CN113980824B - 一种哈茨木霉菌剂稳定剂及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种哈茨木霉菌剂稳定剂，属于微生物保存技术领域。所述稳定剂为甘油单乙酸酯，所述哈茨木霉菌剂稳定剂的应用方法为：在哈茨木霉菌固态发酵的第4‑5天时加入，加入量不小于哈茨木霉孢子液质量的0.8％。本发明稳定剂性价比高，可用于维持哈茨木霉菌剂的活性及长效稳定，减少哈茨木霉菌剂在贮藏过程中的破坏。

Description

一种哈茨木霉菌剂稳定剂及其应用

技术领域

本发明涉及微生物保存技术领域，尤其是涉及一种哈茨木霉菌剂稳定剂及其应用。

背景技术

生物农药包括生物化学农药和微生物农药，其中微生物农药是以生物活体(真菌、细菌、昆虫病毒和天敌或基因修饰的微生物)或者其代谢物为有效成分的农药，常常以微生物菌剂的形式应用。哈茨木霉(Trichoderma harzianum)是木霉属的一种生防菌，对引起植物病害的腐霉菌、立枯丝核菌、镰刀菌、灰葡萄孢菌、黑根霉和柱孢霉等病原菌都具有杀灭作用，是一种高效的生物防治因子。同时，哈茨木霉具有产孢量大、植物亲和力强、抗逆性强、安全性高等优点，是木霉生防菌中的头号选手，也是市场上83％的木霉杀菌剂产品的活性成分。

目前，哈茨木霉菌剂存在质量不稳定和货架期短等问题。市面上出售的哈茨木霉菌剂在低温下保存的有效期在6个月到2年之间，保存成本较高，保存时间较短，且随着保存时间的增加，哈茨木霉菌剂的效用逐渐下降，这也是导致哈茨木霉菌剂质量不稳定的因素之一。因此，开发哈茨木霉菌剂的稳定剂，提升哈茨木霉菌剂的保存期，不管对于哈茨木霉菌剂生产成本的降低，还是对提升哈茨木霉菌剂的质量稳定性都具有重要的价值和意义。

发明内容

针对现有技术存在的上述问题，本发明提供了一种哈茨木霉菌剂稳定剂及其应用。本发明稳定剂性价比高，可用于维持哈茨木霉菌剂的活性及长效稳定，减少哈茨木霉菌剂在贮藏过程中的破坏。

本发明的技术方案如下：

一种哈茨木霉菌剂稳定剂，所述稳定剂为甘油单乙酸酯。

所述哈茨木霉菌剂稳定剂的应用方法为：在哈茨木霉菌固态发酵的第4-5天时加入，加入量不小于哈茨木霉孢子液质量的0.8％。

优选的，所述稳定剂加入量为哈茨木霉孢子液质量的0.8-1.2％。

进一步地，所述哈茨木霉菌固态发酵的培养基组成为：麸皮和玉米粉质量比为3:1，固料比水为1:0.4g/mL，蔗糖1.5％，蛋白胨1.5％，硝酸铵1％，磷酸二氢钾0.05％，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄ 0.5％～0.50％。

优选的，所述哈茨木霉菌固态发酵时，温度为25-32℃，湿度为75-85％。

进一步地，所述哈茨木霉孢子液的制备方法为：

S1：将哈茨木霉菌株挑取于装有10mL PDB培养基的三角瓶中，封口膜扎好瓶口，在26-32℃、180-250rpm搅拌下培养2-4d；

S2：取部分培养好的菌液加入20％的甘油保存于负80℃冰箱，取剩余菌液划线置于PDA斜面培养基，在26-32℃、湿度75-85％的条件下培养4-6d；

S3：用无菌水将PDA斜面培养基上的孢子洗下，做成孢子液，利用血球计数板在显微镜下统计孢子数，将孢子液稀释至浓度为0.8-1.2×10⁶个·mL^-1。

进一步地，所述PDA培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，pH 7.0。

进一步地，所述PDB培养基组成为：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL，pH7.0。

本发明有益的技术效果在于：

本发明技术简单，效果明显，性价比高，加入稳定剂后，哈茨木霉菌后保存18个月仍旧能维持90％的有效活菌数，同时具有很好的抑菌活性。

附图说明

图1为哈茨木霉的照片。

图2为光学显微下的哈茨木霉。

图3为哈茨木霉18SrDNA系统进化分析。

具体实施方式

下面结合附图和实施例，对本发明进行具体描述。显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

本发明实施例中如无特殊说明所用方法均为常规方法，所用试剂均可从商业途径获得。其中，PDA培养基组成：马铃薯200g、葡萄糖20g、琼脂15g、蒸馏水1000mL，pH 7.0。

PDB培养基组成：马铃薯200g、葡萄糖20g、蒸馏水1000mL，pH 7.0。

哈茨木霉菌的固态发酵培养基组成：麸皮:玉米粉按3:1，固料比水为1:0.4g/mL，蔗糖1.5％，蛋白胨1.5％，硝酸铵1％，磷酸二氢钾0.05％，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄为0.5％～0.50％。

实施例1：哈茨木霉的分离培养

将马铃薯去皮洗净，切成小块。称取切好的马铃薯200g，加入适量的水煮20-30分钟至马铃薯可被玻璃棒戳破即可。用8层纱布过滤，取滤液加入15g琼脂，加热煮至琼脂融化。加入葡萄糖20g，搅拌溶解均匀，稍微冷却后加水补至1000mL，于115℃灭菌20min。在超净工作台中将灭好的培养基分装至一次性无菌平皿中，冷却凝固后储存于4℃冰箱备用。

取市售的哈茨木霉产品10mg于500μL的无菌水，在摇床中28℃，200rpm充分震荡培养30min。取上层液体，用无菌水按10、100、1000、10000倍进行梯度稀释，将各稀释梯度液体在超净工作台中涂布在PDA培养平皿上，28℃，湿度80％，培养2-4d。长出菌落后，在超净工作台中用无菌白枪头挑取单菌落接种于新的PDA培养平皿，28℃，培养2-4d。重复挑取单菌落接种于新的PDA培养平皿，直至挑取的单菌落在PDA培养平皿上长出单一的菌落。

实施例2：哈茨木霉的鉴定

外观形态和显微鉴定：根据文献报道的哈茨木霉外观形态对分离到的菌种进行鉴定，结果如图1和图2所示。分离到的菌株在PDA培养平皿上生长，初期菌丝呈绒毛状或白絮状，白色，有明显的同心圆环状产孢区；后期菌丝颜色变为淡绿色并由淡绿色逐渐变为暗绿色。外观形态上与文献报道的哈茨木霉的外观形态一致。取少量菌丝于光学显微镜下观察，菌丝纤细无色，具分隔，多分枝。分生孢子梗从菌丝的侧枝上生出，对生或互生，一般有2-3次分枝，与文献报道的哈茨木霉显微形态一致。

分子鉴定：用Ezup柱式真菌基因组DNA抽提试剂盒提取分离到的菌株的DNA，取20mg的菌丝于1.5mL的离心管中。加入200μL的Buffer Digestion和2μL的β-巯基乙醇，再加入20μL的Proteinase K溶液，震荡混匀。56℃水浴1h。

加入100μL的Buffer PF，充分颠倒混匀，-20℃冰箱放置5min。至细胞完全裂解。室温10,000rpm离心5min，将上清转移到新的1.5mL的离心管中。加入200μL的Buffer BD，充分颠倒混匀。加入200μL的无水乙醇，充分颠倒混匀。

将吸附柱放入收集管中，用移液器将溶液和半透明纤维状悬浮物全部加入吸附柱中，静置2min，再10,000rpm室温离心1min，倒掉收集管中的废液。将吸附柱放回收集管，加入500μL的PW Solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。

将吸附柱放回收集管，加入500μL的Wash Solution，10,000rpm离心30s倒掉收集管中的废液。将吸附柱重新放回收集管中，于12,000rpm室温离心2min，离去残留的WashSolution。取出吸附柱，放入一个新的1.5mL的离心管中，加入50μL的TE Buffer静置3min，12,000rpm室温离心2min，收集DNA溶液。提取的DNA可立即进行下一步实验或-20℃保存。

18SrDNA扩增：扩增引物NS1 GTAGTCATATGCTTGTCTC

NS4 CTTCCGTCAATTCCTTTAAG

PCR体系：

PCR扩增程序：

PCR反应完成后，取5μL的PCR产物加入1μL的6×DNA Loading buffer，混匀，1％的琼脂糖凝胶电泳检测后(180V，10min)，凝胶成像仪上观察是否有目的条带。有条带的剩余产物送生工生物工程(上海)股份有限公司测序。测序结果如图3所示，经过NCBI网站进行Blast分析比对，及通过系统进化树分析，鉴定分离到的菌株为哈茨木霉。

实施例3：哈茨木霉的固态培养

将鉴定为哈茨木霉的菌株在超净台中用无菌的白枪头挑取于装有10mL PDB培养基的250mL三角瓶中，封口膜扎好瓶口，28℃，200rpm培养2-4d。在超净台中取部分培养好的菌液加入20％的甘油保存于负80℃冰箱。取剩余菌液划线于PDA斜面培养基，28℃，湿度80％，培养4-6d。在超净台中，用无菌水将PDA斜面培养基上的孢子洗下，做成孢子液，利用血球计数板在显微镜下统计孢子数，将孢子液稀释至浓度为1×10⁶个·mL^-1。

配制固态发酵培养基，称取麸皮93.75g，玉米粉31.25g，加水50mL，加蔗糖1.5％，蛋白胨1.5％，硝酸铵1％，磷酸二氢钾0.05％，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄ 0.5％，于250mL的三角瓶中，扎上封口膜，121℃，灭菌30min。冷却后，在超净台中接种1mL的哈茨木霉孢子液，28℃，湿度80％，培养6d。培养结束后，35℃真空干燥8-12h后，取1g的固态发酵培养物，按《GB20287-2006农用微生物菌剂》中所述方法，测定活菌数为2.5亿/g。

实施例4：未添加稳定剂时的菌种稳定性测试

取实施例3中的干燥后的固体培养物，常温保存3个月后，按《GB20287-2006农用微生物菌剂》中所述方法，测定活菌数量，有效活菌数为2.3亿/g。常温保存6个月后，按实施例3的方法，测定活菌数量，有效活菌数为1.9亿/g。常温保存12个月后，按实施例3的方法，测定活菌数量，有效活菌数为1.4亿/g。常温保存18个月后，按实施例3的方法，测定活菌数量，有效活菌数为0.8亿/g。可见，该产品稳定性欠佳，因此，有必要开发相应的稳定剂。

实施例5：稳定剂的筛选

配制固态发酵培养基，称取麸皮93.75g，玉米粉31.25g，加水50mL，加蔗糖1.5％，蛋白胨1.5％，硝酸铵1％，磷酸二氢钾0.05％，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄ 0.5％。于250mL的三角瓶中，扎上封口膜，121℃，灭菌30min。冷却后，在超净台中接种1mL的哈茨木霉孢子液，28℃，湿度80％，培养6d。培养结束后，分别加入1％海藻糖、葡聚糖、低聚果胶、高聚果胶、甘油单乙酸酯、葡萄糖、果糖，35℃真空干燥8-12h后，45℃保存7d、14d、21d，按《GB20287-2006农用微生物菌剂》中所述方法，测定活菌数，具体结果如表1所示：

表1(单位：亿)

从表1的结果可以看到，甘油单乙酸酯对哈茨木霉菌具有一定的保护作用。

实施例6：稳定剂的加入时间研究

配制固态发酵培养基，称取麸皮93.75g，玉米粉31.25g，加水50mL，加蔗糖1.5％，蛋白胨1.5％，硝酸铵1％，磷酸二氢钾0.05％，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄ 0.5％于250mL的三角瓶中，扎上封口膜，121℃，灭菌30min。冷却后，在超净台中接种1mL的哈茨木霉孢子液，28℃，湿度80％，分别在0d、1d、2d、3d、4d、5d、6d时加入1％甘油单乙酸酯，总计培养6d。干燥后，45℃保存7d、14d、21d，按《GB20287-2006农用微生物菌剂》中所述方法，测定活菌数，具体结果如表2所示：

表2(单位：亿)

从表2的数据可以看到，在发酵第4-5d时加入稳定剂，可最大程度保护活菌数。

实施例7：稳定剂的加入量研究

配制固态发酵培养基，称取麸皮93.75g，玉米粉31.25g，加水50mL，加蔗糖1.5％，蛋白胨1.5％，硝酸铵1％，磷酸二氢钾0.05％，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄ 0.5％于250mL的三角瓶中，扎上封口膜，121℃，灭菌30min。冷却后，在超净台中接种1mL的哈茨木霉孢子液，28℃，湿度80％，在5d时加入甘油单乙酸酯，分别加入0、0.2％、0.4％、0.6％、0.8％、1％、1.2％，总计培养6d。干燥后，45℃保存7d、14d、21d，按《GB20287-2006农用微生物菌剂》中所述方法，测定活菌数，具体结果如表3所示：

表3(单位：亿)

从表3的数据可以看到，甘油单乙酸酯加入量为0.8％以上时，可最大限度稳定产品。

尽管本发明的实施方案已公开如上，但其并不仅仅限于说明书和实施方式中所列运用，它完全可以被适用于各种适合本发明的领域，对于熟悉本领域的人员而言，对于本领域的普通技术人员而言，在不脱离本发明的原理和精神的情况下可以对这些实施例进行多种变化、修改、替换和变型，因此在不背离权利要求及等同范围所限定的一般概念下，本发明并不限于特定的细节。

Claims (7)

1.一种哈茨木霉菌剂稳定剂的应用，其特征在于，所述稳定剂为甘油单乙酸酯，用于维持哈茨木霉菌剂的活性及长效稳定；所述稳定剂在哈茨木霉菌固态发酵的第4-5天时加入，加入量不小于哈茨木霉孢子液质量的0.8%。

2.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述稳定剂加入量为哈茨木霉孢子液质量的0.8-1.2%。

3.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述哈茨木霉菌固态发酵的培养基组成为：麸皮和玉米粉质量比为3:1，固料比水为1:0.4 g/mL，蔗糖1.5%，蛋白胨1.5%，硝酸铵1%，磷酸二氢钾0.05%，NaH₂PO₄-Na₂HPO₄ 0.5%-0.50%。

4.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述哈茨木霉菌固态发酵时，温度为25-32℃，湿度为75-85%。

5.根据权利要求1所述的应用，其特征在于，所述哈茨木霉孢子液的制备方法为：

S1：将哈茨木霉菌株挑取于装有10 mL PDB培养基的三角瓶中，封口膜扎好瓶口，在26-32 ℃、180-250 rpm搅拌下培养2-4 d；

S2：取部分培养好的菌液加入20 %的甘油保存于负80 ℃冰箱，取剩余菌液划线置于PDA斜面培养基，在26-32 ℃、湿度75-85 %的条件下培养4-6 d；

S3：用无菌水将PDA斜面培养基上的孢子洗下，做成孢子液，利用血球计数板在显微镜下统计孢子数，将孢子液稀释至浓度为0.8-1.2×10⁶ 个·mL^-1。

6.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PDA培养基组成为：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、琼脂15g、蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

7.根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述PDB培养基组成为：马铃薯200 g、葡萄糖20 g、蒸馏水1000 mL，pH 7.0。

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