在25℃恒温培养7天后，接种在PDA液体培养基中，25℃振荡培养7天，得到液体发酵菌丝体；
B.菌丝体的制备：100ml PDA液体培养基中得到的液体发酵菌丝体磨成泥状，收集菌丝，分别用灭菌水和0.6M硫酸镁等渗缓冲液冲洗；取0.5g菌丝加入1g酶液，30℃静置酶解3h，滤液离心，上清液离心得原生质体溶液；
C.吸取0.6ml原生质体溶液装于1ml离心管中，在冰浴条件下进行辐照诱变处理，处理剂量为100～150Gy，将诱变后的菌液涂布于平板上，置于25℃恒温培养箱进行培养；待再生培养基上长出菌落后，挑选单菌落，接种至PDA固体斜面培养基上，置于25℃恒温培养7d，得到诱变菌株菌块；
D.接种诱变菌株菌块于液体发酵培养基上，25～27℃摇床培养8天，液体发酵培养基组分及配比为10～20g/L的葡萄糖，1～2g/L的酵母膏，1～2g/L的蛋白胨，0.3～0.6g/L的MgSO4·7H2O，0.5～0.8g/L的K2HPO4；
在液体发酵第4天时，向发酵液中添加灭过菌的吐温80和丙三醇，继续发酵4天，吐温80占发酵液量的0.2～0.3％，丙三醇占发酵液量的0.01～0.03％；
E.发酵结束后，过滤发酵液，获得滤液与菌丝体，滤液离心，上清液直接用截留量>1万的超滤膜进行处理得浓缩液，浓缩液经冷冻干燥后得猴头菌胞外多糖；
F.步骤E得到的菌丝体用胶体磨研磨，匀浆后加水，水的质量为菌丝体质量的5倍，混匀，超声提取30～60分钟，将温度升至90～100℃再浸提60分钟，过滤收集滤液，用0.2MPa反渗透膜浓缩至滤液浑浊时，再加入3倍体积的95％的乙醇，离心、干燥、粉碎后，得猴头菌胞内多糖。
本发明采用猴头菌为菌种，经PDA培养基活化，液体摇瓶培养后，利用酶液水解猴头菌菌丝体，制备原生质体，采用60Co辐射诱变，诱变猴头菌原生质体，选择生长速度快，生长势好的再生菌落进行液体培养基培养，在液体发酵的第4天添加适量的吐温80及丙三醇，继续发酵4天，获得发酵产物。
作为优选，步骤B中，酶液组分为0.15～0.25g溶壁酶和8～12ml等渗液。
作为优选，步骤B中，100ml PDA液体培养基中得到的液体发酵菌丝体用捣碎机磨成泥状。
作为优选，步骤B中，取0.5g菌丝加入1g酶液，30℃静置酶解3h，滤液1000r/min离心3min，上清液采用3000r/min离心10min制得原生质体溶液。
作为优选，步骤E中，发酵结束后，过滤发酵液，获得滤液与菌丝体，滤液10000rpm/min离心15分钟。
作为优选，步骤F中，将滤液温度升至90～100℃再浸提60分钟，用板框过滤收集滤液。
与现有技术相比，本发明的有益效果为：
(1)本发明采用原生质体辐射诱变技术，是一种行之有效的微生物育种新方法，原生质体对辐射敏感性更强，更容易获得优良性状的菌株，猴头菌原生质体经辐射诱变后，菌丝生长速度较快且发酵后生物量增加，遗传性状稳定。
(2)在液体发酵过程中添加吐温80和丙三醇，不仅能够改变猴头菌液体发酵菌丝体的形态，还能够增加猴头菌细胞膜的通透性，使猴头菌发酵多糖的产量大大增加。
(3)在制备胞外多糖时，采用超滤的方法来浓缩和制备多糖，减少了乙醇的使用，操作非常方便有效。
具体实施方式
实施例1
提高猴头菌发酵多糖的方法，包括以下步骤，
A.菌种活化及接种：将猴头菌菌种接种在PDA斜面培养基上，在25℃恒温培养7天后，接种在PDA液体培养基中，25℃振荡培养7天，得到液体发酵菌丝体；
B.菌丝体的制备：100ml PDA液体培养基中得到的液体发酵菌丝体磨成泥状，收集菌丝，分别用灭菌水和0.6M硫酸镁等渗缓冲液冲洗；取0.5g菌丝加入1g酶液，30℃静置酶解3h，滤液离心，上清液离心得原生质体溶液；
C.吸取0.6ml原生质体溶液装于1ml离心管中，在冰浴条件下进行辐照诱变处理，处理剂量为100Gy，将诱变后的菌液涂布于平板上，置于25℃恒温培养箱进行培养；待再生培养基上长出菌落后，挑选单菌落，接种至PDA固体斜面培养基上，置于25℃恒温培养7d，得到诱变菌株菌块；
D.接种诱变菌株菌块于液体发酵培养基上，25℃摇床培养8天，液体发酵培养基组分及配比为10g/L的葡萄糖，1g/L的酵母膏，1g/L的蛋白胨，0.3g/L的MgSO4·7H2O，0.5g/L的K2HPO4；
在液体发酵第4天时，向发酵液中添加灭过菌的吐温80和丙三醇，继续发酵4天，吐温80占发酵液量的0.2％，丙三醇占发酵液量的0.01％；
E.发酵结束后，过滤发酵液，获得滤液与菌丝体，滤液离心，上清液直接用截留量>1万的超滤膜进行处理得浓缩液，浓缩液经冷冻干燥后得猴头菌胞外多糖，得率为0.54g/L；
F.步骤E得到的菌丝体用胶体磨研磨，匀浆后加水，水的质量为菌丝体质量的5倍，混匀，超声提取30分钟，将温度升至90℃再浸提60分钟，过滤收集滤液，用0.2MPa反渗透膜浓缩至滤液浑浊时，再加入3倍体积的95％的乙醇，离心、干燥、粉碎后，得猴头菌胞内多糖，得率为0.98g/L。
步骤B中，酶液组分为0.15g溶壁酶和8ml等渗液。
实施例2
提高猴头菌发酵多糖的方法，包括以下步骤，
A.菌种活化及接种：将猴头菌菌种接种在PDA斜面培养基上，在25℃恒温培养7天后，接种在PDA液体培养基中，25℃振荡培养7天，得到液体发酵菌丝体；
B.菌丝体的制备：100ml PDA液体培养基中得到的液体发酵菌丝体磨成泥状，收集菌丝，分别用灭菌水和0.6M硫酸镁等渗缓冲液冲洗；取0.5g菌丝加入1g酶液，30℃静置酶解3h，滤液离心，上清液离心得原生质体溶液；
C.吸取0.6ml原生质体溶液装于1ml离心管中，在冰浴条件下进行辐照诱变处理，处理剂量为150Gy，将诱变后的菌液涂布于平板上，置于25℃恒温培养箱进行培养；待再生培养基上长出菌落后，挑选单菌落，接种至PDA固体斜面培养基上，置于25℃恒温培养7d，得到诱变菌株菌块；
D.接种诱变菌株菌块于液体发酵培养基上，27℃摇床培养8天，液体发酵培养基组分及配比为20g/L的葡萄糖，2g/L的酵母膏，2g/L的蛋白胨，0.6g/L的MgSO4·7H2O，0.8g/L的K2HPO4；
在液体发酵第4天时，向发酵液中添加灭过菌的吐温80和丙三醇，继续发酵4天，吐温80占发酵液量的0.3％，丙三醇占发酵液量的0.03％；
E.发酵结束后，过滤发酵液，获得滤液与菌丝体，滤液离心，上清液直接用截留量>1万的超滤膜进行处理得浓缩液，浓缩液经冷冻干燥后得猴头菌胞外多糖，得率为0.64g/L；
F.步骤E得到的菌丝体用胶体磨研磨，匀浆后加水，水的质量为菌丝体质量的5倍，混匀，超声提取60分钟，将温度升至100℃再浸提60分钟，过滤收集滤液，用0.2MPa反渗透膜浓缩至滤液浑浊时，再加入3倍体积的95％的乙醇，离心、干燥、粉碎后，得猴头菌胞内多糖，得率为1.07g/L。
步骤B中，酶液组分为0.25g溶壁酶和12ml等渗液。
步骤B中，100ml PDA液体培养基中得到的液体发酵菌丝体用捣碎机磨成泥状。
步骤B中，取0.5g菌丝加入1g酶液，30℃静置酶解3h，滤液1000r/min离心3min，上清液采用3000r/min离心10min制得原生质体溶液。
步骤E中，发酵结束后，过滤发酵液，获得滤液与菌丝体，滤液10000rpm/min离心15分钟。
步骤F中，将滤液温度升至90℃再浸提60分钟，用板框过滤收集滤液。
实施例3
提高猴头菌发酵多糖的方法，包括以下步骤，
A.菌种活化及接种：将猴头菌菌种接种在PDA斜面培养基上，在25℃恒温培养7天后，接种在PDA液体培养基中，25℃振荡培养7天，得到液体发酵菌丝体；
B.菌丝体的制备：100ml PDA液体培养基中得到的液体发酵菌丝体磨成泥状，收集菌丝，分别用灭菌水和0.6M硫酸镁等渗缓冲液冲洗；取0.5g菌丝加入1g酶液，30℃静置酶解3h，滤液离心，上清液离心得原生质体溶液；
C.吸取0.6ml原生质体溶液装于1ml离心管中，在冰浴条件下进行辐照诱变处理，处理剂量为120Gy，将诱变后的菌液涂布于平板上，置于25℃恒温培养箱进行培养；待再生培养基上长出菌落后，挑选单菌落，接种至PDA固体斜面培养基上，置于25℃恒温培养7d，得到诱变菌株菌块；
D.接种诱变菌株菌块于液体发酵培养基上，26℃摇床培养8天，液体发酵培养基组分及配比为15g/L的葡萄糖，1.5g/L的酵母膏，1.5g/L的蛋白胨，0.5g/L的MgSO4·7H2O，0.6g/L的K2HPO4；
在液体发酵第4天时，向发酵液中添加灭过菌的吐温80和丙三醇，继续发酵4天，吐温80占发酵液量的0.25％，丙三醇占发酵液量的0.02％；
E.发酵结束后，过滤发酵液，获得滤液与菌丝体，滤液离心，上清液直接用截留量>1万的超滤膜进行处理得浓缩液，浓缩液经冷冻干燥后得猴头菌胞外多糖，得率为0.78g/L；
F.步骤E得到的菌丝体用胶体磨研磨，匀浆后加水，水的质量为菌丝体质量的5倍，混匀，超声提取40分钟，将温度升至95℃再浸提60分钟，过滤收集滤液，用0.2MPa反渗透膜浓缩至滤液浑浊时，再加入3倍体积的95％的乙醇，离心、干燥、粉碎后，得猴头菌胞内多糖，得率为0.89g/L。
步骤B中，酶液组分为0.2g溶壁酶和10ml等渗液。
步骤B中，100ml PDA液体培养基中得到的液体发酵菌丝体用捣碎机磨成泥状。
步骤B中，取0.5g菌丝加入1g酶液，30℃静置酶解3h，滤液1000r/min离心3min，上清液采用3000r/min离心10min制得原生质体溶液。
步骤E中，发酵结束后，过滤发酵液，获得滤液与菌丝体，滤液10000rpm/min离心15分钟。
步骤F中，将滤液温度升至95℃再浸提60分钟，用板框过滤收集滤液。
实施例4
提高猴头菌发酵多糖的方法，包括以下步骤，
A.菌种活化及接种：将猴头菌菌种接种在PDA斜面培养基上，在25℃恒温培养7天后，接种在PDA液体培养基中，25℃振荡培养7天，得到液体发酵菌丝体；
B.菌丝体的制备：100ml PDA液体培养基中得到的液体发酵菌丝体磨成泥状，收集菌丝，分别用灭菌水和0.6M硫酸镁等渗缓冲液冲洗；取0.5g菌丝加入1g酶液，30℃静置酶解3h，滤液离心，上清液离心得原生质体溶液；
C.吸取0.6ml原生质体溶液装于1ml离心管中，在冰浴条件下进行辐照诱变处理，处理剂量为120Gy，将诱变后的菌液涂布于平板上，置于25℃恒温培养箱进行培养；待再生培养基上长出菌落后，挑选单菌落，接种至PDA固体斜面培养基上，置于25℃恒温培养7d，得到诱变菌株菌块；
D.接种诱变菌株菌块于液体发酵培养基上，26℃摇床培养8天，液体发酵培养基组分及配比为15g/L的葡萄糖，1.5g/L的酵母膏，1.5g/L的蛋白胨，0.5g/L的MgSO4·7H2O，0.6g/L的K2HPO4；
在液体发酵第4天时，向发酵液中添加灭过菌的吐温80和丙三醇，继续发酵4天，吐温80占发酵液量的0.25％，丙三醇占发酵液量的0.02％；
E.发酵结束后，过滤发酵液，获得滤液与菌丝体，滤液离心，上清液直接用截留量>1万的超滤膜进行处理得浓缩液，浓缩液经冷冻干燥后得猴头菌胞外多糖，得率为0.74g/L；
F.步骤E得到的菌丝体用胶体磨研磨，匀浆后加水，水的质量为菌丝体质量的5倍，混匀，超声提取40分钟，将温度升至95℃再浸提60分钟，过滤收集滤液，用0.2MPa反渗透膜浓缩至滤液浑浊时，再加入3倍体积的95％的乙醇，离心、干燥、粉碎后，得猴头菌胞内多糖，得率为1.16g/L。
步骤B中，酶液组分为0.2g溶壁酶和10ml等渗液。
步骤B中，100ml PDA液体培养基中得到的液体发酵菌丝体用捣碎机磨成泥状。
步骤B中，取0.5g菌丝加入1g酶液，30℃静置酶解3h，滤液1000r/min离心3min，上清液采用3000r/min离心10min制得原生质体溶液。
步骤E中，发酵结束后，过滤发酵液，获得滤液与菌丝体，滤液10000rpm/min离心15分钟。
步骤F中，将滤液温度升至100℃再浸提60分钟，用板框过滤收集滤液。
总之，以上所述仅为本发明的较佳实施例，凡依本发明申请专利范围所作的均等变化与修饰，皆应属本发明专利的涵盖范围。

Claims (6)

1.提高猴头菌发酵多糖的方法，其特征在于：包括以下步骤，
A.菌种活化及接种：将猴头菌菌种接种在PDA斜面培养基上，在25℃恒温培养7天后，接种在PDA液体培养基中，25℃振荡培养7天，得到液体发酵菌丝体；
B.菌丝体的制备：100ml PDA液体培养基中得到的液体发酵菌丝体磨成泥状，收集菌丝，分别用灭菌水和0.6M硫酸镁等渗缓冲液冲洗；取0.5g菌丝加入1g酶液，30℃静置酶解3h，滤液离心，上清液离心得原生质体溶液；
C.吸取0.6ml原生质体溶液装于1ml离心管中，在冰浴条件下进行辐照诱变处理，处理剂量为100～150Gy，将诱变后的菌液涂布于平板上，置于25℃恒温培养箱进行培养；待再生培养基上长出菌落后，挑选单菌落，接种至PDA固体斜面培养基上，置于25℃恒温培养7d，得到诱变菌株菌块；
D.接种诱变菌株菌块于液体发酵培养基上，25～27℃摇床培养8天，液体发酵培养基组分及配比为10～20g/L的葡萄糖，1～2g/L的酵母膏，1～2g/L的蛋白胨，0.3～0.6g/L的MgSO4·7H2O，0.5～0.8g/L的K2HPO4；
在液体发酵第4天时，向发酵液中添加灭过菌的吐温80和丙三醇，继续发酵4天，吐温80占发酵液量的0.2～0.3％，丙三醇占发酵液量的0.01～0.03％；
E.发酵结束后，过滤发酵液，获得滤液与菌丝体，滤液离心，上清液直接用截留量>1万的超滤膜进行处理得浓缩液，浓缩液经冷冻干燥后得猴头菌胞外多糖；
F.步骤E得到的菌丝体用胶体磨研磨，匀浆后加水，水的质量为菌丝体质量的5倍，混匀，超声提取30～60分钟，将温度升至90～100℃再浸提60分钟，过滤收集滤液，用0.2MPa反渗透膜浓缩至滤液浑浊时，再加入3倍体积的95％的乙醇，离心、干燥、粉碎后，得猴头菌胞内多糖。
2.根据权利要求1所述的提高猴头菌发酵多糖的方法，其特征在于：步骤B中，酶液组分为0.15～0.25g溶壁酶和8～12ml等渗液。
3.根据权利要求1所述的提高猴头菌发酵多糖的方法，其特征在于：步骤B中，100mlPDA液体培养基中得到的液体发酵菌丝体用捣碎机磨成泥状。
4.根据权利要求1所述的提高猴头菌发酵多糖的方法，其特征在于：步骤B中，取0.5g菌丝加入1g酶液，30℃静置酶解3h，滤液1000r/min离心3min，上清液采用3000r/min离心10min制得原生质体溶液。
5.根据权利要求1所述的提高猴头菌发酵多糖的方法，其特征在于：步骤E中，发酵结束后，过滤发酵液，获得滤液与菌丝体，滤液10000rpm/min离心15分钟。
6.根据权利要求1所述的提高猴头菌发酵多糖的方法，其特征在于：步骤F中，将温度升至90～100℃再浸提60分钟，用板框过滤收集滤液。
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