CN103865803B - β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备京尼平和白藜芦醇中的应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开了一种β-葡萄糖苷酶高产菌，系以栀子为碳源从自然界中筛选到的，其保藏编号为CCTCC？NO.M2013634，分类命名为罗尔夫青霉（Penicillium？rolfsii）HXL，该菌能高效转化京尼平苷和白藜芦醇苷为京尼平和白藜芦醇。据此，发明人建立了一种利用上述β-葡萄糖苷酶高产菌转化制备京尼平和白藜芦醇的方法，一方面可在温和条件下分别水解京尼平苷和白藜芦醇苷，避免了传统方法导致有效成分损失的缺陷，有效地提高了产量；另一方面利用现代微生物发酵工程技术和酶工程技术使栀子或虎杖的有效成分京尼平或白藜芦醇苷在体外可控条件下实现规模转化，降低了生产成本，提高了生产效率。应用本发明可为大量工业化生产β-葡萄糖苷酶、京尼平和白藜芦醇提供一条可行途径，具有较大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。

Description

β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备京尼平和白藜芦醇中的应用

技术领域

本发明属于微生物生物转化技术领域，尤其涉及一种β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备京尼平和白藜芦醇中的应用。

背景技术

京尼平是一种环烯醚萜类物质，是桅子中起主要药效作用的重要成分。京尼平对治疗肝硬化具有显著疗效，亦具有显著抗炎、抗脂质过氧化、抗血管生成等药效，京尼平还可被应用于生物材料的交联，它不仅能形成稳定的交联制品，同时具有细胞毒性小、生物相容性好、抗降解能力强和应用领域广泛等优点，是非常有前途的生物交联剂。京尼平在栀子中的含量很低（约为0.005%～0.01%），直接提取十分困难，主要以其前体形式-京尼平苷形式存在（含量约为3%～5%）。孙步祥等发明了一种从桅子中提取京尼平苷及京尼平的制备方法（专利申请号200710090208.7公开日2007年09日05），通过提取、浓缩、冷冻干燥等步骤制得京尼平，含量为90%以上，但该法提取工艺复杂，且提取过程使用有机溶剂不利于提高产品质量。目前，京尼平生产多使用酶解法，即直接利用β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷转化生产京尼平。杨丹等从桅子中分离得到高纯度的京尼平苷，然后使用β-葡萄糖苷酶水解京尼平苷20h，京尼平苷的转化率达90%，然而，由于β-葡萄糖苷酶价格昂贵，该法未能实现工业化生产。

白藜芦醇是中草药虎杖中的一种天然活性物质，化学名称为芪三酚(即3，5，4’－三羟基－l，2一二苯基乙烯)，是一种活性多酚物质，分子式为C₁₄H₁₂O₃。虎杖中白黎芦醇往往以葡萄糖苷(即虎杖苷)的形式存在，虎杖苷在肠道中糖苷酶的作用下可分解为白黎芦醇，而发挥药理作用。白黎芦醇具有抑制肿瘤、抗氧化、抗自由基、抗血栓、抗过敏、抗动脉粥样硬化和防治冠心病、缺血性心脏病、高血脂症等作用，白黎芦醇已被列为抗心血管、抗癌最有前途的药物之一，它是继紫杉醇以后的又一绿色抗癌物质。白黎芦醇具有独特的化学和生理活性，在护肤品中可起到多重作用，例如抗氧化、抗衰老、抗紫外线、增白及保湿等，因而对多种因素造成的皮肤老化(皱纹和色素沉着)都有独到的功效。现代方法获得白黎芦醇主要有直接从植物中提取、化学合成法、复合酶酶解法和生物合成法等。目前，有人用酸碱水解法或改性纤维素酶解法对虎杖苷进行分解，但是酸碱会造成环境污染还降低产量，而改性纤维素酶法成本较高、工艺较为复杂，因此均不利于推广应用。

β-葡萄糖苷酶作为纤维素酶的一种重要组成部分，在医疗、食品生物转化中有重要的应用价值。β-葡萄糖苷酶在水解京尼平苷和白黎芦醇苷生成京尼平和白黎芦醇方面的应用是β-葡萄糖苷酶的一种新的用途。京尼平和白黎芦醇的药用价值极高，但目前的产量远远不能满足市场需求，采用β-葡萄糖苷酶转化技术，能够将栀子和虎杖中含量较高的糖苷结合形式的京尼平苷和白黎芦醇苷水解为游离的京尼平和白黎芦醇，从而大大提高京尼平和白黎芦醇的产量。

纤维素酶在自然界的分布很广泛，昆虫、软体动物、高等植物、细菌、放线菌和真菌都能产生纤维素酶，甚至哺乳动物中的反刍动物的瘤胃及猪大肠中也有能够分解纤维素的菌群存在。纤维素酶的产酶菌很多，主要有细菌、放线菌和丝状真菌，丝状真菌的纤维素酶产量较高，可达20g/L以上。

国内近年来β-葡萄糖苷酶的研究已经成为热点，已由过去研究β-葡萄糖苷酶的简单提取到现在的产酶条件优化以及粗酶液的纯化。虽然β-葡萄糖苷酶基因已成功克隆表达，新构建的工程菌也已应用到生产实践中，但利用β-葡萄糖苷酶对提取出的京尼平苷和白藜芦醇苷进行酶解仍然存在很多不足，如：工艺复杂、成本过高，从而限制了其进一步发展。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种能高效转化白藜芦醇苷为白藜芦醇、京尼平苷为京尼平的β-葡萄糖苷酶高产菌及其在转化制备京尼平和白藜芦醇中的应用。

为解决上述技术问题，本发明采用以下技术方案：β-葡萄糖苷酶高产菌，保藏编号为CCTCCNO.M2013634，分类命名为罗尔夫青霉（Penicilliumrolfsii）HXL。

上述β-葡萄糖苷酶高产菌在转化制备京尼平中的应用。

利用上述β-葡萄糖苷酶高产菌转化制备京尼平的方法，包括以下步骤：

（1）种子制备：将保存的罗尔夫青霉HXL孢子接种于斜面培养基上，置于35℃恒温培养箱培养3天，获得孢子，用无菌水洗脱孢子获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接入摇瓶发酵培养基；斜面培养基为查氏培养基；摇瓶发酵培养基是在产酶优化培养基基础上加入10%的栀子液；

（2）转化制备京尼平：在温度为35℃、pH7.0、装液量为100ml/250ml、接种量为1.5%、转速180r/min的条件下发酵168h。

栀子液按以下操作制备：取10g粉碎栀子按质量体积比1:10加蒸馏水煮60分钟，用纱布过滤，依法重复煮三～四次；合并滤液，最后用蒸馏水将滤液定容至100ml，得栀子煮提液。

上述β-葡萄糖苷酶高产菌在转化制备白藜芦醇中的应用。

利用上述β-葡萄糖苷酶高产菌转化制备白藜芦醇的方法，包括以下步骤：

（1）将保存的罗尔夫青霉HXL孢子接种于斜面培养基上，置于35℃恒温培养箱培养3天，获得孢子，用无菌水洗脱孢子获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接入摇瓶发酵培养基；斜面培养基为查氏培养基；摇瓶发酵培养基是产酶优化培养基；

（2）转化制备白藜芦醇：在温度为35℃、pH7.0、装液量为100ml/250ml、接种量为1.5%、转速180r/min的条件下发酵168h，加入10%虎杖液，在温度为50℃、pH5.0的条件下反应2h。

虎杖液按以下操作制备：取10g虎杖按质量体积比1:10用蒸馏水浸泡20分钟，然后煮沸30分钟，冷却后用8层纱布过滤，依法重复煮三次；合并滤液，最后用蒸馏水将滤液定容至100ml，得虎杖煮提液。

孢子悬浮液浓度为1.0×10⁸个/ml。

产酶优化培养基配方为麸皮粉2%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、抗坏血酸0.1%。

发明人以栀子为碳源从自然界中筛选到一株β-葡萄糖苷酶产生菌（保藏编号为CCTCCNO.M2013634，分类命名为罗尔夫青霉（Penicilliumrolfsii）HXL），该菌能高效转化京尼平苷和白藜芦醇苷为京尼平和白藜芦醇。据此，发明人建立了一种利用上述β-葡萄糖苷酶高产菌转化制备京尼平和白藜芦醇的方法，采用产酶基础培养基，利用体外微生物发酵法模拟人体内肠道微生物转化的方式对京尼平苷和白藜芦醇苷进行有效地转化而生成京尼平和白藜芦醇，并通过单因素实验优化，确定微生物发酵产酶的最佳条件及微生物转化得到产物京尼平和白藜芦醇的最佳条件，一方面可在温和条件下分别水解京尼平苷和白藜芦醇苷，避免了传统方法导致有效成分损失的缺陷，有效地提高了产量；另一方面利用现代微生物发酵工程技术和酶工程技术使栀子或虎杖的有效成分京尼平或白藜芦醇苷在体外可控条件下实现规模转化，降低了生产成本，提高了生产效率。应用本发明可为大量工业化生产β-葡萄糖苷酶、京尼平和白藜芦醇提供一条可行途径，具有较大的经济效益和社会效益，市场开发前景广阔。

附图说明

图1是罗尔夫青霉HXL产酶条件优化—发酵时间对产酶的影响结果图。

图2是罗尔夫青霉HXL产酶条件优化—碳源对产酶的影响结果图。

图3是罗尔夫青霉HXL产酶条件优化—氮源对产酶的影响结果图。

图4是罗尔夫青霉HXL产酶条件优化—磷酸二氢钾浓度对产酶的影响结果图。

图5是罗尔夫青霉HXL产酶条件优化—发酵温度对产酶的影响结果图。

图6是罗尔夫青霉HXL产酶条件优化—接种量对产酶的影响结果图。

保藏信息说明

罗尔夫青霉（Penicilliumrolfsii）HXL，保藏号为CCTCCNO.M2013634，保藏日期：2013年12月6日，保藏地址为：中国.武汉.武汉大学，保藏单位：中国典型培养物保藏中心。

具体实施方式

以下结合实施例及附图，对本发明作进一步详细说明。

一、菌种的筛选

土样取自广西玉林中药港垃圾场的土壤，以10%的栀子液做为反应底物，配以改良查氏培养基（在查氏培养基中去除蔗糖）形成初筛培养基，利用京尼平苷经β-葡萄糖苷酶水解后生成京尼平与谷氨酸反应生成蓝色，判断是否存在产β-葡萄糖苷酶真菌菌株，工艺为：

（1）菌种初筛：取所采的土样5g，加入到装有45mL无菌水的三角瓶中，振荡5min，制成土壤悬液，梯度稀释10^-1～10^-7倍。选择适宜稀释倍数的菌悬液分别涂布于初筛平板培养基上，置于35℃培养箱中倒置培养，48h后观察现象。

保藏培养基：查氏琼脂斜面固体培养基。

初筛培养基组成以百分比计为：NaNO₃0.3%，MgSO₄.7H₂00.05%，FeSO₄0.001%，K₂HPO₄0.1%，KCl0.05%，栀子液10%，谷氨酸1%，琼脂2%。

栀子液按以下操作制备：取10g粉碎栀子按质量体积比1:10加蒸馏水煮60分钟，用纱布过滤，依法重复煮三～四次；合并滤液，最后用蒸馏水将滤液定容至100ml，得栀子煮提液。

经过初筛（含有栀子液的查氏平板），有五株菌株在初筛平板中有蓝色显色圈，说明这五株菌能够产生β-葡萄糖苷酶，将这五株菌命名为HXL、HXL1、HXL2、HXL3、HXL4。

（2）菌种的复筛：初筛获得的菌种接种到产酶基础培养基中发酵，利用DNS法测定酶活（以IU计）。

产酶基础培养基：麸皮汁4%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.1%、醋酸钠0.1%、磷酸氢二钾0.2%、尿素0.2%、抗坏血酸0.1%。

结果：HXL的酶活最高，达到10IU/ml。

二、菌种的鉴定及发酵条件的优化

1、菌种的鉴定

（1）菌落形态观察

将HXL斜面菌点接至有查氏培养基的平皿中，于35℃培养48h，观察菌落形态。

结果：菌落生长快，直径可达1-2cm，质地疏松，菌丝体白色，后长出淡青色孢子；

背面无色。

（2）菌体形态观察

在载玻片上加一滴无菌水，用接种针从霉菌菌落边缘处挑取少量已产孢子的霉菌菌丝，先置于50%乙醇中浸一下以吸取脱落的孢子，再放在载玻片上的无菌水中，用接种针小心的将菌丝分散开。盖上盖玻片，置低倍镜（40×）下观察，必要时换高倍镜观察。

结果：菌丝有横隔，分生孢子梗亦有横隔，粗糙，其分生孢子梗经过三次分枝，产生不对称的小梗，形如扫帚；分生孢子球形。

（3）菌株的ITS鉴定：

a.基因组DNA的提取

l)将适量孢子接种到种子培养基中,35℃、180r/min振荡培养2-3d,真空泵抽滤,每次用生理盐水冲洗,抽滤3次得到菌丝体；

2)取约5g抽滤过的菌丝体用液氮研磨成粉末状,把粉末加入到20ml抽提缓冲液中剧烈振荡混匀,用玻璃棒搅拌,37℃水浴lh,不时颠倒混匀(约5-10min混匀一次)；

3)加入等体积的苯酚/氯仿/异戊醇(25:24:l)到样品中,温和颠倒混匀。然后于4℃,12000r/min离心20min,可取上清重新抽提一次。然后加入等体积的氯仿/异戊醇(24:1),于4℃,12000r/min离心10min；

4)取上层水相至另一离心管中,加入0.1倍体积的3mol/L醋酸钠(pH4.8)及0.6体积的冰冷异戊醇,颠倒混匀,4℃放置1-2h；

5)12000r/min离心10min,弃上清,干燥沉淀;

6)加入200μlTE缓冲液溶解,可转入1.5ml离心管,再加入终浓度为0.1μg/μl的RNase,37℃反应l-3h；

7)取出,加入200μl氯仿/异戊醇(24:l)抽提1次,12000r/min离心、10min；

8)将上清转至另一个1.5ml离心管中,加入2.5倍体积的无水乙醇,-20℃放置lh以上,可见白色DNA沉淀；

9)12000r/min离心10min,收集沉淀,然后用70%乙醇洗一次；

10)待乙醇挥发完全,用适量TE或蒸馏水溶解(约50μl)。

b.PCR扩增体系（20μL，引物采用通用引物）

10×ErTaqbuffer2.0μL，2.5mMDntpMix1.6μL，上游引物（ITS1：5'-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3'）0.8μL，下游引物（ITS4：5'-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3'）0.8μL，基因组模板0.5μL，ErTaq0.2μL，ddH₂O14.1μL。

c.PCR反应条件：

95℃5min；95℃30s，55℃30s，72℃1min30s，共30cycles；72℃10min；4℃2h。

通过将ITS序列扩增后进行琼脂糖凝胶电泳，得到片段大小为600bp左右，选取最好的条带进行胶回收，将回收的DNA送至上海美吉生物医药科技有限公司测序。通过NucleotideBLAST分析，与罗尔夫青霉菌菌株的18SrRNA序列同源性为99%，可初步确定HXL菌株为罗尔夫青霉菌。

2、罗尔夫青霉HXL产酶条件优化

（1）发酵时间对产酶的影响

以产酶基础培养基接种罗尔夫青霉HXL，在温度为35℃、pH自然、装液量100ml/250ml、接种量1ml，转速180r/min的条件下分别发酵72、96、108、120、132、144、168、180、192h，取上清液测酶活。其中，产酶基础培养基为麸皮汁4%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.1%、醋酸钠0.1%、磷酸氢二钾0.2%、尿素0.2%、抗坏血酸0.1%。

（2）碳源优化

以产酶基础培养基为基础，碳源的变量为麸皮、玉米粉、可溶性淀粉、10%煮提液、麸皮+玉米粉、羧甲基纤维素钠。配制成液体培养基在恒温摇床上35℃发酵培养168h，4000rpm离心10min，取其上清液测酶活。

（3）氮源的优化

以产酶基础培养基为基础，氮源的变量为蛋白胨、黄豆粉、酵母膏、尿素、硫酸铵和硝酸钠，作为产酶基础培养基的唯一的氮源进行微生物发酵培养。在恒温摇床35℃培养168h，取出发酵液4000rpm离心10min，取其上清液测酶活。

（4）磷酸盐对产酶的影响

磷酸盐采用KH₂PO₄，为了测定对发酵的影响，设计一个空白对照和0.1%、0.2%、0.5%，加入产酶基础培养基进行发酵。取出发酵液4000rpm离心10min，取其上清液测酶活。

（5）发酵温度对产酶的影响

以产酶基础培养基接种罗尔夫青霉HXL，在pH自然、装液量100ml/250ml、接种量1ml，转速180r/min的条件分别在20、25、28、30、35、37、40℃下发酵168h，取上清液测酶活。

（6）接种量对产酶的影响

在温度为35℃、pH自然、装液量100ml/250ml、转速180r/min的条件下接种量分别为0.1ml、0.5ml、1ml、1.5ml、2.0ml的条件下发酵168h，取上清液测酶活。

结果（见图1至图6）：通过单因素实验优化检测确定罗尔夫青霉HXL发酵产酶的最佳条件条件为：发酵时间168h，接种量为1.5ml，发酵温度为35℃,最佳碳源为2%麸皮粉，最佳氮源为0.1%硫酸铵，最佳磷酸盐浓度为0.1%磷酸二氢钾。

三、利用罗尔夫青霉HXL转化发酵制备京尼平和白藜芦醇

1、制备京尼平

（1）培养基的配制

斜面培养基（查氏培养基）（100ml）：NaNO₃0.3g，MgSO₄.7H₂00.05g，FeSO₄0.001g，K₂HPO₄0.1g，KCl0.05g，蔗糖3g，琼脂2g，121℃灭菌20min；

摇瓶发酵培养基：产酶优化培养基（具体为麸皮粉2%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、抗坏血酸0.1%。），10%栀子液，pH7.0，分装到250ml的三角瓶中，121℃灭菌20min；

（2）种子制备：将保存的罗尔夫青霉HXL孢子接种于斜面培养基上，置35℃恒温培养72h，获得母斜面，选用生长正常、孢子丰富的斜面孢子加一定量的的无菌水，打散孢子后，用显微镜计数，并调节为每毫升孢子1.0×10⁸个，接入摇瓶发酵培养基；

（3）转化制备京尼平：在温度为35℃、_pH7.0、装液量为100ml/250ml、接种量为1.5%、转速180r/min的条件下发酵168h。

其中，栀子液按以下操作制备：取10g粉碎栀子按质量体积比1:10加蒸馏水煮60分钟，用纱布过滤，依法重复煮三～四次；合并滤液，最后用蒸馏水将滤液定容至100ml，得栀子煮提液。

按紫外分光光度法测定发酵液中京尼平的含量，经计算其转化率为90%。

2、制备白藜芦醇

（1）培养基的配制

斜面培养基（查氏培养基）（100ml）：NaNO₃0.3g，MgSO₄.7H₂00.05g，FeSO₄0.001g，K₂HPO₄0.1g，KCl0.05g，蔗糖3g，琼脂2g，121℃灭菌20min；

摇瓶发酵培养基：产酶优化培养基（具体为麸皮粉2%、硫酸铵0.1%、硫酸镁0.1%、磷酸氢二钾0.1%、抗坏血酸0.1%），pH7.0，分装到250ml的三角瓶中，121℃灭菌20min；

（2）种子制备：将保存的罗尔夫青霉HXL孢子接种于斜面培养基上，置35℃恒温培养3天，获得母斜面，选用生长正常、孢子丰富的斜面孢子加一定量的无菌水，打散孢子后，用显微镜计数，并调节为每毫升孢子1.0×10⁸个，接入摇瓶发酵培养基；

（3）转化制备白藜芦醇：在温度为35℃、pH7.0、装液量为100ml/250ml、接种量为1.5%、转速180r/min的条件下发酵168h，加入10%虎杖液，在温度为50℃、pH5.0的条件下反应2h

其中，虎杖液按以下操作制备：取10g虎杖按质量体积比1:10用蒸馏水浸泡20分钟，然后煮沸30分钟，冷却后用8层纱布过滤，依法重复煮三次；合并滤液，最后用蒸馏水将滤液定容至100ml，得虎杖煮提液。

按紫外分光光度法测定发酵液中白藜芦醇的含量，经计算其转化率为90%。

Claims (9)

1.一种β-葡萄糖苷酶高产菌，其特征在于保藏编号为CCTCCNO.M2013634，分类命名为罗尔夫青霉(Penicilliumrolfsii)HXL。

2.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶高产菌在转化制备京尼平中的应用。

3.利用权利要求1所述β-葡萄糖苷酶高产菌转化制备京尼平的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)种子制备：将保存的罗尔夫青霉HXL孢子接种于斜面培养基上，置于35℃恒温培养箱培养3天，获得孢子，用无菌水洗脱孢子获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接入摇瓶发酵培养基；所述斜面培养基为查氏培养基；所述摇瓶发酵培养基是在产酶优化培养基基础上加入10％的栀子液；

(2)转化制备京尼平：在温度为35℃、pH7.0、装液量为100ml/250ml、接种量为1.5％、转速180r/min的条件下发酵168h。

4.根据权利要求3所述利用β-葡萄糖苷酶高产菌转化制备京尼平的方法，其特征在于：所述栀子液按以下操作制备：取10g粉碎栀子按质量体积比1:10加蒸馏水煮60分钟，用纱布过滤，依法重复煮三～四次；合并滤液，最后用蒸馏水将滤液定容至100ml，得栀子煮提液。

5.权利要求1所述β-葡萄糖苷酶高产菌在转化制备白藜芦醇中的应用。

6.利用权利要求1所述β-葡萄糖苷酶高产菌转化制备白藜芦醇的方法，其特征在于包括以下步骤：

(1)种子制备：将保存的罗尔夫青霉HXL孢子接种于斜面培养基上，置于35℃恒温培养箱培养3天，获得孢子，用无菌水洗脱孢子获得孢子悬浮液，将孢子悬浮液接入摇瓶发酵培养基；所述斜面培养基为查氏培养基；所述摇瓶发酵培养基是产酶优化培养基；

(2)转化制备白藜芦醇：在温度为35℃、pH7.0、装液量为100ml/250ml、接种量为1.5％、转速180r/min的条件下发酵168h，加入10％虎杖液，在温度为50℃、pH5.0的条件下反应2h。

7.根据权利要求6所述利用β-葡萄糖苷酶高产菌转化制备白藜芦醇的方法，其特征在于：所述虎杖液按以下操作制备：取10g虎杖按质量体积比1:10用蒸馏水浸泡20分钟，然后煮沸30分钟，冷却后用8层纱布过滤，依法重复煮三次；合并滤液，最后用蒸馏水将滤液定容至100ml，得虎杖煮提液。

8.根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于：所述孢子悬浮液浓度为1.0×10⁸个/ml。

9.根据权利要求3或6所述的方法，其特征在于：所述产酶优化培养基配方为麸皮粉2％、硫酸铵0.1％、硫酸镁0.1％、磷酸氢二钾0.1％、抗坏血酸0.1％。