CN107955794B - 蛹虫草菌种的优质保藏方法 - Google Patents

蛹虫草菌种的优质保藏方法 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种蛹虫草菌种的优质保藏方法，该方法是将蛹虫草菌种以菌悬液或菌丝块的形式，在4℃‑25℃条件下进行保藏，保藏期可达12个月以上。本发明通过优化蛹虫草菌种保藏形式、保护剂类型、温度范围及时间周期等保藏条件，提高了蛹虫草的菌种质量及稳定性，为菌种保藏及人工栽培等提供技术保障。

Description

蛹虫草菌种的优质保藏方法
技术领域
本发明涉及微生物菌种保藏方法，具体地说，涉及蛹虫草菌种的优质保藏方法。
背景技术
虫草的应用最早起源中国，其作为珍贵中药材和食用真菌资源被广泛利用。蛹虫草(Cordyceps militaris)又名北虫草、北冬虫夏草等，属于子囊菌门、肉座菌目、虫草菌科、虫草属真菌，是一种食药用虫草。蛹虫草无性型是蛹虫草拟青霉，无性型在单饱子菌株水平上，菌落特征、有性子实体形成能力、产孢结构等方面差异较大。蛹虫草寄生于鳞翅目等昆虫蛹体或幼虫且发育形成子实体。蛹虫草主要分布于辽宁、吉林、云南、新疆、内蒙古、广东、四川等地，但因其特殊的生长环境要求，造成野生蛹虫草的产量十分有限，严重制约虫草产业发展。蛹虫草富含虫草素、虫草酸及喷司他丁等具有抗癌、抗菌、抗疲劳及提高免疫等多种生物活性成分，其药用价值与冬虫夏草相似，有些成分甚至优于传统的冬虫夏草，因而已广泛作为冬虫夏草的替代品应用于药用及食用菌领域。随着现代人们生活水平的提高，对虫草产品的药用及保健等价值认识的不断深入，对蛹虫草资源及产品等需求也日益增加。
蛹虫草的生物学特性、人工培养技术等开发利用研究已经广泛开展。但是，由于过度人工采挖，导致蛹虫草野生资源严重匮乏；而在人工规模化生产过程中，也经常出现因菌种遗传背景不清而引起菌种退化和变异严重等现象，造成子实体畸形、产量减少及品质下降等问题，制约着虫草产业的发展与升级。微生物菌种保藏主要是通过延缓菌种的新陈代谢等，避免继代培养过程中的菌种变异和污染，甚至死亡等问题的发生，保障菌种具有正常及稳定的生长特性及活力。
目前蛹虫草菌种保藏中存在的主要问题是：保藏周期较短(3-6个月)，易污染(液体或石蜡油保藏出现易污染及菌种死亡现象)，菌种质量评估时间长(一般需通过子实体诱导形成加以评估，时间长达3-4个月)，菌种活力低(随着保藏时间延长，子实体形成能力降低甚至无法形成子实体，易出现退化型菌株)，诱导子实体稳定性差且品质降低(随着保藏时间，子实体易出现弯曲且细长，并无法形成子囊壳等)。因此，通过现代生物技术手段提高蛹虫草的菌种质量显得尤为重要。优质的保藏方法为蛹虫草的规模化生产提供技术保障，为虫草资源的持续开发利用等奠定良好的基础。
发明内容
本发明主要针对蛹虫草菌种保藏领域的技术空白，提供一种蛹虫草菌种的优质保藏方法。
为了实现本发明目的，本发明提供的蛹虫草菌种的优质保藏方法，蛹虫草菌种是以菌悬液或菌丝块的形式，在4℃-25℃(优选4℃)条件下进行保藏。
前述的保藏方法，还包括向菌悬液或菌丝块中加入适量保护剂的步骤，其中所述保护剂为0.06g/mL蛋白胨溶液。
以菌丝块形式进行菌种保藏，具体如下：
方案I：将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基平板上，于23℃-25℃暗培养3-5天，然后50-100lx条件下光培养18-20天，取菌丝块置于无菌离心管中，盖紧盖子，于4℃-25℃保藏。
优选地，将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基平板上，于23℃暗培养3天，然后100lx条件下光培养20天，取菌丝块置于无菌离心管中，盖紧盖子，于4℃保藏。
方案II：将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基平板上，于23℃℃-25℃暗培养3-5天，然后50-100lx条件下光培养18-20天，取3mm×3mm菌丝块置于无菌离心管中，然后向离心管中加入0.06g/mL蛋白胨溶液200-500μL，盖紧盖子，于4℃-25℃保藏。
优选地，将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基平板上，于23℃℃暗培养3天，然后100lx条件下光培养20天，取3mm×3mm菌丝块置于无菌离心管中，然后向离心管中加入0.06g/mL蛋白胨溶液300μL，盖紧盖子，于4℃保藏。
以菌悬液形式进行菌种保藏，具体如下：
方案III：将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基平板上，于23℃℃-25℃暗培养3-5天，然后50-100lx条件下光培养18-20天；将蛹虫草菌丝及孢子接种至改良PDA液体培养基中，于23℃℃-25℃100-250rpm摇床培养3-5天，待菌悬液中菌丝球含量达2000个以上/100mL，将菌悬液分装至无菌离心管中，盖紧盖子，于4℃-25℃保藏。
优选地，将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基平板上，于23℃℃暗培养3天，然后100lx条件下光培养20天；将蛹虫草菌丝及孢子接种至改良PDA液体培养基中，于23℃℃150rpm摇床培养3天，待菌悬液中菌丝球含量达2000个以上/100mL，将菌悬液分装至无菌离心管中，盖紧盖子，于4℃保藏。
方案IV：将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基平板上，于23℃℃-25℃暗培养3-5天，然后50-100lx条件下光培养18-20天；将蛹虫草菌丝及孢子接种至改良PDA液体培养基中，于23℃℃-25℃100-250rpm摇床培养3-5天，待菌悬液中菌丝球含量达2000个以上/100mL，将菌悬液分装至无菌离心管中，然后向离心管中加入0.06g/mL蛋白胨溶液200-500μL，盖紧盖子，于4℃-25℃保藏。
优选地，将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基平板上，于23℃℃暗培养3天，然后100lx条件下光培养20天；将蛹虫草菌丝及孢子接种至改良PDA液体培养基中，于23℃℃150rpm摇床培养3天，待菌悬液中菌丝球含量达2000个以上/100mL，将菌悬液分装至无菌离心管中，然后向离心管中加入0.06g/mL蛋白胨溶液300μL，盖紧盖子，于4℃保藏。
本发明中，所述改良PDA培养基(改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基)平板的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，七水硫酸镁(MgSO4·7H2O)1g，复合维生素B25mg，琼脂16g，补足水至1000mL。
所述改良PDA液体培养基是指在上述平板培养基配方的基础上，不添加琼脂。
本发明的蛹虫草菌种保藏方法适合于虫草属中各种不同蛹虫草菌种的长期稳定保存，保藏期可达12个月以上。
本发明通过优化蛹虫草菌种保藏形式、保护剂类型、温度范围及时间周期等保藏条件，提高了蛹虫草的菌种质量及稳定性，为菌种保藏及人工栽培等提供技术保障。具体优点如下：
(一)本发明的蛹虫草菌种保藏方法，延长保藏周期2倍以上(保藏期达12个月以上)。
(二)可有效避免常规液体保藏出现的污染及菌种死亡现象。
(三)首次建立菌丝球形成与分生孢子产生能力的综合评估体系，缩短常规菌种质量评估时间。
(四)提高菌种活力，子实体诱导能力与菌种保藏初期基本一致，无退化型菌株出现。
(五)子实体生物量不因保藏时间延长而减少，子座粗壮且子囊壳饱满丰富。
(六)本发明提供的蛹虫草菌种保藏方法具有操作简单，保藏成本低廉，但保藏效果稳定的特点。
附图说明
图1为蛹虫草菌种摇培指数分级情况；其中，G0，培养基清澈，无明显菌丝体或菌丝球；G1，培养基清澈，菌丝体可见(菌丝球密度较低，10～100个/瓶)；G2，培养基清澈，菌丝体可见(菌丝球密度低，100～300个/瓶)；G3，培养基略浑浊，菌丝体可见(菌丝球密度一般，300～1000个/瓶)；G4，培养基浑浊，菌丝体密集(菌丝球密度较高，1000～3000个/瓶)；G5，培养基呈小米粥状，菌丝体密集(菌丝球密度最高，3000个以上/瓶)。
图2为蛹虫草菌种摇培后分生孢子的产生与定量情况；其中，A和B，高浓度孢子分散及对应浓度(106个孢子/mL)；C和D，中浓度孢子分散及对应浓度(105个孢子/mL)；E和F，低浓度孢子分散及对应浓度(104个孢子/mL)。
图3为本发明实施例1中蛹虫草菌丝块保藏方法摇培性状。
图4为本发明实施例1中蛹虫草菌丝块保藏方法分生孢子的产生情况。
图5为本发明实施例2中蛹虫草菌悬液保藏方法摇培性状。
图6为本发明实施例2中蛹虫草菌悬液保藏方法分生孢子的产生情况。
图7为本发明实施例3中不同保藏周期形成的子实体情况；其中，蛹虫草菌种未添加(control)或添加保护剂蛋白胨溶液，在4℃℃或室温下保藏。
图8为本发明实施例3中蛹虫草子实体形成与子囊发育情况；其中，A，蛹虫草子实体健壮且浓密；B，子囊壳丰富且饱满；C，蛹虫草子实体粗壮但矮小；D，子囊壳密度减少；E，蛹虫草子实体纤弱，部分产生畸形；F，子囊壳稀疏且不饱满。
图3-图6中，蛹虫草菌种经冷冻干燥(lyophilization)或未处理(normal)后，未添加(control)或添加保护剂(高压灭菌脱脂牛奶(UHT)、巴氏杀菌脱脂牛奶(pasteurized)及蛋白胨溶液)，在不同温度环境(4℃℃、室温、–20℃及–80℃)下保藏。
具体实施方式
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。若未特别指明，实施例中所用的技术手段为本领域技术人员所熟知的常规手段，所用原料均为市售商品。
以下实施例中实验菌株为蛹虫草标准菌株编号CM125，分离自蛹虫草子实体，由沈阳农业大学真菌学研究室提供，菌种编号MCN26602。参见梁月,张国珍,安沫平等.蛹虫草子囊孢子萌发及其后代群体培养性状观察[J].菌物学报,2005,24:525-532.
以下实施例中使用的子实体诱导培养基配方为：10g大米(粉末)与10mL改良PDA液体培养基混合后，高压灭菌。
实施例1蛹虫草菌种保藏方法优化—菌丝块法
1.材料与方法
1.1菌丝块制备
将蛹虫草菌丝体接种至改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在23℃环境下，黑暗条件培养3天，后见光培养20天(光照强度100lx)。用无菌解剖刀切成3mm×3mm菌丝块，置于无菌1.5mL离心管中备用。
1.2保护剂种类
蛋白胨溶液：以水配制，浓度0.06g/mL，121℃℃，高压蒸汽灭菌20分钟；
巴氏杀菌脱脂牛奶：德国进口牛奶(市购爱氏晨曦牌)；
高压灭菌脱脂牛奶：上述脱脂牛奶，121℃℃，高压蒸汽灭菌5分钟。
1.3保藏条件
将切好的菌丝块置于1.5ml实验级离心管中，并分别加入300μL保护剂(蛋白胨溶液、巴氏杀菌脱脂牛奶及高压灭菌脱脂牛奶)，充分震荡使保护液完全包裹菌丝块，封口膜密封管口并放置在室温、4℃、–20℃及–80℃下，静置24小时。随后，部分样品冷冻干燥24小时，而常规(非冻干)处理则保留原培养条件静置24小时。分别将常规及冻干处理样品中加入500μL无菌水，震荡后倒入改良马铃薯葡萄糖液体培养基中，23℃，150rpm震荡培养3天，观察菌丝体(菌丝球)及分生孢子形成情况，评估不同处理对菌种保藏影响。每个处理设置3个重复。
1.4保藏条件评估
蛹虫草人工培养及规模化生产中，通常采用将菌种液体培养后，将菌种悬浮液稀释后接种在子实体诱导培养基方法进行生产。因此，保藏后菌种液体培养的性状(菌丝球形成)及分生孢子产生情况，可以作为保藏条件筛选的重要依据之一。上述保藏条件处理后的菌种进行液体培养，分析摇培性状指数(图1)及分生孢子产生数量(图2)，评估不同处理条件对菌种保藏的影响。
摇培指数分级如图1所示，菌种摇培性状指数分为6个等级：G0，培养基清澈，无明显菌丝体或菌丝球；G1，培养基清澈，菌丝体可见(菌丝球密度较低，10～100个/瓶)；G2，培养基清澈，菌丝体可见(菌丝球密度低，100～300个/瓶)；G3，培养基略浑浊，菌丝体可见(菌丝球密度一般，300～1000个/瓶)；G4，培养基浑浊，菌丝体密集(菌丝球密度较高，1000～3000个/瓶)；G5，培养基呈小米粥状，菌丝体密集(菌丝球密度最高，3000个以上/瓶)。
分生孢子产生情况如图2所示，其中A和B，高浓度孢子分散及对应浓度(106个孢子/mL)；C和D，中浓度孢子分散及对应浓度(105个孢子/mL)；E和F，低浓度孢子分散及对应浓度(104个孢子/mL)。
2.结果与分析
通过对不同保藏条件结果评估发现，菌种在不同处理条件下，摇培后菌丝球形成及分生孢子产生的能力具有明显差异。结果表明，尽管菌种冷冻干燥处理是微生物常用保藏方法，但此方法明显不适用于蛹虫草菌种菌丝块法保藏。冷冻干燥方法不但影响摇培性状(菌丝球的形成)，而且也降低分生孢子的产生(图3和4)。不同保藏温度也影响菌种保藏质量，尽管(超)低温保藏被普遍作为菌种保藏的环境温度条件，但蛹虫草在4℃℃或室温条件下保藏效果较好，而–20℃℃和–80℃℃均不适于蛹虫草的菌种保藏。此外，保护剂的添加对菌种摇培性状也存在差异，其中脱脂牛奶尽管作为菌种保藏的常规保护剂，但其摇培性状不甚理想；而蛋白胨或不添加保护剂处理下摇培性状及孢子产生效果较好。综合分析，蛹虫草菌种适宜采用菌丝块保藏方式，在4℃℃或室温条件下，无保护剂或添加少量蛋白胨作为保护剂的保藏效果最为理想。
实施例2蛹虫草保藏方法优化—菌悬液法
1.材料与方法
1.1菌悬液制备
将蛹虫草菌丝体接种至改良马铃薯葡萄糖琼脂培养基上，在23℃℃环境下，黑暗条件培养3天，后见光培养20天(光照强度100lx)。用无菌接种针将蛹虫草的菌丝及孢子接种至改良马铃薯葡萄糖液体培养基中，置于23℃℃，以150rpm摇菌培养3天，至菌悬液中菌丝球含量达2000个以上/100mL。摇菌结束后，将菌悬液分装至无菌1.5mL离心管中备用。
1.2保护剂种类
蛋白胨溶液：以水配制，浓度0.06g/mL，121℃℃高压蒸汽灭菌20分钟；
巴氏杀菌脱脂牛奶：德国进口牛奶(市购爱氏晨曦牌)；
高压灭菌脱脂牛奶：上述脱脂牛奶，121℃℃高压蒸汽灭菌5分钟。
1.3保藏方法
将装有菌悬液的离心管中分别加入300μL保护剂(蛋白胨溶液、巴氏杀菌脱脂牛奶及高压灭菌脱脂牛奶)，震荡使保护液与菌悬液完全混合，封口膜密封后放置在室温、4℃℃、–20℃及–80℃下，静置24h后。随后，部分样品冷冻干燥24小时，而常规(非冻干)处理则保留原培养条件静置24小时。分别将常规及冻干处理样品中加入500μL无菌水，震荡后倒入改良马铃薯葡萄糖液体培养基中，23℃℃，150rpm震荡培养3天，观察菌丝体(菌丝球)及分生孢子形成情况，评估不同处理对菌种保藏影响。每个处理设置3个重复。
1.4保藏条件评估
蛹虫草人工培养及规模化生产中，通常采用将菌种液体培养后，将菌种悬浮液稀释后接种在子实体诱导培养基方法进行生产。因此，保藏后菌种液体培养的性状(菌丝球形成)及分生孢子产生情况，可以作为保藏条件筛选的重要依据之一。上述保藏条件处理后的菌种进行液体培养，分析摇培性状指数(图1)及分生孢子产生数量(图2)，评估不同处理条件对菌种保藏的影响。
2.实验结果
通过对不同保藏条件结果评估发现，菌种在不同处理条件下，摇培后菌丝球形成及分生孢子产生的能力具有明显差异。结果表明，尽管菌种冷冻干燥处理是微生物常用保藏方法，但此方法明显不适用于蛹虫草菌种菌悬液法保藏。冷冻干燥方法不但影响摇培性状(菌丝球的形成)，而且也降低分生孢子的产生(图5和6)。不同保藏温度也影响菌种保藏质量，尽管(超)低温保藏被普遍作为菌种保藏的环境温度条件，但蛹虫草在4℃℃或室温条件下保藏效果较好，而–20℃℃和–80℃℃均不适于蛹虫草的菌种保藏。此外，保护剂的添加对菌种摇培性状也存在差异，其中脱脂牛奶尽管作为菌种保藏的常规保护剂，但其摇培性状不甚理想；而蛋白胨或不添加保护剂处理下摇培性状。综合分析，蛹虫草菌种可以采用菌悬液保藏方式，但菌丝块保藏方式更佳，同时宜在4℃℃或室温条件下，无保护剂或添加少量蛋白胨作为保护剂的保藏效果最为理想。
实施例3蛹虫草保藏方法优化—保藏周期的优化
根据实例1和2筛选的优化保藏方案，对优选的菌种保藏方法及保藏周期做进一步研究。蛹虫草保藏方法优化—保藏周期如下：
1.材料与方法
1.1菌丝块制备
将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基上，在23℃环境下，黑暗条件培养3天，后见光培养20天(光照强度100lx)。用无菌解剖刀切成3mm×3mm菌丝块，放置于无菌1.5mL离心管中备用。
1.2保护溶液配制
蛋白胨溶液：以水配制，浓度0.06％，121℃℃高压蒸汽灭菌20分钟；
1.3保藏周期的优化方法
在放置菌丝块的离心管中加入少量保护液(蛋白胨溶液)或不加任何保护溶液，充分震荡使保护液完全包裹菌丝块，封口膜密封严实。分别放置在4℃℃和室温(23～25℃℃)下，分别静置保藏1周、2周、1月、3月(其中，在明确优选的保藏条件下，进一步保藏菌种6月和12月)。待达到预定保藏时间后，加入500μL无菌水，，震荡后倒入改良马铃薯葡萄糖液体培养基中，23℃，150rpm震荡培养3天，稀释后接种至子实体诱导培养基中，每种处理设置2个重复。光照条件下23℃培养，40天后观察并评估诱导形成的新鲜子实体产量(生物量)。
2.实验结果
通过对优化的菌种保藏方案及保藏周期进一步研究发现，不同保藏方法对保藏周期及子实体的形成和生物量影响不同。结果表明，保藏环境4℃形成的子实体总体生物量优于室温条件(图7)。在无保护剂添加处理下诱导产生的子实体生物量略优于保护剂添加处理。例如，4℃下保藏周期30天的菌种，所形成的子实体生长健壮且着生的子囊壳丰富且饱满(图8A和B)；而室温下所形成的子实体高度降低，并导致其生物量下降且子囊壳数量减少(图8C和D)；部分添加蛋白胨保护剂处理的菌种保藏后，易造成子实体体矮小纤弱甚至畸形，生物量低且其上着生的子囊壳稀疏不饱满(图8E和F)。另外，室温下无论添加保护剂与否，菌种保藏90天后均无法成功形成子实体。因此，蛹虫草菌种建议在4℃℃冷藏环境条件下保藏(或可添加少量蛋白胨作为保护剂)，其保藏周期至少12个月或更长；而在无冷藏条件下，菌种也可以在室温下短期保藏及常温运输，但保藏周期不建议超过30天。
以上结果表明，在不同温度下对两种保藏菌种形式及保护剂添加方法等进行筛选，优化保藏条件并得出以下结论：蛹虫草菌种建议以菌丝块作为保藏形式，同时也克服了传统液体培养过程中易污染且不宜操作的缺点；菌种不宜做常规冷冻干燥处理；保藏环境建议冷藏或室温；不添加或添加少量保护剂(如蛋白胨溶液)均优于常规保护剂(脱脂牛奶)；在适宜温度环境下，保藏周期可达12个月或以上，形成的子实体质量及生物量较高。通过筛选的蛹虫草菌种优质保藏方法，可以保障蛹虫菌种的稳定性及其子实体形成质量和产量。
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之做一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

Claims (4)

1.蛹虫草菌种的优质保藏方法，其特征在于，以菌丝块形式进行菌种保藏，具体如下：将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基平板上，于23℃-25℃暗培养3-5天，然后50-100lx条件下光培养18-20天，取3mm×3mm菌丝块置于1.5mL无菌离心管中，盖紧盖子，于4℃保藏；
所述改良PDA培养基的配方为：马铃薯200g，葡萄糖20g，蛋白胨3g，磷酸二氢钾2g，七水硫酸镁1g，复合维生素B 25mg，琼脂16g，补足水至1000mL。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基平板上，于23℃暗培养3天，然后100lx条件下光培养20天，取3mm×3mm菌丝块置于1.5mL无菌离心管中，盖紧盖子，于4℃保藏。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基平板上，于23℃-25℃暗培养3-5天，然后50-100lx条件下光培养18-20天，取3mm×3mm菌丝块置于1.5mL无菌离心管中，然后向离心管中加入0.06g/mL蛋白胨溶液200-500μL，盖紧盖子，于4℃保藏。
4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，将蛹虫草菌丝体接种至改良PDA培养基平板上，于23℃暗培养3天，然后100lx条件下光培养20天，取3mm×3mm菌丝块置于1.5mL无菌离心管中，然后向离心管中加入0.06g/mL蛋白胨溶液200-500μL，盖紧盖子，于4℃保藏。
CN201711205421.8A 2017-11-27 2017-11-27 蛹虫草菌种的优质保藏方法 Active CN107955794B (zh)

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