CN101861794A - 一种北冬虫夏草液体菌种的生产方法 - Google Patents

Abstract

一种北冬虫夏草液体菌种的生产方法，包括如下步骤：(1)北冬虫夏草母种接种于专用菌种培养基中进行摇瓶培养；(2)将步骤(1)培养的菌液移入装有专用菌种培养基中进行扩大培养，接种量为培养基体积的2-20％；(3)将步骤(2)培养的菌液用孔径为50-500目的筛网过滤，得滤液，其中含有大于10⁷个分生孢子/ml；(4)将步骤(3)的滤液用无菌水稀释至10⁵-10⁷个分生孢子/ml，即得北冬虫夏草液体菌种，用以接种栽培北冬虫夏草子实体。其中所述专用菌种培养基含有碳源、酵母氮源、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、琼脂。

Description

一种北冬虫夏草液体菌种的生产方法

技术领域

本发明涉及食用菌栽培菌种生产方法，特别涉及通过液体培养生产北虫草菌种的方法，也涉及这些液体培养基的成分。

背景技术

北冬虫夏草(Cordyceps militaris)，又名北虫草、蛹虫草，分类学上属子囊菌亚门(Ascomycotina)，麦角菌科(Clavicipitaceae)，虫草属(Cordyceps sp.)。北冬虫夏草具有与冬虫夏草相似的药理功效，是一种名贵的食药两用真菌，多年来一直成为国内外生物界、医药界、保健食品界等行业研究开发的重点。目前北虫草人工栽培子实体已成功。北冬虫夏草人工栽培主要利用液体菌种，这符合食用菌发展方向。

食用菌液体菌种的使用是随着食用菌工厂化生产而得到推广的。由于工厂化生产要求操作的自动化、规范化、规模化，应用液体菌种进行生产能使企业对食用菌产品的品质进行很好地控制。特别是危害分析与关键控制点技术体系(HACCP)目前已被联合国食品法典委员会采纳，国际上已将HACCP控制体系纳入到食用菌的自动化栽培之中，使得在发达国家的食用菌生产企业普遍采用液体菌种进行生产以保证产品质量。

食用菌液体菌种通常观察菌丝生长情况，多采用菌丝球大小和细胞量多少来评价菌种质量。栽培北冬虫夏草子实体用液体菌种像其他食用菌液体菌种一样，以菌丝球大小和多少来评价菌种质量，并没有考察分生孢子对栽培效果的影响(朱寿荣等.蛹虫草液体菌种培养和使用研究.安徽农业科学，2007，35(36)：11908-11909)。对于栽培北虫草，经过我们试验研究表明，液体菌种质量主要由有活力的液生分生孢子数量而定。液生分生孢子量多，则发菌快、发菌整齐、不易染杂菌、出草整齐、栽培生长期短、高产稳产。常规菌种质量评价方法难以真正描绘北冬虫夏草菌种质量。查阅有关北冬虫夏草在液体培养条件产孢的几篇文献显示，北冬虫夏草在液体培养具有与固体培养相同的产孢方式，而且液体培养孢子本身还能通过微循环、断裂等方式进行产孢。谢雪钦(谢雪钦.蛹虫草液体产孢条件优化及其侵染过程的初步研究.福建农林大学硕士学位论文，2007)报道了一系列液体培养产孢培养基，并提供了一种液体产孢条件优化的培养基，其成分及含量分别为半乳糖(40g/L)、大豆蛋白胨(14g/L)和维生素B12(200μg/L)。然而该研究没有指出所用菌种具有形成子实体的能力，而是仅以产孢能力筛选菌株及优化产孢条件；分生孢子生产方法也不是以为栽培北冬虫夏草子实体提供菌种为目的，而是以期将北冬虫夏草分生孢子开发为一种生物防治制剂；产孢最优培养基营养成分价格也较高，在生产北冬虫夏草栽培子实体菌种中不宜选用。因而还需选用栽培产子实体的北冬虫夏草菌种，优化其分生孢子生产方式和生产工艺，为栽培子实体提供优质菌种。文献调研显示未见利用北冬虫夏草分生孢子作为栽培子实体菌种的报道，更未见分生孢子与栽培效果相关性的研究。

发明内容

本发明的目的是克服现有栽培北冬虫夏草子实体所用液体菌种制备方法的不足，提出以北冬虫夏草分生孢子作为栽培子实体的菌种。

本发明的另一目的是提供一种北虫草液体发酵能产生大量分生孢子的方法。

本发明的第三个目的是提供专用菌种培养基，用以在北冬虫夏草深层发酵中产生大量分生孢子，该培养基通过多种组分混合得到，其中包括碳源、酵母氮源、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾和琼脂。该培养基利于生产高质量菌种。

本发明的技术方案为：

本发明以液生分生孢子与栽培效果相关性为评价指标，提出北冬虫夏草液体菌种的制备方法。

本发明提供一种北虫草液体菌种的制备方法，包括如下步骤：(1)将北虫草母种接种于专用菌种培养基中进行一级摇瓶培养，用于生产北冬虫夏草分生孢子，培养条件：温度15-25℃，转速0-300转/分钟，暗培养3-7天；(2)将步骤(1)摇瓶培养3-7天的菌液移入装有专用菌种培养基中进行二级扩大培养，依次可进行3-5级扩大培养，用于生产北冬虫夏草分生孢子，培养条件：温度15-25℃，转速0-300转/分钟，暗培养2-5天；(3)将步骤(2)培养2-5天的菌液用孔径为50-500目的筛网过滤，过滤除掉发酵菌液中的菌丝球、菌皮等颗粒较大的菌丝体，获得不含或少含菌丝的滤液即为北冬虫夏草液体菌种，其中含有不少于10⁷个分生孢子/mL，接种前可用无菌水稀释至10⁵-10⁷个分生孢子/mL。

上述的北冬虫夏草液体菌种的液体培养方法所涉及的专用菌种培养基，该培养基含有碳源、酵母氮源、硫酸镁、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾、琼脂，其含量分别为5-50g/L、1-20g/L、0.1-1.0g/L、0.1-1.0g/L、0.1-1.0g/L、0.5-5.0g/L。

技术效果：

本发明提出以北虫草分生孢子作为栽培子实体的菌种，克服现有栽培北虫草子实体所用液体菌种的不足，是现有技术中没有的。以分生孢子作菌种，菌种质量易于评价、控制。

本发明的北冬虫夏草液体菌种的生产方法，在通常的液体菌种生产工艺中增加了过滤步骤，即本发明技术方案中的步骤(3)是现有技术中没有的，通过该步骤可滤除发酵菌液中的菌丝球、菌皮等颗粒较大的菌丝体，获得不含或少含菌丝的发酵菌液即为北虫草液体菌种，其中含有不少于10⁷个分生孢子/mL，接种前可用无菌水稀释至10⁵-10⁷个分生孢子/mL。食用菌液体菌种通常采用菌丝球大小和细胞量多少来评价菌种质量，本发明却通过过滤去掉菌丝球，以分生孢子数量来评价菌种质量，两者不一样。

本发明的北冬虫夏草液体菌种的液体培养方法所涉及的专用菌种培养基，在通常的液体菌种培养基中添加了少量琼脂，通过添加少量琼脂促进北冬虫夏草在液体环境形成分生孢子，这是现有技术中没有的。

分生孢子丰富的北虫草液体菌种接种于固体培养基以栽培子实体，可形成大量发菌点、接种量少、发菌快、发菌整齐，子实体形成过程中不易染杂菌、出草整齐，可缩短栽培生长期、高产稳产。

栽培北冬虫夏草子实体生产中除了可直接使用北虫草液体菌种，还可以通过离心液体菌种收获分生孢子，并在35-45℃条件下烘干，粉碎得北冬虫夏草分生孢子干粉作为北冬虫夏草栽培子实体的纯孢子粉菌种。临用前再兑无菌水稀释至10⁵-10⁷个分生孢子/mL，作北虫草液体菌种。

具体实施方式

实施例1

北冬虫夏草液体菌种的制备方法，其具体步骤是：

(1)取0.5cm²北冬虫夏草母种接种于500mL三角瓶中装有100mL专用菌种培养基中进行一级摇瓶培养，培养条件：温度20℃，转速100转/分钟，暗培养。本步骤的专用菌种培养基成分及含量为：葡萄糖20g/L、酵母浸粉5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L、琼脂0.5g/L，pH自然。

(2)将步骤(1)摇瓶培养5天的菌液移入500mL三角瓶中装有100mL专用菌种培养基中进行扩大培养，接种量为5mL/瓶，用于生产北冬虫夏草分生孢子；培养条件：温度20℃，转速100转/分钟，暗培养。本步骤的专用菌种培养基成分及含量为：葡萄糖40g/L、酵母浸粉10g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L、琼脂2.0g/L，pH自然。

(3)将步骤(2)培养3天的发酵液用孔径为150目的无菌的不锈钢筛网过滤，滤除发酵液中的菌丝球等颗粒较大的固体物，得滤液，其中含有3x10⁷个分生孢子/mL。随后用无菌水稀释至5x10⁶个分生孢子/mL，即得北虫草液体菌种，用以接种栽培生产北冬虫夏草子实体。

实施例2

北冬虫夏草液体菌种的制备方法，其具体步骤是：

(1)取0.5cm²北冬虫夏草母种接种于500mL三角瓶中装有100mL专用菌种培养基中进行一级摇瓶培养，培养条件：温度25℃，转速50转/分钟，暗培养。本步骤的专用菌种培养基成分及含量为：葡萄糖20g/L、酵母浸粉5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L、KH₂PO₄ 0.3g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L、琼脂0.5g/L，pH自然。

(2)将步骤(1)摇瓶培养4天的菌液移入50L发酵罐中装有30L专用菌种培养基中进行扩大培养，，接种量为5％(v/v)，用于生产北冬虫夏草分生孢子；培养条件：温度20℃，转速80转/分钟，暗培养。本步骤的专用菌种培养基成分及含量为：蔗糖40g/L、酵母浸粉10g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L、琼脂5.0g/L，pH自然。

(3)将步骤(2)培养3天的发酵液用孔径为150目的无菌的不锈钢筛网过滤，滤除发酵液中的菌丝球等颗粒较大的固体物，得滤液，其中含有8x10⁷个分生孢子/mL。随后用无菌水稀释至10⁷个分生孢子/mL，即得北冬虫夏草液体菌种，用以接种栽培生产北冬虫夏草子实体。

实施例3

北冬虫夏草液体菌种的制备方法，其具体步骤是：

(1)取0.5cm²北冬虫夏草母种接种于500mL三角瓶中装有100mL专用菌种培养基中进行一级摇瓶培养，培养条件：温度18℃，转速20转/分钟，暗培养。本步骤的专用菌种培养基成分及含量为：葡萄糖20g/L、酵母浸粉5g/L、MgSO₄·7H₂O 0.3g/L、KH₂PO₄ 0.3g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L、琼脂0.5g/L，pH自然。

(2)将步骤(1)摇瓶培养7天的菌液移入50L发酵罐中装有30L专用菌种培养基中进行扩大培养，，接种量为3％(v/v)，用于生产北冬虫夏草分生孢子；培养条件：温度18℃，转速50转/分钟，暗培养。本步骤的专用菌种培养基成分及含量为：葡萄糖40g/L、酵母浸粉10g/L、MgSO₄·7H₂O 0.5g/L、KH₂PO₄ 0.5g/L、K₂HPO₄·3H₂O 0.5g/L、琼脂2.0g/L，pH自然。

(3)将步骤(2)培养3天的发酵液用孔径为50目的无菌的不锈钢筛网过滤，滤除发酵液中的菌丝球等颗粒较大的固体物，得滤液，其中含有10⁸个分生孢子/mL。随后用无菌水稀释至10⁷个分生孢子/mL，即得北冬虫夏草液体菌种，用以接种栽培生产北冬虫夏草子实体。

实施例4

取北冬虫夏草液体菌种。离心收获分生孢子，并在35-45℃条件下烘干，粉碎得北冬虫夏草分生孢子干粉作为北冬虫夏草栽培子实体的纯孢子粉菌种。临用前兑无菌水稀释至10⁷个分生孢子/mL，作北冬虫夏草液体菌种，用以接种栽培生产北冬虫夏草子实体。

实施例5

取含10⁷个分生孢子/mL的北冬虫夏草液体菌种，用以接种栽培生产北冬虫夏草子实体。北冬虫夏草子实体栽培培养基为大米培养基，每100平方厘米大米培养基接种5mL。接种后置于25℃条件下发菌，发菌约6天可取出转至出草室出草。利用本发明的北冬虫夏草液体菌种可形成大量发菌点、发菌快、发菌整齐，出草整齐，栽培生长期短，子实体产量高。

Claims (7)

1.一种北冬虫夏草液体菌种的生产方法，包括如下步骤：

(1)将北冬虫夏草固体母种接种于专用菌种培养基中进行一级摇瓶培养，培养条件：温度15-25℃，转速0-300转/分钟，暗培养3-7天；

(2)将步骤(1)培养的菌液移入装有专用菌种培养基中进行二级扩大培养，接种量为培养基体积的2-20％，用于生产北冬虫夏草分生孢子，培养条件：温度15-25℃，转速0-300转/分钟，暗培养2-5天；依次可进行多级扩大培养；

(3)将步骤(2)培养的菌液用孔径为50-500目的筛网过滤，得滤液，其中含有分生孢子；

(4)将步骤(3)的滤液用无菌水稀释至10⁵-10⁷个分生孢子/mL，即得北冬虫夏草液体菌种，用以接种栽培生产北虫草子实体。

2.根据权利要求1所述的北冬虫夏草液体菌种的生产方法所涉及的专用菌种培养基，其特征在于所述培养基的组分中含有琼脂。

3.根据权利要求1所述的北冬虫夏草液体菌种的生产方法所涉及的专用菌种培养基，其特征在于所述培养基的组分中还含有碳源，包括葡萄糖、蔗糖或它们的混合物。

4.根据权利要求1所述的北冬虫夏草液体菌种的生产方法所涉及的专用菌种培养基，其特征在于所述培养基的组分中还含有酵母氮源，包括酵母浸粉、酵母浸膏、酵母粉或它们的混合物。

5.根据权利要求1所述的北冬虫夏草液体菌种的生产方法所涉及的专用菌种培养基，其特征在于所述培养基的组分中还含有MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄和K₂HPO₄·3H₂O。

6.根据权利要求1、3、4和5所述的北冬虫夏草液体菌种的生产方法所涉及的专用菌种培养基，其特征在于所述培养基中碳源、酵母氮源、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄和K₂HPO₄·3H₂O、琼脂的含量分别为5-50g/L、1-20g/L、0.1-1.0g/L、0.1-1.0g/L、0.1-1.0g/L、0.1-5g/L，其余为水。

7.根据权利要求1、2、3、4和5所述的北冬虫夏草液体菌种的生产方法所涉及的专用菌种培养基，其特征在于所述培养基中葡萄糖、酵母浸粉、MgSO₄·7H₂O、KH₂PO₄、K₂HPO₄·3H₂O、琼脂的含量分别为30g/L、8g/L、0.5g/L、0.5g/L、0.5g/L、2.0g/L，其余为水。