CN109055248A - 一种生防酵母菌活性冻干粉及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种生防酵母菌活性冻干粉及其制备方法，属于生物防治技术领域；本发明所述的冻干粉中包括季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35‑1、海藻糖、谷胱甘肽；本发明首先取活化后的季也蒙毕赤酵母菌接入NYDB种子培养基培养，再取种子液接入NYTB发酵培养基中发酵；将酵母菌发酵液离心并用无菌水清洗后，所得沉淀用无菌水洗下并制成酵母菌悬液；添加海藻糖及谷胱甘肽作为冻干保护剂后混匀分装在平板中，真空冷冻干燥得到冻干粉；本发明提供的生防酵母菌活性冻干粉的生防效果良好，活性冻干粉复水后的酵母菌悬液处理，油桃果实发病率、果实病斑直径均明显低于对照组，且与之存在显著性差异，可见冻干粉制剂复水后能有效抑制油桃果实的炭疽病腐烂病害。
Description
技术领域
本发明涉及一种生防酵母菌活性冻干粉及其制备方法，属于生物防治技术领域。
背景技术
油桃果实因皮薄，且成熟和采摘在高温高湿的初夏季节，所以在采摘、运销、贮藏过程中极易受到机械损伤和微生物侵害而发生腐烂变质，故造成的经济损失巨大。炭疽病是造成多种果实采后运销和贮藏过程中易发生的主要病害之一，其病原微生物主要是胶孢炭疽菌（Colletotrichum gloeosporioides）和尖孢炭疽菌（Colletotrichum acutatum）两种。一直以来，对果实病害的控制主要依赖于化学杀菌剂，但随着人们对食品安全和环境保护意识的加强，已更多限制了化学杀菌剂的使用，因此，需要探寻新的更安全、有效的防治方法。
近年来，生物防治已经成为各国关于果蔬采后病害防治的研究热点。其中拮抗酵母菌因为具有遗传稳定、营养要求简单、抑菌谱广、生长快速等特点，以及在多种胁迫环境和逆境下的较强耐受力、对多数化学杀菌剂不敏感、能与一些化学或物理方法结合使用的优点，使其被认定为可作为一种有效代替化学杀菌剂的方法，并应用在水果采后病害的控制方面。新型生防菌剂必须保证成品中有较高数量的活菌，因此需要好的活细胞制剂生产工艺。真空冷冻干燥技术因在低温低压下进行，既能抑制某些细菌的生长，避免杂菌污染，又能使热敏性成分保留下来，而且干制品含水量低，贮藏期长。真空冷冻干燥微生物制品存活率高，且复水性好，现已越来越多的应用于生物制品的干燥过程中。但是能应用于有效控制油桃在采摘、运销、贮藏过程中发生的炭疽病害和腐烂现象的生防菌剂目前报道不多，且防治效率不高。
发明内容
本发明的目的在于提供一种生防酵母菌活性冻干粉及其制备方法，以期应用于有效控制油桃在采摘、运销、贮藏过程中发生的炭疽病害和腐烂现象。
本发明首先提供一种季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35-1，已于2016年12月5日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏地址:中国武汉武汉大学，保藏编号为CCTCC NO: M2016719，见附图1。
本发明还提供一种生防酵母菌活性冻干粉，所述冻干粉包括：1×106 ~1×109CFU/mL的季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35-1、2.5~10wt%的海藻糖、0.05~0.2wt%的谷胱甘肽。
优选的，本发明所述的生防酵母菌活性冻干粉包括：1×108CFU/mL季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35-1、5wt%海藻糖、0. 2wt%谷胱甘肽。
本发明还提供一种生防酵母菌活性冻干粉的制备方法，所述方法具体操作如下：
（1）生防酵母菌的富集：将活化后的季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35-1挑取两环接种于NYDB种子培养基（50mL/250mL）中，在28℃、200r/min条件下培养24h；取100μL种子液接入NYTB发酵培养基（50mL/250mL）中，在28℃、200r/min条件下培养48h；
（2）生防酵母菌悬液的制备：将酵母菌发酵液置于离心杯中，3000rpm下离心10min，倒掉上清液，用无菌水清洗两次，所得沉淀用无菌水洗下并制成酵母菌悬液，备用；
（3）添加冻干保护剂：先将海藻糖配成所需浓度的2倍（即5~20 wt %）的溶液，在121℃下灭菌处理20min，使混合后样品中海藻糖的浓度为2.5~10 wt %，即与酵母菌悬液按等体积比例混合（使海藻糖浓度为2.5%~10 wt）%，再添加谷胱甘肽使终浓度为0.05~0.2wt %；
（4）分装：将添加了保护剂的酵母菌悬液混合均匀后倒入直径9cm的平板中，使厚度约为0.5cm；
（5）预冷冻：将分装好的平板用保鲜膜封口，迅速放入-80℃恒温冰箱中，预冷冻3h；
（6）真空冷冻干燥：将预冷冻完成的平板迅速转移到预冷至-30℃以下的冷冻干燥机中，打开真空泵，冷冻干燥机冷阱温度为-50℃，抽真空冷冻干燥36h；
（7）密封保存：冷冻干燥完成的平板迅速转移到超净工作台内，用保鲜膜和封口膜进行密封；得到生防酵母菌活性冻干粉，保存。
本发明在保护剂中同时辅助添加谷胱甘肽和海藻糖，经海藻糖诱导培养和冻干保护的酵母菌的活性有明显提高，试验结果表明，冻干前酵母菌液（对照）及冻干制剂的酵母菌细胞存活率均近100%，冻干后对照酵母菌存活率仅为43.5%，而用5%的海藻糖及0.2%的谷胱甘肽作为保护剂，冻干后酵母菌存活率为85.2%。该生防酵母活性冻干粉复水活化后，适用于油桃的采后炭疽病害防治和贮藏保鲜。
本发明的有益效果描述如下：
本发明通过筛选，结果显示海藻糖和谷胱甘肽作为保护剂，冻干粉酵母菌存活率最高，为85.25。离心是菌体细胞收集的首选方法，离心速度太低或时间太短，部分菌体会留在上清液中而造成损失，但离心速度快或时间过长则会导致细胞死亡。在本发明的制备方法中进行了离心参数的选择，由酵母菌存活率最高确定3000rpm下离心10min是制备的离心技术参数。
按照本发明提供的制备方法制备的生防酵母菌活性冻干粉，在复水活化后，添加有海藻糖及谷胱甘肽作为冻干保护剂能够显著提高冻干粉剂中Y35-1酵母菌细胞的存活率，说明相比较于无添加保护剂的制备方法，该制备方法能有效提高冻干后酵母菌的生活力；
本发明提供的生防酵母菌活性冻干粉的适宜贮存条件为-20℃。在-20℃存放的Y35-1冻干粉的存活率相比较于25℃和5℃时最高，虽然随着贮藏天数的增加，存活率有所下降，但是下降幅度小，在存放4个月时，存活率仍然高于50%，而且在相同贮藏天数时，添加保护剂的酵母细胞存活率明显高于对照组。
本发明提供的生防酵母菌活性冻干粉的生防效果良好，活性冻干粉复水后的酵母菌悬液处理，油桃果实发病率、果实病斑直径均明显低于对照组，且与之存在显著性差异，可见冻干粉制剂复水后能有效抑制油桃果实的炭疽病腐烂病害。
附图说明
图1是季也蒙毕赤酵母菌株Y35-1的细胞形态与菌落形态。
图2是酵母菌PCR电泳结果（a）及系统发育树（b）构建结果；图中，M为DL2000 PlusDNA Marker，1为菌株Y35-1的PCR产物。
图3是本发明实施例提供的生防酵母菌活性冻干粉在25℃、5℃、-20℃下存放的酵母菌细胞存活率统计结果。
具体实施方式
通过借助以下实施实例将更加详细的说明本发明。此处所描述的具体实施实例仅具有说明性，本发明并不受这些实施实例的限制。
实施例1：菌株的分离及鉴定
季也蒙毕赤酵母Y35-1（Pichia guilliermondii）是本实验室筛选得到的，已于2016年12月5日保存于中国典型培养物保藏中心（地址：中国武汉，武汉大学；保藏编号为CCTCCNO: M2016719）。
菌种筛选及鉴定过程主要步骤如下：
拮抗酵母菌的分离：从镇江市高桥镇农业生态果园采集成熟健康枇杷果实，在完整果实表面分离筛选菌株，挑选培养特征各异的酵母单菌落在NYDA平板上进行分离纯化，挑取各个单菌落进行低温保藏。
拮抗酵母菌悬液制备：将培养的酵母菌重悬浮成为菌悬液，用血球计数板计算酵母菌悬液的浓度，用无菌蒸馏水调整菌悬液至所需浓度，备用。
通过体内和体外的多次筛选，最终得到一株具有抑菌作用且活性强的拮抗酵母菌株，并对该菌株进行种属的鉴定。
拮抗酵母菌的体外筛选：挑选培养板中挑选抑菌效果良好，即具有生防潜力的酵母菌株挑选出来再做体内筛选。
拮抗酵母菌的体内筛选：根据果实的腐烂情况，挑选出具有抑菌作用的酵母菌株，并将抑菌效果最好的酵母菌株进行种属鉴定。
拮抗酵母菌株的形态学及生理生化指标的鉴定方法包括：细胞形态学鉴定、群体形态培养特征鉴定、子囊孢子的鉴定、假菌丝的形成及鉴定、掷孢子的形成及鉴定以及糖发酵试验、碳源同化试验、氮源同化试验。结果显示：Y35-1菌株在麦芽汁液体培养基中培养后镜检观察细胞形态呈椭圆形到圆形，细胞无性繁殖：一端或两端芽殖，如图1所示。在28℃NYDA培养基培养3d，菌落呈圆形，边缘整齐，表面光滑，微隆起，不透明乳黄色，易挑起，有芳香味，如图1所示。发酵供试糖类结果为Y35-1菌株可以发酵葡萄糖、蔗糖、棉籽糖和海藻糖，不能够发酵麦芽糖和乳糖。对供试碳源和氮源的同化结果为：Y35-1菌株可以同化D-葡萄糖、D-半乳糖、蔗糖、L-阿拉伯糖、纤维二塘、棉籽糖、麦芽糖、海藻糖、D-山梨醇、蜜二糖、D-木糖、丙三醇、松三糖、D-甘露糖，不能同化赤藻糖醇和乳糖；Y35-1菌株可以同化(NH4)2SO4，不能同化KNO3和KNO2。
拮抗酵母菌株的分子特征鉴定包括：模板为采用反复冻融法提取的酵母菌DNA，采用通用引物为ITS1（5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’）和ITS4（5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’），对DNA模板进行PCR扩增。反应程序为：94℃预变性5min；94℃30s变性，55℃30s退火，72℃1min延伸，35个循环；72℃10min延伸；4℃保温。通过琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增出长度约560bp的rDNA-ITS序列。
图2显示，PCR扩增出大约长度为560bp的rDNA-ITS序列。PCR扩增产物经切胶回收后，送生物公司测序，测定的核苷酸序列结果如SEQ.ID.NO.1所示。将所得的序列采用Neighbor-Joining法进行分析系统学分析，构建系统发育树。图2显示，系统发育树亲缘关系分析确定菌株Y35-1与Pichia guilliermondii strain W1171处于同一分支。
根据以上鉴定结果进行种属归类鉴定，酵母菌株Y35-1被鉴定为季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）。
SEQ.ID.NO.1：
CCAGCGCTTAACTGCGCGGCGAaAACCTTACACACAGTGTCTTTTTGATACAGAACTCTTGCTTTGGTTTGGCCTAGAGATAGGTTGGGCCAGAGGTTTAACAAAACACAATTTAATTATTTTTACAGTTAGTCAAATTTTGAATTAATCTTCAAAACTTTCAACAACGGATCTCTTGGTTCTCGCATCGATGAAGAACGCAGCGAAATGCGATAAGTAATATGAATTGCAGATTTTCGTGAATCATCGAATCTTTGAACGCACATTGCGCCCTCTGGTATTCCAGAGGGCATGCCTGTTTGAGCGTCATTTCTCTCTCAAACCCCCGGGTTTGGTATTGAGTGATACTCTTAGTCGGACTAGGCGTTTGCTTGAAAAGTATTGGCATGGGTAGTACTAGATAGTGCTGTCGACCTCTCAATGTATTAGGTTTATCCAACTCGTTGAATGGTGTGGCGGGATATTTCTGGTATTGTTGGCCCGGCCTTACAACAACCAAACAAGTTTGACCTCAAATCAGGTAGGAATACCCGCTGAACTTAAGCATATCAATAAGCGGAGGAA
实施例2：生防酵母菌活性冻干粉的制备
对酵母菌进行富集培养：首先进行酵母菌菌种活化，将深冻酵母菌水浴解冻，接入NYDB液体培养基中，28℃,200r/min摇瓶培养24-48h，重复培养一次。然后，将活化后的生防酵母菌取两环接种于NYDB种子培养基（50ml/250ml）中，在28℃、200r/min条件下培养24h；取100μl种子液接入NYTB发酵培养基（50ml/250ml）中，在28℃、200r/min条件下培养48h；其中NYDB培养基中包括牛肉浸膏8g、酵母浸膏5g、葡萄糖10g、蒸馏水1000ml，自然pH；NYTB培养基中包括牛肉浸膏8g、酵母浸膏5g、海藻糖10g、蒸馏水1000ml，自然pH；
其中所述的常规NYDB种子培养基中包括牛肉浸膏8g、酵母浸膏5g、葡萄糖10g、蒸馏水1000ml，自然pH；NYTB发酵培养基中包括牛肉浸膏8g、酵母浸膏5g、海藻糖10g、蒸馏水1000ml，自然pH。
生防酵母菌悬液的制备：将酵母菌发酵液置于离心杯中，3000rpm下离心10min，倒掉上清液，用无菌水清洗两次，所得沉淀用无菌水洗下并制成酵母菌悬液，备用；
关于离心参数的选择：离心前采用稀释涂布法测定50 mL酵母菌悬液中酵母菌细胞的数量。然后按照设计的离心参数（分别于2000、3000、5000的rpm转速各离心10、20min）收集同一酵母菌悬液中的酵母菌细胞，重悬于50 mL 0.85%无菌生理盐水中，并采用稀释涂布法计数。根据公式（酵母菌存活率 = 离心前酵母菌细胞数 / 离心后酵母菌细胞数×100%）计算酵母菌细胞的存活率。通过比较不同离心参数下酵母菌细胞的存活率来确定最佳离心条件。最终选择3000rpm下离心10min（其离心收获率最高，为85.50%，其它均低于75%）为适用的离心条件。
（5）添加冻干保护剂：选用海藻糖及谷胱甘肽作为保护剂；先将海藻糖配成所需浓度的2倍（即5~20 wt %），在121℃下灭菌处理20min，然后与酵母菌悬液按等体积比例混合（2.5%~10 wt %），再添加谷胱甘肽使终浓度为0.05~0.2 wt%；
（6）分装：将添加了保护剂的酵母菌悬液混合均匀后倒入直径9cm的平板中，使厚度约为0.5cm；
（7）预冷冻：将分装好的平板用保鲜膜封口，迅速放入-80℃恒温冰箱中，预冷冻3h；
（8）真空冷冻干燥：将预冷冻完成的平板迅速转移到预冷至-30℃以下的冷冻干燥机中，打开真空泵，冷冻干燥机冷阱温度为-50℃，抽真空冷冻干燥36h；
（9）密封保存：冷冻干燥完成的平板迅速转移到超净工作台内，用保鲜膜和封口膜进行密封；将冻干粉均分为3组，分别在-20℃、5℃、25℃条件下保存。
实施例3：冻干粉中各添加成分对效果的影响
本实施例对各成分不同添加量的效果进行了验证，具体的方法如下：
冻干保护剂的筛选：各保护剂的浓度筛选如表1所示，对季也蒙毕赤酵母菌保护结果如表2所示。将添加各冻干保护剂的酵母菌悬液混合均匀，取1ml样品进行梯度稀释涂布，涂布后平板于28℃恒温培养箱中培养48h确定活菌数。当海藻糖浓度为5wt%时，季也蒙毕赤酵母Y35-1细胞存活达到最高值，为25.6%；浓度为2.5wt%和10wt%时，存活率分别为15.5%和12.0%，因此选择5wt%海藻糖为优化保护剂。
表1 冻干粉保护剂类型和浓度
表2部分浓度的保护剂对酵母菌冻干存活率的影响
甘油可以在延缓脱水过程和减少胞内冰晶的破坏，当甘油浓度为5wt%时酵母菌存活率最大，但仅有11.5%，比之对照不明显，因此不选用甘油做保护剂。
谷胱甘肽起到还原抗逆的保护作用，其在0.05 wt %、0.1 wt %、0.2wt%浓度时的酵母菌存活率分别为13.6%、18.5%、25.5%，因此选择0.2wt%谷胱甘肽为优化后选择的冻干粉抗逆保护剂。
脱脂乳粉蛋白质类可以在冻干过程起到支撑细胞结构和减小蛋白质变性的作用，与未添加保护剂的对照组及其它种类保护剂相比，脱脂乳粉提高酵母菌冻干存活率的效果最好，在浓度为5wt%时酵母存活率达到50.6%。但由于其粘度大，易粘附灰尘和病原菌，且使用过程中颜色附着影响果实感官评价，因此不用其作为保护剂。
选取冻干效果好的两种单一保护剂（海藻糖和谷胱甘肽）进行复配，进一步验证酵母菌的冻干存活率。分别用2.5 wt %（计为A1，下同）、5 wt %（A2）海藻糖和0.1 wt %（B1）、0.2 wt %（B2）谷胱甘肽各一份组合，结果显示，最佳组合为A2B2，冻干后酵母菌存活率为85.2%，高于单一保护剂和其它复配的酵母菌存活率。因此，选定保护剂复配的最佳组合为5wt%海藻糖和0.2wt%谷胱甘肽。
先将海藻糖配成所需浓度的2倍（即5-20 wt %），在121℃下灭菌处理20min，然后与酵母菌悬液按体积比例混合（2.5%~10 wt %），再添加最终浓度为0.05~0.2wt%的谷胱甘肽。冻干剂制备方法如上述方法。
进一步的，对本发明的生防酵母菌活性冻干粉的活性测定，包括两部分测定内容：
一是生防酵母菌活性冻干粉冻干前后的存活率：冻干前活菌数的测定：在预冷之前，将添加了冻干保护剂的菌悬液混合均匀，留取1mL样品进行梯度稀释后进行涂布，涂布后的平板放进28℃恒温培养箱中倒置培养48h后确定活菌数；冻干后活菌数的测定：用无菌水重新悬浮至冷冻干燥前的体积，梯度稀释涂布后，平板放进28℃恒温培养箱中倒置培养48h后确定活菌数；计算存活率：存活率（%）=冻干粉活菌数/冻干前活菌数×100。不添加冻干保护剂的酵母菌活性冻干粉为对照。
结果显示，冻干前，两者的酵母菌细胞存活率均接近100%，冻干后，添加了以上冻干保护剂时能够显著提高冻干粉剂中酵母菌细胞的存活率（冻干后85.2%），远高于对照43.5%。说明保护添加剂对Y35-1酵母菌细胞在冻干过程中起到了保护作用，且该制备方法能有效提高冻干后酵母菌的生活力。
二是生防酵母菌活性冻干粉贮藏期间活性的测定：每隔1个月称取一定量（0.01g）的冻干粉，用2ml无菌水充分溶解，使其复水，然后放入37℃水浴锅中活化0.5h，活化后的样品梯度稀释涂布，然后将平板放进28℃恒温培养箱中倒置培养48h后计数活菌数，计算每克冻干粉中活菌数。不添加冻干保护剂的酵母菌活性冻干粉为对照。结果如图3所示。
从图3可以看出，在25℃、5℃、-20℃下存放的Y35-1酵母菌活性冻干粉剂随着贮藏天数的增加，酵母菌存活率虽有所下降，但在制备过程中添加海藻糖及谷胱甘肽能够对贮藏期间Y35-1酵母菌细胞起到一定的保护作用；且-20℃下存放的Y35-1冻干粉的酵母菌存活率较高（68.5%/4个月，高于对照27.5%/4个月），表明此种活性冻干粉剂更适宜存放在-20℃的条件下。
实施例4：生防酵母菌活性冻干粉应用于采后油桃的生防效果测定
首先，用灭菌打孔器在油桃果实（0.1%NaClO消毒后水清洗并室温晾干）赤道上打小孔（深度3mm、直径5mm）。将制备完成的冻干粉剂用无菌蒸馏水溶解并混合均匀，用血球计数板计数并调整至1×109cfu/ml，吸取10μl调整好的菌悬液接种于油桃伤口处，2h后接入5×104spores/ml的胶孢炭疽菌孢子悬浮液10μl于果实伤口处。无菌水处理为空白对照。其中，胶孢炭疽菌（由中国林业微生物菌种保藏管理中心提供，病原真菌在实验室的4℃PDA试管斜面上保藏）孢子悬浮液的制备：在PDA平板上活化，培养7d。用接种环在此培养板上刮去适量孢子，并接入无菌蒸馏水中，悬浮均匀后用血球计数板计数，用无菌蒸馏水调至所需浓度备用。
然后，将油桃果实放于保鲜膜密封的塑料筐中，25℃、RH95%的恒温培养箱中贮藏。每隔5天观察油桃果实的发病率并测定病斑直径。每处理组至少30个果实样品，试验重复两次。
由表3可以看出，Y35-1酵母菌活性冻干粉剂处理的油桃果实炭疽病发病率（17.85%）、果实病斑直径（0.55cm）均明显低于对照组（100%、3.2cm），且与之存在显著性差异。结果显示Y35-1酵母菌活性冻干粉剂能够有效保留拮抗酵母菌的细胞活力及生防效力，冻干粉制剂复水后能有效抑制油桃果实的炭疽病腐烂病害。
表3季也蒙毕赤酵母菌Y35-1冻干粉制剂对油桃果实病原菌的生防效力（21天）
注：结果以平均值±标准误的形式列出；根据邓肯氏新复极差法，不同字母表示各处理间存在显著性差异（p<0.05）
按照本发明中的制备方法制备的生防酵母菌活性冻干粉，经复水活化，酵母菌细胞能保持较高的生防效力，为以后应用在油桃等果实贮藏方面提供了参考。
序列表
<110> 江苏大学
<120> 一种生防酵母菌活性冻干粉及其制备方法
<160> 3
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 564
<212> DNA
<213> 季也蒙毕赤酵母菌(Pichia guilliermondii)
<400> 1
ccagcgctta actgcgcggc gaaaacctta cacacagtgt ctttttgata cagaactctt 60
gctttggttt ggcctagaga taggttgggc cagaggttta acaaaacaca atttaattat 120
ttttacagtt agtcaaattt tgaattaatc ttcaaaactt tcaacaacgg atctcttggt 180
tctcgcatcg atgaagaacg cagcgaaatg cgataagtaa tatgaattgc agattttcgt 240
gaatcatcga atctttgaac gcacattgcg ccctctggta ttccagaggg catgcctgtt 300
tgagcgtcat ttctctctca aacccccggg tttggtattg agtgatactc ttagtcggac 360
taggcgtttg cttgaaaagt attggcatgg gtagtactag atagtgctgt cgacctctca 420
atgtattagg tttatccaac tcgttgaatg gtgtggcggg atatttctgg tattgttggc 480
ccggccttac aacaaccaaa caagtttgac ctcaaatcag gtaggaatac ccgctgaact 540
taagcatatc aataagcgga ggaa 564
<210> 2
<211> 19
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tccgtaggtg aacctgcgg 19
<210> 3
<211> 20
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
tcctccgctt attgatatgc 20
Claims (10)
1.一种防治果实炭疽病的季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35-1，于2016年12月5日保存于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO: M2016719。
2. 一种生防酵母菌活性冻干粉，所述冻干粉包括：1×106 ~1×109CFU/mL的季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35-1、2.5~10 wt %的海藻糖、0.05~0.2 wt %的谷胱甘肽。
3. 一种生防酵母菌活性冻干粉，所述冻干粉包括：1×106 ~1×109CFU/mL的季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35-1、5 wt %的海藻糖、0.2 wt %的谷胱甘肽。
4.权利要求2或3所述的冻干粉在果实炭疽病的防治中的应用。
5.权利要求1所述的一种生防酵母菌活性冻干粉的制备方法，其特征在于，所述制备方法如下：
（1）生防酵母菌的富集：将活化后的季也蒙毕赤酵母（Pichia guilliermondii）Y35-1接种于NYDB种子培养基中，培养得到种子液；取种子液接入NYTB发酵培养基中，培养得到酵母菌发酵液；
（2）生防酵母菌悬液的制备：将酵母菌发酵液置于离心杯中，离心，倒掉上清液，用无菌水清洗，所得沉淀用无菌水洗下并制成酵母菌悬液，备用；
（3）添加冻干保护剂：取配制好的海藻糖溶液，在121℃下灭菌处理20min，与酵母菌悬液按等体积比例混合，使混合后样品中海藻糖的浓度为2.5~10 wt%，再添加谷胱甘肽使终浓度为0.05~0.2wt %；
（4）分装：将添加了保护剂的酵母菌悬液混合均匀后倒入平板中；
（5）预冷冻：将分装好的平板用保鲜膜封口，迅速放入恒温冰箱中预冷冻；
（6）真空冷冻干燥：将预冷冻完成的平板迅速转移到冷冻干燥机中；
（7）密封保存：冷冻干燥完成的平板迅速转移到超净工作台内，用保鲜膜和封口膜进行密封；得到生防酵母菌活性冻干粉，保存。
6. 根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述酵母菌悬液浓度为1×106 ~1×109CFU/mL。
7.根据权利要求6所述的制备方法，其特征在于，步骤（2）中所述酵母菌悬液浓度为1×108CFU/mL。
8.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（3）中所述混合后样品中海藻糖的浓度为5wt%，再添加谷胱甘肽使得终浓度为0.2wt%。
9.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（5）中所述的预冷冻时间为3h。
10.根据权利要求5所述的制备方法，其特征在于，步骤（6）中所述冷冻干燥机冷阱温度为-50℃，抽真空冷冻干燥36h，预冷至-30℃以下。
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