CN103215311A

CN103215311A - 一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法

Info

Publication number: CN103215311A
Application number: CN 201310052967
Authority: CN
Inventors: 黄志琴
Original assignee: Individual
Current assignee: Individual
Priority date: 2012-08-28
Filing date: 2013-02-01
Publication date: 2013-07-24

Abstract

本发明公开了一种利用黑曲霉菌(Aspergillus niger)转化生产优质沉香的方法，包括如下步骤：对黑曲霉菌种An-53CCTCC M2012304进行菌种分离、纯化和鉴定；对黑曲霉进行发酵培养；对黑曲霉的发酵液经过过滤和浓缩制得黑曲霉胞外酶浓缩液；黑曲霉胞外酶转化合成优质沉香。本发明方法简便、用途广泛，生产的沉香条可用于燃香和入药，操作简便、成本低廉、无需专业设备适合沉香种植户；本发明可生产用于高档工艺品制作的大尺寸沉香块，适合大面积种植沉香的基地或企业，实现沉香的量产并能够大幅度提高沉香质量等级；通过发酵法可以直接将沉香树干粉末转化合成优质沉香油并用于生产香水。

Description

一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法

技术领域

本发明属于沉香生产技术领域，具体的说是涉及一种采用转化合成沉香的黑曲霉胞外酶制备转化合成优质沉香的方法。

背景技术

沉香是瑞香科植物白木香Aquilaria sinensis(Lour.)Gilg含树脂的木材，是我国、印度及其他东南亚国家的传统名贵中药，具有行气止痛、纳气平喘、温中止呕的功效。同时，其具有浓郁而独特的香气，故常被用来制造高级香水、高级香精等。白木香是国产沉香的唯一植物资源，其树干在受到损伤或刺激的情况下才能分泌沉香树脂，但这需要十几年甚至几十年的累积。天然沉香的偶然性及长周期性已远不能满足市场需求，人们便开始使用各种人工促香方法促进白木香结香并且从未间断对沉香形成机制的探索。

虽然白木香结香机制尚未明确，但普遍认为沉香的形成可能是由于树干损伤后被一种或数种真菌侵入寄生，在真菌体内酶的作用下，使木薄壁细胞贮存的淀粉发生一系列变化，形成香脂，经多年沉积而得。一直以来，国内学者也进行着人工结香方面的研究。1976年，广东植物研究所对凿洞后1、6、12、18、24个月的5批白木香样品进行了组织化学和解剖学研究。组织化学研究结果显示，木材薄壁细胞内的淀粉依次经过中间产物非淀粉的多糖、醛类或酮类及酚类化合物转化成了沉香。该研究小组又成功地从白木香中分离了黄绿墨耳菌Menanotus flavolives，并证实该菌可大大加速沉香的转化合成进程，并证实沉香形成是由于由于真菌寄生并分泌的酶类作用下，使木材组织薄壁细胞储存的淀粉产生一系列的变化，最后形成沉香树脂。但是，由于黄绿墨耳菌生长繁殖受气候和环境条件影响较大，该菌株在白木香树干生长非常缓慢，导致结香效率不高且不稳定，导致该菌一直未能实现规模化推广使用。

发明内容

本发明的目的在于针对目前缺乏有效沉香转化菌株的现状，克服现有技术中存在的不足，提供一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，从而能够实现规模化生产沉香。

本发明是通过以下技术方案实现的：一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，沉香转化真菌菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)，其包括如下步骤：

a、首先对黑曲霉菌种An-53CCTCC M2012304进行菌种分离、纯化和鉴定步骤，从野生高品质沉香中分离纯化黑曲霉菌，并对分离出的黑曲霉菌进行形态学鉴定；

b、然后对黑曲霉进行培养，包括活化培养、种子液培养和发酵培养；

c、对黑曲霉的发酵液经过过滤和浓缩步骤，制得黑曲霉胞外酶浓缩液；

d、黑曲霉胞外酶转化合成优质沉香：

固化菌株接种刺激造香，发酵液或胞外酶浓缩液注入沉香树转化生产沉香；发酵液或胞外酶浓缩液转化木屑合成沉香油。

步骤a菌种分离过程中菌种分离筛选培养基的制备方法为：35目沉香树干粉末煮沸25min～35min，纱布过滤，定容至1000mL，加入0，8％～1.2％葡萄糖，1％～2％琼脂，在pH为7～8、110℃～130℃的条件下灭菌25min～35min。

作为本发明的最佳实施方案：步骤a菌种分离过程中菌种分离筛选培养基的制备方法为：35目沉香树干粉末煮沸30min，纱布过滤，定容至1000mL，加入1％葡萄糖，1.5％琼脂，在pH为7.5、121.5℃的条件下灭菌30min。

步骤c发酵培养过程中发酵培养基的制备方法为：35目沉香树干粉末煮沸25min～35min，用纱布过滤，加入80g～120g葡萄糖、0.3g～0.4g KH2PO4、0.1g～0.2g MgSO4·7H2O、30g～40g CaCO3、0.5g～0.6g尿素，加蒸馏水至1L，在自然pH值、110℃～130℃℃的条件下灭菌25min～35min。

作为本发明的最佳实施方案：步骤c发酵培养过程中发酵培养基的制备方法为：35目沉香树干粉末煮沸30min，用纱布过滤，加入100g葡萄糖、0.35gKH2PO4、0.15g MgSO4·7H2O、35g CaCO3、0.55g尿素，加蒸馏水至1L，在自然pH值、121.5℃的条件下灭菌30min。

已有研究证实黑曲霉是一种广泛存在于自然界的腐生真菌，黑曲霉具有强大的聚合物降解酶系，可产生淀粉酶、蛋白酶、纤维素酶、果胶酶和葡萄糖氧化酶等超过30种胞外蛋白，赋予其在贫瘠生长条件下能够快速生长和发酵的能力，且保持旺盛的代谢活性而不易受到环境微生物的影响，在能够适应开放或封闭环境中快速生长和繁殖，黑曲霉菌在食品、啤酒与酿造、制药等诸多行业广泛应用。本发明采用的黑曲霉菌，可用于转化法生产优质沉香。

本发明的有益效果是：本发明成功的从高品质野生沉香中分离筛选到一株黑霉菌Aspergillus niger An-53，将其接种在健康沉香树中1个月成功在伤口附近转化合成沉香，将其发酵液或胞外酶浓缩液输入沉香树1个月能够实现整个沉香树干结香，而发酵液或胞外酶浓缩液也能够快速转化沉香树干木屑合成沉香油。本发明发酵培养分离于沉香中的黑霉菌An-53，并利用其分泌的胞外酶(如淀粉酶、纤维素酶和果胶酶等)转化木材中薄壁细胞储存的淀粉、多糖等营养物质合成沉香，具有广阔的应用前景。本发明方法简便且用途广泛，采用黑曲霉固化接种树体方法可生产沉香条用于燃香和入药，该方法操作简便、成本低廉、无需专业设备适合沉香种植户；黑曲霉发酵液或胞外酶浓缩液注入树体可生产大尺寸沉香块用于高档工艺品制作，该方法适合大面积种植沉香的基地或企业，能够实现大面积沉香转化合成沉香并能够大幅度提高沉香产量和等级；通过发酵法直接将沉香树干粉末转化合成优质沉香油并可用于生产香水，从而实现大规模工业化生产高价值沉香油。

附图说明

图1是本发明一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法的生产流程图；

图2为本发明野生沉香中分离的黑曲霉An-53菌落形态学特征图；

图3为本发明中黑曲霉真菌PCR扩增鉴定电泳图；

图4为本发明接种黑曲霉菌刺激生产高品质黑褐色沉香的结果图。

具体实施方式

以下所述仅是本发明的优选实施方式，但不应理解为对本发明的限制。应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可以做出若干改进和替换，这些改进和替换也应视为本发明的保护范围，以下结合附图对本发明作详细描述。

如图1至图4所示，一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，沉香转化真菌菌株为黑曲霉(Aspergillus niger)，其包括如下步骤：a、首先对黑曲霉菌种An-53CCTCC M2012304进行菌种分离、纯化和鉴定步骤：

菌种分离：精密称取1g高品质沉香样品，至于培养皿，用无菌蒸馏水冲洗3次，将样品转移至无菌研钵中研碎，加入9ml无菌水稀释，之后用同样的等浓度梯度进行稀释，配制10-1，10-2，10-3，10-4，10-5等5个浓度梯度，用无菌移液管吸取1ml缓缓注入筛选培养基上，分离筛选培养基的制备方法为：35目沉香树干粉末煮沸30min，纱布过滤，定容至1000mL，加入1％葡萄糖，1.5％琼脂，在pH为7.5、121.5℃的条件下灭菌30min，摇匀，密封置于28℃条件下暗培养，4d～5d后菌落长满整个平板。

菌种纯化：根据初分菌落的形态特征，用接种针挑取各菌落的少量菌丝体，接种在事先准备好的筛选培养基上，菌丝体生长7d后，根据长出的各菌落特点进行筛选和纯化，如此反复，直至菌落的生长状态和形态特征表现一致时视为单一菌种的菌落。菌种保存：纯化后的病原菌，保存在含液体石蜡的PDA斜面试管中。

从野生高品质沉香中分离纯化黑曲霉菌，并对分离出的黑曲霉菌进行形态学鉴定：通过菌落及菌体形态的观察，如图2所示，可以观察到菌种在PDA培养基上生长2d可以形成单菌落。菌株生长良好，菌落表面突起，呈现圆形，边缘粗糙，菌落四周有明显的透明圈。菌落初白色，后变黑。分枝菌丝均具隔膜，菌丝每个细胞中常含多核。分生孢子梗单生、簇生或集结成孢梗束，其内合生或离生产孢细胞，产孢细胞产生形形色色的分生孢子。在无菌条件下，用接种针挑取适量菌种于澄清的摇瓶发酵培养基中，28℃液体发酵培养96h之后菌株在培养基中迅速而均匀的生长，达到最大的混浊度。菌体逐渐沉淀到培养基的底部，菌体呈灰黑色。此菌株生殖过程中缺少或未发现有性生殖阶段，是无性生殖，属于半知菌门。根据《真菌鉴定手册》方法，采用载玻片培养法培养真菌，光学显微镜下观察菌丝体大小、形态、表面特征及是否有横隔、孢子大小、形状、类型等对照确定该菌株为半知菌亚门(Deuteromyeotina)，丝孢菌纲(Hyphomyeetes)，丝孢目(Hyphomyeetales)，从梗孢科(Moniliales)，曲霉属(Aspergiuus)，黑曲霉种(Aspergillus niger)。

将保藏的菌株于PDA平板上进行活化培养5d～7d，用灭菌的接菌针将菌丝体刮入已灭菌的研钵中，用液氮研磨成细粉后，按照真菌基因组提取试剂盒(TaKaRa公司)步骤提取基因组DNA，-20℃保存备用。所提基因组DNA为模板进行PCR扩增，用真菌ITS序列通用引物ITS4(5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’)和ITS5(5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’)。PCR反应体系(50μL)：4μL dNTP，ITS51μL，ITS41μL，Taq酶1μL，Buffer5μL，模板5μL，ddH2O33μL。PCR扩增条件为95℃预变性4min；92℃下变性1min；52℃退火1min；72℃延伸2min；循环30次；最后72℃下延伸5min，0.8％琼脂糖电泳PCR产物，结果如图3所示。采用TaKaRa琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒回收纯化PCR产物，并将目的片段的序列测定由TaKaRa公司进行。将测得的ITS基因序列在NCBI上进行同源性检索，结果表明，所测序列与黑曲霉同源性为100％。综合形态特征和ITS基因序列同源性两方面分析，该菌株鉴定为黑曲霉。

b、然后对黑曲霉进行培养，包括活化培养、种子液培养和发酵培养；c、对黑曲霉的发酵液经过过滤和浓缩步骤，制得黑曲霉胞外酶浓缩液；d、黑曲霉胞外酶转化合成优质沉香：固化菌株接种刺激造香，发酵液或胞外酶浓缩液注入沉香树转化生产沉香；发酵液或胞外酶浓缩液转化木屑合成沉香油。

步骤c发酵培养过程中发酵培养基的制备方法为：35目沉香树干粉末煮沸30min，用纱布过滤，加入100g葡萄糖、0.35g KH2PO4、0.15g MgSO4·7H2O、35g CaCO3、0.55g尿素，加蒸馏水至1L，在自然pH值、121.5℃的条件下灭菌30min。

保藏活化培养基(PDA培养基)的制备方法为：马铃薯(200g)洗净去皮，切成小块，煮沸30min，纱布过滤，定容至1000mL，加入1％葡萄糖(10g)，1.5％琼脂(1.5g)，pH7.5，121.5℃，灭菌30min。

种子培养基的制备方法为：50g葡萄糖、0.2g KCl、0.15g KH2PO4、0.12gMgSO4·7H2O、0.6g(NH4)2HPO4、3g酵母膏、2g蛋白胨，加蒸馏水1L，自然pH值，121.5℃，灭菌30min。

本发明提供了一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，从高品质野生沉香中分离和鉴定后得到沉香转化菌株，并在4℃下保藏备用。学名鉴定为Aspergillus niger，菌株命名为黑曲霉An-53。首先，黑曲霉活化培养：挑1环孢子于PDA斜面培养基上，28℃培养箱中培养72h；然后，种子液培养：500ml的三角瓶中装入100ml种子培养基，于28℃摇床上180r/min振荡培养24h；其次，发酵培养：250ml的三角瓶中装入50ml的发酵培养基，于30℃摇床上200r/min振荡培养48h；最后，胞外酶液制备：发酵液先用两层纱布过滤，滤液冷冻离心(4℃、10000r/min离心15min)，所得的上清液即为粗酶液，于4℃保存，也可干燥至粉状制成胞外酶粉剂用于长期保存。将制备的黑曲霉胞外酶液注入沉香树体，进行树体内转化合成沉香，也可利用黑曲霉胞外酶液对沉香树干木屑进行树体外发酵。

固化接种黑曲霉菌刺激沉香树干生产沉香条：在大树上用锯或凿在树干的同一边，从上到下每隔40～50cm开一香门，香门长为树干粗的一半，深度为树干粗的一半，宽为1cm。如果是小树，则每隔15cm钻一个洞，从树干一面穿向对面，以不穿透为准。开凿香门后，天气干燥时用冷水淋湿伤口，随即将PDA平板培养的黑曲霉菌种塞满香门，用塑料薄膜包扎封口，以防杂菌的污染或昆虫、蚂蚁的危害，又可保湿以利菌种繁殖。当上下伤口都结香而相连接，大约1年后整株砍下可采集沉香。结果显示黑曲霉菌为沉香树体内的优势菌株，其分泌的胞外蛋白能够显著转化合成沉香，1年后，在香门附近5cm范围内产生高品质黑褐色沉香药材，如图4所示。

在沉香树注入黑曲霉菌胞外酶转化合成高价值沉香块：与树干成45度由上向下在沉香树树干钻孔，通过注射器或输液器装置将黑曲霉菌胞外酶溶液注入树体内，刺激沉香树产生沉香，为提高造香量，间隔1个月可再次施加一次。可采用半断干的方法查看收集结香效果测定沉香品质。转化合成沉香6个月后，割取含树脂的木材，除去不含树脂部分，阴干后即为高品质沉香。参照《中国药典》(2010年版)I部附录XA浸出物测定法制取沉香油，并对所得沉香样品的醇溶性浸出物含量进行了测定。对沉香随机挑选3份样品的醇浸出物进行了含量测定，得实验产出的沉香样品醇溶性浸出物含量≥10％，达到药典要求水平。

黑曲霉转化木屑合成高价值沉香油：将沉香树干粉碎成木屑，放入烘干箱，60℃烘2～3h，粉碎，过35目筛，121.5℃灭菌30min。将灭菌的50克树干粉末加入500ml黑曲霉发酵液中，28℃200r/min催化合成转化24h。结果显示沉香油的产量得到明显提高，沉香油得率从0.13％提高到0.58％。利用该项技术进行沉香油的生产，沉香油产量得到明显提高，实现了沉香油的工业化生产。生物材料样品保藏单位：中国典型培养物保藏中心。保藏单位地址：湖北省武汉市武昌区珞珈山武汉大学生命科学学院。保藏日期：2012年7月30日。保藏编号：NO：CCTCC M2012304。分类命名：黑曲霉Chenxiang-GD128Aspergillus niger Chenxiang-Gd128。

最后应当说明的是，以上内容仅用以说明本发明的技术方案，而非对本发明保护范围的限制，本领域的普通技术人员对本发明的技术方案进行的简单修改或者等同替换，均不脱离本发明技术方案的实质和范围。

Claims

1.一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，其特征在于：所述利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法包括如下步骤：

d、黑曲霉胞外酶转化合成优质沉香：

2.根据权利要求1所述的一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，其特征在于：所述步骤a菌种分离过程中菌种分离筛选培养基的制备方法为：35目沉香树干粉末煮沸25min～35min，纱布过滤，定容至1000mL，加入0，8％～1.2％葡萄糖，1％～2％琼脂，在pH为7～8、110℃～130℃的条件下灭菌25min～35min。

3.根据权利要求2所述的一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，其特征在于：所述步骤a菌种分离过程中菌种分离筛选培养基的制备方法为：35目沉香树干粉末煮沸30min，纱布过滤，定容至1000mL，加入1％葡萄糖，1.5％琼脂，在pH为7.5、121.5℃的条件下灭菌30min。

4.根据权利要求1、2或3所述的一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，其特征在于：所述步骤c发酵培养过程中发酵培养基的制备方法为：35目沉香树干粉末煮沸25min～35min，用纱布过滤，加入80g～120g葡萄糖、0.3g～0.4g KH₂PO₄、0.1g～0.2g MgSO₄·7H₂O、30g～40g CaCO₃、0.5g～0.6g尿素，加蒸馏水至1L，在自然pH值、110℃～130℃℃的条件下灭菌25min～35min。

5.根据权利要求4所述的一种利用黑曲霉菌转化生产优质沉香的方法，其特征在于：所述步骤c发酵培养过程中发酵培养基的制备方法为：35目沉香树干粉末煮沸30min，用纱布过滤，加入100g葡萄糖、0.35g KH₂PO₄、0.15gMgSO₄·7H₂O、35g CaCO₃、0.55g尿素，加蒸馏水至1L，在自然pH值、121.5℃的条件下灭菌30min。